分析化学高效液相色谱法讲稿.ppt

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1、第十八章 高效液相色谱法第一页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法u经典液相色谱法为基础，经典液相色谱法为基础，u引入气相色谱法的理论和实验技术，引入气相色谱法的理论和实验技术，u高压输送流动相，高压输送流动相，u高效固定相及高灵敏度检测器，高效固定相及高灵敏度检测器，u现代液相色谱分析方法。现代液相色谱分析方法。第二页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法u颗粒极细（一般为颗粒极细（一般为1010 m m以下）、规则均匀的固定以下）、规则均匀的固定相，相，(键合相键合相)传质阻抗小，柱效高，分离效率高；传质阻抗小，柱效高，分离效率高；u高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快；高压

2、输液泵输送流动相，流速快，分析速度快；u高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检测器最高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检测器最小检测限可达小检测限可达1010 9 9g g，而荧光检测器最小检测限，而荧光检测器最小检测限可达可达1010 1212g g。第三页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法u不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应用范不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应用范围广；围广；u可选用各种溶剂作为流动相，对分离的选可选用各种溶剂作为流动相，对分离的选择性有很大作用，选择性高；择性有很大作用，选择性高；u一般在室温条件下进行分离，不需要高柱温。一般在室温条件下进行分离，不需要高

3、柱温。第四页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法一、主要类型主要类型 四类基本类型色谱法四类基本类型色谱法 分配色谱法（分配色谱法（partition chromatographypartition chromatography）吸附色谱法（吸附色谱法（adsorption chromatographyadsorption chromatography）离子交换色谱法（离子交换色谱法（IECIEC）空间排阻色谱法（空间排阻色谱法（SECSEC）第五页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法第一节 高效液相色谱法的主要类型和原理 一、主要类型 四类基本类型色谱法 分配色谱法（partit

4、ion chromatography）吸附色谱法（adsorption chromatography）离子交换色谱法（IEC）空间排阻色谱法（SEC）化学键合相色谱法第六页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法其他色谱类型其他色谱类型u亲合色谱法亲合色谱法（affinity chromatographyaffinity chromatography；ACAC）u手性色谱法手性色谱法（chiral chromatographychiral chromatography；CCCC）u胶束色谱法胶束色谱法（micellar chromatographymicellar chromatograph

5、y；MCMC）u电色谱法电色谱法（electrochromatographyelectrochromatography；ECEC）第七页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法u以化学键合相为固定相的色谱法，简称键合相色以化学键合相为固定相的色谱法，简称键合相色谱法谱法(bonded phase chromatography(bonded phase chromatography；BPC)BPC)u化学键合相：采用化学反应的方法将官能团键化学键合相：采用化学反应的方法将官能团键合在载体表面所形成的固定相合在载体表面所形成的固定相 第八页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法优点：优点：u

6、固定相的均一性和稳定性好，在使用过程中不固定相的均一性和稳定性好，在使用过程中不易流失，使用周期长；易流失，使用周期长；u柱效高；重现性好；柱效高；重现性好；u能使用的流动相和键合相的种类多，分离的能使用的流动相和键合相的种类多，分离的选择性高选择性高正相（正相（normal phasenormal phase，NPNP）和反相（）和反相（reversed reversed phasephase，RPRP）键合相色谱法）键合相色谱法：根据化学键合相与流动相极性的相对强弱根据化学键合相与流动相极性的相对强弱第九页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法u固定相：固定相：极性键合相极性键合相如氰

7、基（如氰基（CNCN）、氨基（）、氨基（NHNH2 2）或二羟基键）或二羟基键合硅胶。（经典：水饱和的硅胶）合硅胶。（经典：水饱和的硅胶）u流动相：流动相：非极性或弱极性溶剂加极性调整剂非极性或弱极性溶剂加极性调整剂如烷烃加醇类。（与水不混溶的溶剂）如烷烃加醇类。（与水不混溶的溶剂）u适用范围：适用范围：溶于有机溶剂的极性至中等极性的分溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物子型化合物如一些在硅胶柱上分离的物质如一些在硅胶柱上分离的物质第十页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法u分离机制？分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶质在两相的溶解 吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和定向

