基因工程制药 (4)课件.ppt
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1、关于基因工程制药(4)现在学习的是第1页,共45页v菌体的生长通常用比生长速率来表示。菌体的生长通常用比生长速率来表示。v工程菌培养可通过选用不同的碳源控制补料和稀释速率等方法工程菌培养可通过选用不同的碳源控制补料和稀释速率等方法来控制菌体的生长。来控制菌体的生长。v控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物积累、提高外控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物积累、提高外源蛋白产率有重要意义。源蛋白产率有重要意义。现在学习的是第2页,共45页 大肠杆菌的蛋白大肠杆菌的蛋白/菌体量的比值是基本恒定的,因而菌体的生长速度菌体量的比值是基本恒定的,因而菌体的生长速度反映了蛋白质的合成速
2、度。反映了蛋白质的合成速度。培养条件的改变,都会改变培养条件的改变,都会改变菌体的能量代谢菌体的能量代谢和和小分子前体的供应小分子前体的供应,影响生物大分子的合成和菌体的生长。影响生物大分子的合成和菌体的生长。现在学习的是第3页,共45页一、菌体的生长与能量的关系一、菌体的生长与能量的关系p碳源物质是组成培养基的主要成分。碳源物质是组成培养基的主要成分。p碳源物质为细胞提供能量,当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供碳源物质为细胞提供能量,当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时,菌体会产生乙酸,导致培养基的的能量时,菌体会产生乙酸,导致培养基的pH值下降,从而影响菌值下降,从而影响菌体
3、的生长。体的生长。p提高提高pH,可减少乙酸的抑制作用,可减少乙酸的抑制作用现在学习的是第4页,共45页p分批培养中选择不同的碳源,连续培养中控制稀释速率等都能分批培养中选择不同的碳源,连续培养中控制稀释速率等都能一定范围内控制菌体的生长,从而控制乙酸的产生,减少它的一定范围内控制菌体的生长,从而控制乙酸的产生,减少它的抑制作用。抑制作用。p 加入甲硫氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。加入甲硫氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。现在学习的是第5页,共45页p大肠杆菌中克隆大肠杆菌中克隆携带氧能力的携带氧能力的VHB蛋白蛋白的基因可提高菌体生长速率。的基因可提高菌体生长速率。p采用磷酸乙酰化酶
4、缺陷株作为宿主细胞,阻止乙酸产生,可提高产量。采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿主细胞,阻止乙酸产生,可提高产量。现在学习的是第6页,共45页二、菌体生长与前体供应的关系二、菌体生长与前体供应的关系 在基础培养基中加入氨基酸(小分子前体)能使菌体比生长率提在基础培养基中加入氨基酸(小分子前体)能使菌体比生长率提高,蛋白合成增加。高,蛋白合成增加。基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争共同的前体和催化基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构,致工程菌生长速率降低。结构,致工程菌生长速率降低。现在学习的是第7页,共45页质粒存在对菌体代谢的影响:中等拷贝质粒(质粒存在对菌体代谢的影响:中等
5、拷贝质粒(5656拷贝)的工程菌拷贝)的工程菌中与前体合成有关的酶增加,这些酶的基因大多受终产物的反馈调节。中与前体合成有关的酶增加,这些酶的基因大多受终产物的反馈调节。如:三羧酸循环关键酶、天冬氨酸转酰基酶等。如:三羧酸循环关键酶、天冬氨酸转酰基酶等。高拷贝质粒的工程菌(高拷贝质粒的工程菌(240240拷贝)中,生长速率和菌体总蛋白合成拷贝)中,生长速率和菌体总蛋白合成均减少。这与工程菌大量前体被利用引起前体不足,从而产生均减少。这与工程菌大量前体被利用引起前体不足,从而产生“严紧反应严紧反应”有关。有关。现在学习的是第8页,共45页p“严紧反应严紧反应”是当氨酰是当氨酰tRNAtRNA不足
6、时不足时,核糖体在密码子上停留核糖体在密码子上停留,并并合成被称为魔点的合成被称为魔点的ppGppppGpp的结果。的结果。pppGppppGpp是一个重要的调控分子。它通过影响是一个重要的调控分子。它通过影响RNARNA链的延伸过程减链的延伸过程减少转录。少转录。现在学习的是第9页,共45页p它的浓度增加会导致在合成它的浓度增加会导致在合成mRNAmRNA和和rRNArRNA时时RNARNA聚合酶在模板上的移动聚合酶在模板上的移动产生停顿,产生停顿,RNARNA链延长速度减慢,使游离的链延长速度减慢,使游离的RNARNA聚合酶浓度降低,严聚合酶浓度降低,严紧控制的启动子如紧控制的启动子如rr
