动物细胞融合与单克隆抗体 (5)讲稿.ppt

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1、关于动物细胞融合与单克隆抗体(5)第一页，讲稿共四十一页哦 2002年年12月月30日，日，两场筹备了两场筹备了10年的年的“太空太空婚礼婚礼”首次在神舟四号飞船上举行，首次在神舟四号飞船上举行，植物细胞植物细胞“新新人人”黄花烟草黄花烟草和和革新一号烟草革新一号烟草叶肉细胞叶肉细胞原生质体原生质体，动物细胞动物细胞“新人新人”是小鼠是小鼠B淋巴细胞淋巴细胞和和骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞，两批新人同时在两批新人同时在“产房产房”电融合仪内孕育新生命。电融合仪内孕育新生命。“太空婚礼太空婚礼”植物体细胞杂交技术植物体细胞杂交技术动物细胞融合技术动物细胞融合技术第二页，讲稿共四十一页哦(1)(1)(2)

2、(3)(4)(5)植物体细胞杂交过程示意图第三页，讲稿共四十一页哦A细胞细胞B细胞细胞人工诱导人工诱导1.11.1动物动物细胞融合的概念细胞融合的概念杂交细胞杂交细胞 动物细胞融合（也称细胞杂动物细胞融合（也称细胞杂交）：是指交）：是指两个或多个细胞两个或多个细胞融合融合形成一个形成一个单核细胞单核细胞的过程。的过程。一、动物细胞融合一、动物细胞融合第四页，讲稿共四十一页哦阅读课本阅读课本P52P52及识图及识图2-232-23，第五页，讲稿共四十一页哦细胞膜的流动性细胞膜的流动性灭活病毒、灭活病毒、PEGPEG、电激等、电激等融合后的细胞进行有丝分裂，融合后的细胞进行有丝分裂，形成完整的杂交

3、细胞形成完整的杂交细胞诱导的手段？诱导的手段？融合后细胞的类型？融合后细胞的类型？ABAB杂种细胞遗传物质杂种细胞遗传物质有什么特点？有什么特点？三种三种AAAA、ABAB、BBBB（A A、B B）含两种生物的遗传物质含两种生物的遗传物质1.21.2动物细胞融合过程动物细胞融合过程原理？原理？第六页，讲稿共四十一页哦1.21.2动物细胞融合过程动物细胞融合过程 为什么灭活的病为什么灭活的病毒能作诱导剂毒能作诱导剂？灭活灭活使病毒的感染活性、使病毒的感染活性、增殖能力丧失但不破坏病增殖能力丧失但不破坏病毒的抗原结构。毒的抗原结构。第七页，讲稿共四十一页哦想一想想一想1动物细胞融合完成的标志是什

4、么？动物细胞融合完成的标志是什么？【提示提示】细胞核融合。细胞核融合。第八页，讲稿共四十一页哦1.31.3动物动物细胞融合技术的意义和应用细胞融合技术的意义和应用第九页，讲稿共四十一页哦比较项比较项目目细胞融合细胞融合的原理的原理细胞融合的细胞融合的方法方法诱导手段诱导手段用途用途植物体植物体细胞杂细胞杂交交细胞膜的细胞膜的流动性流动性纤维素酶、纤维素酶、果胶酶果胶酶去除去除细胞壁后诱细胞壁后诱导原生质体导原生质体融合融合离心、电刺离心、电刺激、振动、激、振动、聚乙二醇聚乙二醇克服远源克服远源杂交不亲杂交不亲和，获得和，获得杂种植株杂种植株动物细动物细胞融合胞融合细胞膜的细胞膜的流动性流动性用

5、用胰蛋白酶胰蛋白酶使细胞分散使细胞分散后诱导细胞后诱导细胞融合融合除应用植物除应用植物细胞杂交手细胞杂交手段外，段外，还有还有灭活病毒灭活病毒获得杂种获得杂种细胞、细胞、制备制备单克隆抗单克隆抗体体1.4 1.4 比较动、植物细胞杂交技术比较动、植物细胞杂交技术第十页，讲稿共四十一页哦【例例1】能使动物细胞融合的特有的诱导因子是能使动物细胞融合的特有的诱导因子是（）A.离心离心 B.灭活的病毒灭活的病毒 C.电刺激电刺激 D.振动振动【例例2】融合后的杂交细胞的遗传物质有何特点（融合后的杂交细胞的遗传物质有何特点（）具有原来两个或多个细胞的遗传信息具有原来两个或多个细胞的遗传信息 B.能无限增