8、作用u分离选择性：极性强的组分k大，后洗脱出柱。流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k减小，tR 减小。第十一页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法u固定相固定相：非极性键合相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（如十八烷基硅烷（C C1818，ODSODS）、辛烷基（）、辛烷基（C C8 8）键合硅）键合硅胶胶 u流动相流动相：水水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调整剂性调整剂 常用甲醇水、乙腈水等常用甲醇水、乙腈水等 应用：应用：最广最广 非极性至中等极性的组分，（还有有机酸、非极性至中等极性的组分，（还有有机酸、碱及盐等）碱及盐等）第十二页，讲稿共

9、五十四页哦第十八章 高效液相色谱法保留机制保留机制 疏溶剂疏溶剂 （solvophobic theorysolvophobic theory）溶质的保留主要是溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力，促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合。不是溶质分子与键合相间的色散力。第十三页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法u保留行为的主要影响因素保留行为的主要影响因素1 1、溶质的分子结构（极性）、溶质的分子结构（极性）极性越弱，疏水性越强，极性越弱，疏水性越强，k k越大，越大，t tR R也越大也越大。同系物碳数越多，极性越弱，同系物碳数越多，极性越弱，k k越大；越大；引入极性取代基，降低疏水性，

10、引入极性取代基，降低疏水性，k k值变小。值变小。第十四页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法2 2、固定相、固定相 键合烷基的疏水性随键合烷基的疏水性随碳链的延长碳链的延长而增而增 加，加，溶质的溶质的k k也增大。也增大。硅胶表面硅胶表面键合烷基的浓度越大键合烷基的浓度越大，则溶则溶 质的质的k k越大越大。反相键合相色谱法u保留行为的主要影响因素第十五页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法u保留行为的主要影响因素保留行为的主要影响因素3 3、流动相、流动相 极性极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的越强，洗脱能力越弱，使溶质的k k越大越大 溶剂种类溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂

11、：水为弱溶剂，醇为强溶剂 溶剂比溶剂比例例：水的比例增加，使：水的比例增加，使k k增大增大 中性盐的中性盐的加入加入：使中性溶质的：使中性溶质的k k增大增大 pHpH：影响弱酸、：影响弱酸、弱减的离解弱减的离解 流动相的流动相的pHpH降低，降低，弱酸弱酸k k增大，增大，t tR R增大；增大；弱碱弱碱k k变小。变小。第十六页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法u离子抑制色谱法（离子抑制色谱法（ion suppression ion suppression chromatographychromatography；ISC ISC）u用少量弱酸、弱碱或缓冲溶液，调节流动相的用少量弱

12、酸、弱碱或缓冲溶液，调节流动相的pHpH，抑制有机弱酸、弱碱的离解，增加疏水缔合作用，抑制有机弱酸、弱碱的离解，增加疏水缔合作用，使使k k变大。变大。u适用于适用于3p3pK Ka7a7的弱酸、的弱酸、7p7pK Ka8a8的弱碱的弱碱第十七页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法 把离子对试剂加入到含水流动相中，组把离子对试剂加入到含水流动相中，组分离子在流动相中与离子对试剂的反离子分离子在流动相中与离子对试剂的反离子（counter ioncounter ion）生成）生成中性离子对中性离子对，增加溶，增加溶质与非极性固定相的作用，使质与非极性固定相的作用，使k k增加，改善分增加，

13、改善分离效果。离效果。第十八页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法离子对模型离子对模型33+()+3s3(+固定相+()+B)+B+H+BHRSO NaRSO +Na+BHRSORSO)BH离子对mB+AB AmA(smBAmmmsmsBAAABABBABEK流动相通式第十九页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法影响容量因子的因素影响容量因子的因素离子对试剂的种类和浓度离子对试剂的种类和浓度：碳链长度增加，溶质的：碳链长度增加，溶质的k k增大；在一定范围内试剂的浓度升高，溶质的增大；在一定范围内试剂的浓度升高，溶质的k k增增大大 流动相的流动相的pHpH：有利于组分和离子对试剂

14、离子化时（离：有利于组分和离子对试剂离子化时（离子对的形成），组分的子对的形成），组分的k k值最大值最大固定相固定相 、流动相性质、流动相性质（同一般（同一般RP-HPLCRP-HPLC）。）。第二十页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法u适用范围适用范围：有机酸、碱、盐，离子型和非离子型化合：有机酸、碱、盐，离子型和非离子型化合物的混合物。物的混合物。u分析酸类或带负电荷物质分析酸类或带负电荷物质：用季铵盐，如四丁基铵磷酸：用季铵盐，如四丁基铵磷酸盐（盐（TBATBA）和溴化十六烷基三甲基铵（）和溴化十六烷基三甲基铵（CTABCTAB）等。）等。u分析碱类或带正电荷的物质分析碱类或带