7、nArrnA等的转录减少。等的转录减少。p也可能也可能ppGppppGpp是通过干扰是通过干扰RNARNA聚合酶与聚合酶与PLPL启动子专一识别反应。启动子专一识别反应。影响核影响核糖体浓度(降低)糖体浓度(降低)现在学习的是第10页,共45页第六节第六节 基因工程菌的不稳定性基因工程菌的不稳定性基因工程菌在传代基因工程菌在传代(2525代以上)代以上)过程中常出现质粒不稳定的现象。过程中常出现质粒不稳定的现象。p分裂不稳定:分裂不稳定:指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。p结构不稳定:结构不稳定:指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺
8、失所致指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变工程菌性能的改变现在学习的是第11页,共45页一、质粒不稳定产生的原因一、质粒不稳定产生的原因 常见分裂不稳定的两个因素:常见分裂不稳定的两个因素:含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率(质粒丢失率);(质粒丢失率);这两种菌(这两种菌(含质粒菌和不含质粒菌含质粒菌和不含质粒菌)比生长速率差异的大小。)比生长速率差异的大小。现在学习的是第12页,共45页质粒稳定性的分析方法质粒稳定性的分析方法样品样品不含抗性标记抗生素平不含抗性标记抗生素平板培养基板培养基10-12h100100个菌落个菌落含抗性标记抗生
9、素平含抗性标记抗生素平板培养基板培养基 10-12h统计生长菌落数统计生长菌落数重复三次重复三次,计算比值计算比值 (稳定性稳定性stability)现在学习的是第13页,共45页二、提高质粒稳定性的方法二、提高质粒稳定性的方法v1.合适的宿主:合适的宿主:宿主菌宿主菌v2.合适的载体合适的载体:质粒拷贝数质粒拷贝数v3.选择压力:选择压力:抗生素抗生素v4.分阶段控制培养:分阶段控制培养:先使菌体生长至一定密度;先使菌体生长至一定密度;v 再诱导外源基因的表达再诱导外源基因的表达 v5.控制培养条件:控制培养条件:温度、温度、pH值、培养基组分、溶氧值、培养基组分、溶氧v6.固定化:固定化:
10、卡拉胶卡拉胶现在学习的是第14页,共45页 2.合适的载体合适的载体低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高,如果增加低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高,如果增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定性;工程菌质粒拷贝数可提高稳定性;高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低,但对稳定高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低,但对稳定性不利。性不利。现在学习的是第15页,共45页 菌体生长速率对质粒拷贝数和质粒稳定性有影响。高生长速率时质粒拷贝数下降,但质粒稳定性增加。生长速率生长速率/h/h0.20.4质粒拷贝数质粒拷贝数10.510950400-半乳糖苷酶工程菌的连续培养半乳糖苷酶工程菌的连续培养
11、3现在学习的是第16页,共45页3.选择压力:选择压力:在培养基中加入抗生素抑制质粒丢失菌的生长,提高质在培养基中加入抗生素抑制质粒丢失菌的生长,提高质粒稳定性。粒稳定性。4.分阶段控制培养:分阶段控制培养:由于第一阶段外源基因未表达,减小了重组菌与质由于第一阶段外源基因未表达,减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别,增加了质粒稳定性。粒丢失菌的生长速率的差别,增加了质粒稳定性。5.控制培养条件:控制培养条件:调控环境参数如温度、调控环境参数如温度、pHpH、培养基组分和溶解氧浓、培养基组分和溶解氧浓度度现在学习的是第17页,共45页p含质粒的基因重组菌对发酵环境的改变比不含质粒菌反应含质粒
12、的基因重组菌对发酵环境的改变比不含质粒菌反应慢,间歇改变培养条件以改变两种菌比生长速率,可改善慢,间歇改变培养条件以改变两种菌比生长速率,可改善质粒稳定性。质粒稳定性。p通过间歇供氧和改变稀释数率,都可以提高质粒稳定性。通过间歇供氧和改变稀释数率,都可以提高质粒稳定性。现在学习的是第18页,共45页第七节第七节 基因工程菌中试基因工程菌中试 基因工程菌的培养过程包括基因工程菌的培养过程包括:通过摇瓶操作确定:通过摇瓶操作确定:基因工程菌生长的基础条件基因工程菌生长的基础条件,如温度、如温度、pHpH、培养基各种组分、碳氧比,分析表达产物的合成、积累对受体培养基各种组分、碳氧比,分析表达产物的合
13、成、积累对受体细胞的影响细胞的影响;通过培养罐操作确定:通过培养罐操作确定:培养参数和控制方案以及顺序。培养参数和控制方案以及顺序。现在学习的是第19页,共45页菌种菌种 一级种子摇瓶一级种子摇瓶 二级种子罐培养二级种子罐培养 扩大培养扩大培养 原料原料 发酵培养发酵培养 灭菌灭菌 发酵生产发酵生产 代谢产代谢产 物分离物分离 基配制基配制 微生物工业发酵过程简图微生物工业发酵过程简图现在学习的是第20页,共45页基因工程菌中试基因工程菌中试现在学习的是第21页,共45页第八节第八节 重组工程菌的培养重组工程菌的培养(batchculture)(fedbatchculture)(continu
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