6、殖能无限增殖 C.可形成新个体可形成新个体 D.培养过程会贴壁培养过程会贴壁【例例3】动物细胞融合的作用中最重要的是（动物细胞融合的作用中最重要的是（）A.克服远源杂交不亲和克服远源杂交不亲和 B.制备单克隆抗体制备单克隆抗体 C.培育新物种培育新物种 D.生产杂种细胞生产杂种细胞 BBA第十一页，讲稿共四十一页哦互动探究互动探究(1)本题中细胞融合手段不同于植物体细胞杂交的是本题中细胞融合手段不同于植物体细胞杂交的是什么？什么？(2)本题中培养液中融合处理后的细胞类型最多有几本题中培养液中融合处理后的细胞类型最多有几种？分别是什么细胞？种？分别是什么细胞？提示提示】(1)动物细胞融合的手段与

7、植物体细胞杂交的区别是动物细胞融合的手段与植物体细胞杂交的区别是前者通常采用灭活的病毒作为诱导剂。前者通常采用灭活的病毒作为诱导剂。(2)细胞类型通常有细胞类型通常有5种，即鼠种，即鼠鼠、人鼠、人人、人人、人鼠、人、鼠单鼠、人、鼠单独的细胞。独的细胞。第十二页，讲稿共四十一页哦【易误警示易误警示】(1)常用的病毒诱导剂有仙台病常用的病毒诱导剂有仙台病毒、新城鸡瘟病毒、疱疹病毒等，其中仙台病毒毒、新城鸡瘟病毒、疱疹病毒等，其中仙台病毒最常用。最常用。(2)用做诱导剂的病毒必须事先灭活，使病毒的用做诱导剂的病毒必须事先灭活，使病毒的感染活性、增殖能力丧失但不破坏病毒的抗原感染活性、增殖能力丧失但不

8、破坏病毒的抗原结构。结构。第十三页，讲稿共四十一页哦抗体：能够与抗原发生特异抗体：能够与抗原发生特异性结合的性结合的免疫球蛋白免疫球蛋白。能产生抗体的细胞是能产生抗体的细胞是浆细胞浆细胞（即效应（即效应B细胞）。细胞）。二、单克隆抗体二、单克隆抗体第十四页，讲稿共四十一页哦抗体的传统生产方法抗体的传统生产方法抗原抗原 反复注射动物反复注射动物从动物的从动物的血清血清中分离抗体中分离抗体该法制备抗体的缺点：该法制备抗体的缺点：产量低、纯度低，且抗体的产量低、纯度低，且抗体的特异性差、灵敏度低。特异性差、灵敏度低。第十五页，讲稿共四十一页哦提示提示1 1：对：对B B细胞进行细胞培养可行吗？细胞进

9、行细胞培养可行吗？提示提示2 2：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？问题：问题：如何大量生产单克隆抗体？请尝试设计如何大量生产单克隆抗体？请尝试设计一个方案。一个方案。2.2单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备第十六页，讲稿共四十一页哦一个一个B B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体淋巴细胞只分泌一种特异性抗体 骨髓瘤细胞能无限增殖骨髓瘤细胞能无限增殖杂交瘤细胞杂交瘤细胞动物细胞培养技术动物细胞培养技术设计方案：设计方案：动物细胞融合技术动物细胞融合技术单克隆单克隆抗体抗体 既能产生特异性抗体，既能产生特异性抗体，又能大量增殖的细胞又能大量增殖的细胞第十七页，讲稿