15、正电荷的物质：用烷基磺酸盐或硫酸盐，：用烷基磺酸盐或硫酸盐，如正戊烷基磺酸钠（如正戊烷基磺酸钠（PICBPICB5 5）、正己烷基磺酸钠（）、正己烷基磺酸钠（PICBPICB6 6）。）。第二十一页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法第二十二页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法u固定相应符合下列要求固定相应符合下列要求：颗粒细且均匀；颗粒细且均匀；传质快；传质快；机械强度高，能耐高压；机械强度高，能耐高压；化学稳定性好，不与流动相发生化学化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。反应。第二十三页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法（一）键合相的种类（一）键合相的种类 非极性键合

16、相非极性键合相 ：非极性烃基，如非极性烃基，如C C1818C C8 8C C1 1与苯基等键合在硅胶表面；与苯基等键合在硅胶表面；用于反相色谱；用于反相色谱；长链烷基可使溶质的长链烷基可使溶质的k k增大，选择性改善，载样量提高，增大，选择性改善，载样量提高，稳定性更好。稳定性更好。第二十四页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法 键合相的种类键合相的种类u弱极性键合相：弱极性键合相：醚基和二羟基等键合相醚基和二羟基等键合相用于反相或正相色谱用于反相或正相色谱u极性键合相：极性键合相：常用氨基常用氨基氰基键合相（氰乙硅烷基氰基键合相（氰乙硅烷基Si(CHSi(CH2 2)2 2CN)CN

17、)键合键合硅胶硅胶一般用于正相色谱一般用于正相色谱 u特殊用途的键合相特殊用途的键合相第二十五页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法u键合反应键合反应 硅氧硅氧烷（烷（SiSiO OSiSiC C）型：氯硅烷与硅胶进行）型：氯硅烷与硅胶进行硅烷化反应硅烷化反应 22SiOHClCH+SiSiSiClH18OR118HC3737RRR1如：YWGC18H37，无定形硅胶YWG上键合了十八硅烷基；Spherisorb ODS，球形硅胶Spherisorb 上键合了ODS。第二十六页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法u键合相的性质键合相的性质含碳量：含碳的百分数含碳量：含碳的百分数 覆

18、盖度覆盖度 ：已反应的硅醇基数目占硅胶表面硅：已反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例醇基总数的比例 封尾（封尾（end-cappingend-capping）：在键合反应后，用三甲基）：在键合反应后，用三甲基氯硅烷等进行钝化处理，减少残余硅醇基。氯硅烷等进行钝化处理，减少残余硅醇基。第二十七页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法u键合相的特点键合相的特点使用过程中不流失；使用过程中不流失；化学稳定性好；化学稳定性好；适于梯度洗脱；适于梯度洗脱；载样量大载样量大 u注意注意：流动相的流动相的pHpH一般应在一般应在3-83-8，否则会引起硅胶，否则会引起硅胶溶解；溶解；(也有适用宽也

19、有适用宽pHpH范围的键合相范围的键合相)。第二十八页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法u对流动相的要求：对流动相的要求：与固定相不发生化学反应。与固定相不发生化学反应。对试样有适宜的溶解度。使对试样有适宜的溶解度。使k k在在1 11010范围内，范围内，与检测器相适应。例如用紫外检测器时，选用截与检测器相适应。例如用紫外检测器时，选用截止波长小于检测波长的溶剂。止波长小于检测波长的溶剂。纯度高，粘度小。低粘度流动相如甲醇纯度高，粘度小。低粘度流动相如甲醇乙腈乙腈等可以降低柱压，提高柱效。等可以降低柱压，提高柱效。第二十九页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法（一）（一）流动相

20、对分离的影响流动相对分离的影响n n由色谱柱（固定相）性能决定，由色谱柱（固定相）性能决定，主要受溶剂种类的影响，主要受溶剂种类的影响，k k受溶剂配比的影响。受溶剂配比的影响。2211-4nkkR第三十页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法（二）流动相的强度和选择性（二）流动相的强度和选择性u溶剂的极性（强度）溶剂的极性（强度）正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 u溶剂的选择性溶剂的选择性不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故选择性不同选择性不同