10、共四十一页哦为什么给小鼠注射特定的抗原为什么给小鼠注射特定的抗原蛋白？蛋白？会有几种融合方式？会有几种融合方式？杂交瘤细胞是如何筛选出来杂交瘤细胞是如何筛选出来的？有何特点？的？有何特点？是否所有的杂交瘤细胞都能是否所有的杂交瘤细胞都能产生专一性抗体？产生专一性抗体？如何大规模进行培养得到如何大规模进行培养得到大量的单克隆抗体？大量的单克隆抗体？第十八页，讲稿共四十一页哦BBBB 、B B瘤瘤 、瘤瘤瘤瘤 （B B、瘤）、瘤）（一选）（一选）选选择性培养基择性培养基：只有只有杂交瘤细杂交瘤细胞胞才能存活才能存活获得产生相应获得产生相应抗体的抗体的B B细胞细胞（二选）：选能（二选）：选能产生所

11、需产生所需专一专一抗体的杂交瘤抗体的杂交瘤细胞细胞第十九页，讲稿共四十一页哦想一想想一想2什么是单克隆抗体？鼠的单克隆抗体能否用什么是单克隆抗体？鼠的单克隆抗体能否用于人体疾病的治疗？为什么？于人体疾病的治疗？为什么？【提示提示】单克隆抗体是由单一杂交瘤细胞增单克隆抗体是由单一杂交瘤细胞增殖产生的殖产生的化学性质单一、特异性强化学性质单一、特异性强的抗体。不的抗体。不能。因为鼠的能。因为鼠的B淋巴细胞所产生的抗体与人体淋巴细胞所产生的抗体与人体B淋淋巴细胞产生的抗体是不同的。巴细胞产生的抗体是不同的。第二十页，讲稿共四十一页哦单抗制备过程分哪几步？单抗制备过程分哪几步？请用箭头把以下代表单克隆

12、抗体制备过请用箭头把以下代表单克隆抗体制备过程步骤的图解的字母按正确顺序连接起来。顺序是？程步骤的图解的字母按正确顺序连接起来。顺序是？第二十一页，讲稿共四十一页哦(2012北京四中高二质检北京四中高二质检)1975年科学家首次利用年科学家首次利用B淋巴细胞淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体。请根据下图回答问题：杂交瘤技术制备出单克隆抗体。请根据下图回答问题：(1)病原体注入小鼠体内后，要经过病原体注入小鼠体内后，要经过_细胞处理后形成抗原细胞处理后形成抗原MHC复复合体，才能被免疫细胞识别。合体，才能被免疫细胞识别。(2)制备单克隆抗体所用的制备单克隆抗体所用的B淋巴细胞一淋巴细胞一般从脾中

13、采集，然后以般从脾中采集，然后以_作诱导作诱导剂，使剂，使B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合。通过筛选和克隆培养，淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合。通过筛选和克隆培养，获得的杂交瘤细胞具获得的杂交瘤细胞具_的特点。的特点。(3)单克隆抗体的特点是单克隆抗体的特点是_根据上图写出应根据上图写出应用杂交瘤技术获得单克隆抗体的两种主要方法用杂交瘤技术获得单克隆抗体的两种主要方法_吞噬吞噬(或巨噬或巨噬)灭活的仙台病毒或聚乙二醇灭活的仙台病毒或聚乙二醇既能产生特异性抗体，又能无限增殖既能产生特异性抗体，又能无限增殖特异性强，纯度高特异性强，纯度高(或：专一性强、灵敏度高或：专一性强、灵敏度高)体外培养法和动物体内培养

14、法体外培养法和动物体内培养法第二十二页，讲稿共四十一页哦变式训练变式训练(2012西宁五中高二检测西宁五中高二检测)根据单克隆抗体制备流程示意图判断以根据单克隆抗体制备流程示意图判断以下选项中正确的是下选项中正确的是()A单克隆抗体技术的原理包括细胞增殖、细胞膜的流动性、细胞的全能性单克隆抗体技术的原理包括细胞增殖、细胞膜的流动性、细胞的全能性等等B根据培养基的物理性质分类，图中根据培养基的物理性质分类，图中HAT培养基属于选择培养基培养基属于选择培养基C在在制备单克隆抗体的过程中有两次选择，第一次是选择杂交瘤细胞，第二制备单克隆抗体的过程中有两次选择，第一次是选择杂交瘤细胞，第二次是选择能够

15、产生特异性抗体的杂交瘤细胞次是选择能够产生特异性抗体的杂交瘤细胞D老鼠骨髓瘤细胞染色体老鼠骨髓瘤细胞染色体数是数是40，效应，效应B细胞的染色体数为细胞的染色体数为46，融合后形成的杂交瘤细胞，融合后形成的杂交瘤细胞DNA分分子数为子数为86第二十三页，讲稿共四十一页哦2.3单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用诊断试剂诊断试剂最广泛应用最广泛应用准确、高效、简易、快速准确、高效、简易、快速单克隆抗体最主要的优点：单克隆抗体最主要的优点：特异性强，灵敏度高，特异性强，灵敏度高，并能大量制备。并能大量制备。第二十四页，讲稿共四十一页哦“生物导弹生物导弹”单克隆抗体药物单克隆抗体药物 单抗导向，药物为弹

16、头单抗导向，药物为弹头主要用于治疗主要用于治疗癌症治疗癌症治疗，单克隆抗体作为载体，运载抗癌药，单克隆抗体作为载体，运载抗癌药物，形成物，形成“生物导弹生物导弹”，准确杀伤癌变细胞。准确杀伤癌变细胞。第二十五页，讲稿共四十一页哦 有性生殖的生物产生后代需进行受精有性生殖的生物产生后代需进行受精作用，植物体细胞杂交要进行原生质体的融合，作用，植物体细胞杂交要进行原生质体的融合，单克隆抗体的制备需进行动物细胞融合，可见单克隆抗体的制备需进行动物细胞融合，可见细胞的融合技术有着广泛的应用。下列为细胞细胞的融合技术有着广泛的应用。下列为细胞融合的简略过程，据图回答相关问题：融合的简略过程，据图回答相关

17、问题：例例31)若若a、b分别是基因型为分别是基因型为Hhrr、hhRr两个烟草品种的花粉，且两个烟草品种的花粉，且这两对基因分别位于两对同源染色体上。由于一对隐性纯合基因这两对基因分别位于两对同源染色体上。由于一对隐性纯合基因(rr或或hh)的作用，在光照强度大于的作用，在光照强度大于800 lx时都不能生长。要想时都不能生长。要想从融合细胞的培养液中分离出基因型为从融合细胞的培养液中分离出基因型为HhRr的杂种细胞，较的杂种细胞，较为简便的筛选方法是为简便的筛选方法是_给予大于给予大于800 lx的光照的光照第二十六页，讲稿共四十一页哦(2)若若a、b表示两种植物体细胞，则由表示两种植物体

18、细胞，则由d细胞形成杂种植株的原理是细胞形成杂种植株的原理是_。这种育种方法的优点是这种育种方法的优点是_(3)若若a、b分别为骨髓瘤细胞和分别为骨髓瘤细胞和B淋巴细胞，则淋巴细胞，则d细胞的特点是细胞的特点是_。由由d细胞产生的抗体与普通血清抗体相比较，具有细胞产生的抗体与普通血清抗体相比较，具有_的特点。一般不能通过直接培养的特点。一般不能通过直接培养B淋巴细胞的方法生产单克隆抗体的主要原因是淋巴细胞的方法生产单克隆抗体的主要原因是_。植物细胞的全能性植物细胞的全能性克服了远缘杂交的障碍克服了远缘杂交的障碍既能无限增殖，又能产生特定的抗体既能无限增殖，又能产生特定的抗体特异性强、灵敏度高、

19、可大量制备特异性强、灵敏度高、可大量制备B淋巴细胞高度分化，不能增殖淋巴细胞高度分化，不能增殖第二十七页，讲稿共四十一页哦【例例4 4】科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓瘤细胞融合的是（克隆抗体，与骨髓瘤细胞融合的是（）A.A.经过免疫的经过免疫的B B淋巴细胞淋巴细胞 C.C.经过免疫的经过免疫的T T淋巴淋巴细胞细胞B.B.不经过免疫的不经过免疫的T T淋巴细胞淋巴细胞 D.D.不经过免疫的不经过免疫的B B淋淋巴细胞巴细胞【例例5 5】单克隆抗体是由下列哪种细胞产

20、生的单克隆抗体是由下列哪种细胞产生的 （）B B淋巴细胞淋巴细胞 B BT T淋巴细胞淋巴细胞 A.A.C C骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 D D杂交瘤细胞杂交瘤细胞AD第二十八页，讲稿共四十一页哦【例例6】用动物细胞工程技术获取单克隆抗体，下用动物细胞工程技术获取单克隆抗体，下列实验步骤中列实验步骤中错误错误的是（的是（）A A将抗原注入小鼠体内，获得能产生抗体的将抗原注入小鼠体内，获得能产生抗体的B B淋淋巴细胞巴细胞B B用纤维素酶处理用纤维素酶处理B B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞C C用聚乙二醇作诱导剂，促使能产生抗体的用聚乙二醇作诱导剂，促使能产生抗体的B B淋淋巴细胞

21、与小鼠骨髓瘤细胞融合巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合D D筛选杂交细胞，并从中选出能产生所需抗体的筛选杂交细胞，并从中选出能产生所需抗体的细胞群，培养后提取单克隆抗体细胞群，培养后提取单克隆抗体B第二十九页，讲稿共四十一页哦变式训练变式训练下列关于细胞工程的叙述，错误的是下列关于细胞工程的叙述，错误的是()A电刺激可诱导植物原生质体融合或动物细胞融电刺激可诱导植物原生质体融合或动物细胞融合合B去除植物细胞的细胞壁和将动物组织分散成单个去除植物细胞的细胞壁和将动物组织分散成单个细胞均需酶处理细胞均需酶处理C小鼠骨髓瘤细胞和经抗原免疫小鼠的小鼠骨髓瘤细胞和经抗原免疫小鼠的B淋巴细胞淋巴细胞融合可制备单克

22、隆抗体融合可制备单克隆抗体D某种植物甲乙两品种的体细胞杂种与甲乙两品某种植物甲乙两品种的体细胞杂种与甲乙两品种杂交后代的染色体数目相同种杂交后代的染色体数目相同第三十页，讲稿共四十一页哦两个过程两个过程动物细胞培养过程动物细胞培养过程单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程三个三个“一一”一个诱导细胞融合的新方法一个诱导细胞融合的新方法 灭活病毒灭活病毒一个新细胞杂交瘤细胞一个新细胞杂交瘤细胞一个优势单克隆抗体特异性一个优势单克隆抗体特异性 强、强、灵敏度高的优势灵敏度高的优势第三十一页，讲稿共四十一页哦第三十二页，讲稿共四十一页哦(1)(1)若若A A细胞是小鼠骨髓瘤细胞，则细胞是小鼠骨髓瘤细胞

23、，则B B细胞是取自小鼠体内的细胞是取自小鼠体内的 细胞，细胞，从小鼠体内提取分离该细胞之前，应给小鼠注射从小鼠体内提取分离该细胞之前，应给小鼠注射_类物质。类物质。（2）d过程过程是一个是一个_过程，该过程的进行过程，该过程的进行常用常用_或或_的诱导。的诱导。(3)(3)假设仅考虑某两个细胞的融合，则可形成假设仅考虑某两个细胞的融合，则可形成 种类种类型的型的C C细胞，因此需用细胞，因此需用_培养基筛选出培养基筛选出D D细胞用于细胞用于培养，培养，D D细胞的名称是细胞的名称是 ，其特点是，其特点是_。效应效应B抗原抗原细胞融合细胞融合聚乙二醇聚乙二醇 灭活的病毒灭活的病毒选择性选择性

24、 3既能无限增殖又能产生特异性抗体既能无限增殖又能产生特异性抗体杂交瘤细胞杂交瘤细胞第三十三页，讲稿共四十一页哦(4)(4)在培养时通过在培养时通过_分裂方式大量繁殖。分裂方式大量繁殖。D D细胞体细胞体外培养需要注意的条件是（要求答外培养需要注意的条件是（要求答5 5项）项）_。（5 5）单克隆抗体在疾病的诊断、治疗和预防方面，与常）单克隆抗体在疾病的诊断、治疗和预防方面，与常规抗体相比，其特点是规抗体相比，其特点是_。特异性强、灵敏度高特异性强、灵敏度高无菌、无毒的环境；充足的营养；适宜的温度和无菌、无毒的环境；充足的营养；适宜的温度和pHpH；适宜；适宜的气体环境的气体环境第三十四页，讲

25、稿共四十一页哦1515、（1）单克隆抗体是指）单克隆抗体是指 。（2 2）制备单克隆抗体的步骤：）制备单克隆抗体的步骤：将将_注入小鼠体内，从小鼠脾脏中获得淋巴细胞，其注入小鼠体内，从小鼠脾脏中获得淋巴细胞，其中至少中至少1 1个淋巴细胞带有抗该抗原的抗体。个淋巴细胞带有抗该抗原的抗体。将步骤获得的将步骤获得的B B淋巴细胞与步骤培养的骨髓瘤细胞在淋巴细胞与步骤培养的骨髓瘤细胞在_的诱导下融合。的诱导下融合。将诱导后产生的多种细胞，放在将诱导后产生的多种细胞，放在_培养基的多孔培养板培养基的多孔培养板上培养，筛选。上培养，筛选。这样获得的杂交瘤细胞既具有这样获得的杂交瘤细胞既具有B B淋巴细胞

26、淋巴细胞_的能的能力，又具有力，又具有_的本领。的本领。检测和分离带有抗检测和分离带有抗X X抗体的阳性细胞，培养板中每孔放一个抗体的阳性细胞，培养板中每孔放一个细胞进行培养。细胞进行培养。将阳性细胞进行增殖，从而制备出大量抗该抗原的单克隆抗体。将阳性细胞进行增殖，从而制备出大量抗该抗原的单克隆抗体。化学性质单一，特异性强的抗体化学性质单一，特异性强的抗体抗原抗原聚乙二醇聚乙二醇选择性选择性无限增殖无限增殖产生专一抗体产生专一抗体第三十五页，讲稿共四十一页哦（3）大量制备单克隆抗体的方法主要有两种：）大量制备单克隆抗体的方法主要有两种：体外培养法，可获得体外培养法，可获得10 g/mL的抗体；

27、的抗体；动物体内诱生法动物体内诱生法可获得可获得520mmg/mL的抗体。你选择的方法及原因的抗体。你选择的方法及原因是是 。（4 4）用本法制备出的单克隆抗体仍具有局限性，因为它是）用本法制备出的单克隆抗体仍具有局限性，因为它是用小鼠的用小鼠的_细胞制备的，其化学本质是细胞制备的，其化学本质是_，应用于人体，会作为应用于人体，会作为 产生产生 ，解决这个问题，解决这个问题的方法是的方法是_。大量生产选，小规模生产选大量生产选，小规模生产选效应效应B蛋白质蛋白质异物异物免疫反应免疫反应采用人的效应采用人的效应B细胞制备细胞制备第三十六页，讲稿共四十一页哦15、右图为某同学根据杂交瘤技术的方法，

28、、右图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌抗体的实验方案。设计的生产破伤风杆菌抗体的实验方案。据图回答：据图回答：（1）该方案能达到预期效果吗？）该方案能达到预期效果吗？。原因是。原因是_。（2）图中为）图中为 过程，常过程，常用用 作为诱导剂。该细胞继承作为诱导剂。该细胞继承了了_ ，因此不仅能分泌，因此不仅能分泌_，还有还有 本领。本领。不能不能没有将抗原注入小鼠体内，无法获得产生没有将抗原注入小鼠体内，无法获得产生专一抗体的专一抗体的B淋巴细胞淋巴细胞细胞融合细胞融合灭活病毒灭活病毒双亲细胞的遗传物质双亲细胞的遗传物质特异性抗体特异性抗体大量增殖大量增殖制备单克隆抗体制备单克隆抗体（3）该方案的目的是）该方案的目的是_。第三十七页，讲稿共四十一页哦第三十八页，讲稿共四十一页哦第三十九页，讲稿共四十一页哦第四十页，讲稿共四十一页哦感谢大家观看感谢大家观看9/5/2022第四十一页，讲稿共四十一页哦