21、 u混合溶剂混合溶剂（二元或多元流动相）（二元或多元流动相）第三十一页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法u（一）一）HPLCHPLC中的速率理论中的速率理论涡流扩散涡流扩散A A=2=2ddp p 球形、小粒度、均匀（球形、小粒度、均匀（RSDRSD5%5%）固定相，）固定相，匀浆高压填充，以降低匀浆高压填充，以降低A A。纵向扩散纵向扩散=2=2DDm m 可以忽略可以忽略。因为因为D Dl l很小，室温操作，且很小，室温操作，且U U大于大于U U最佳最佳，第三十二页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法u传质阻抗u固定相传质阻抗CS可以忽略，因df极小u流动相传质阻抗Cm u

22、要求：dp小，Dm大m2PmmDdC第三十三页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法u静态流动相传质阻抗静态流动相传质阻抗：u由于部分流动相在固定相微孔内的滞留由于部分流动相在固定相微孔内的滞留u静态流动相传质阻抗系数静态流动相传质阻抗系数C Csmsm uC Csm sm ddp p2 2，C Csm sm 1 1/D/Dm m，而，而D Dm mTT/u要求要求:固定相固定相d dp p2 2、流动相流动相都小都小第三十四页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法H H=A A+C Cm mu u+C Csmsmu u 原因原因：化学键合相，液体流动相：化学键合相，液体流动相结果结果

23、：HPLCHPLC的实验条件应该是：小的实验条件应该是：小粒度、均匀的球形化学键合相；低粘粒度、均匀的球形化学键合相；低粘度流动相，流速不宜过快；柱温适当。度流动相，流速不宜过快；柱温适当。第三十五页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法u固定相固定相极性键合相如氰基、氨基键合相等极性键合相如氰基、氨基键合相等u流动相流动相烷烃加适量极性调节剂烷烃加适量极性调节剂第三十六页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法u固定相固定相非极性键合相如非极性键合相如ODSODSu流动相流动相以水为基础溶剂，加入甲醇、以水为基础溶剂，加入甲醇、乙腈等极性调节剂乙腈等极性调节剂弱酸、弱碱或缓冲盐作为离子

24、抑制剂弱酸、弱碱或缓冲盐作为离子抑制剂加入加入0.1%0.1%1%1%的醋酸盐、磷酸盐可减少的醋酸盐、磷酸盐可减少残余硅醇基的作用残余硅醇基的作用 第三十七页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法u固定相固定相 尽可能选择表面覆盖度高且疏水尽可能选择表面覆盖度高且疏水性强的非极性键合相，性强的非极性键合相，u离子对试剂离子对试剂 离子对试剂所带的电荷应离子对试剂所带的电荷应与试样离子的电荷相反与试样离子的电荷相反 u流动相流动相pHpH使试样组分与离子对试剂全部离使试样组分与离子对试剂全部离子化子化u有机溶剂及其浓度有机溶剂及其浓度 同一般同一般HPLCHPLC 第三十八页，讲稿共五十四页

25、哦第十八章 高效液相色谱法u组成组成输液系统输液系统进样系统进样系统色谱柱系统色谱柱系统检测系统检测系统数据记录处理系统数据记录处理系统 第三十九页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法u高压输液泵高压输液泵恒流泵：在输送流动相过程中流量恒定。恒流泵：在输送流动相过程中流量恒定。常用柱塞往复泵常用柱塞往复泵双泵：为了克服流量的脉动。双泵：为了克服流量的脉动。有串联式和并联式有串联式和并联式第四十页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法输液泵应具备的性能：输液泵应具备的性能：u流量精度高且稳定流量精度高且稳定u流量范围宽流量范围宽u能在高压下连续工作能在高压下连续工作u液缸容积小液缸容积

26、小u密封性能好，耐腐蚀密封性能好，耐腐蚀 第四十一页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法输液泵操作注意事项：输液泵操作注意事项：u防止固体微粒进入泵体防止固体微粒进入泵体u流动相不应含有腐蚀性物质流动相不应含有腐蚀性物质u防止溶剂瓶内的流动相被用完防止溶剂瓶内的流动相被用完u不超过规定的最高压力不超过规定的最高压力u流动相一般应该先脱气流动相一般应该先脱气第四十二页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法u进样器进样器进样阀（六通阀）、自动进样装置进样阀（六通阀）、自动进样装置u色谱柱色谱柱（columncolumn）由柱管和固定相组成由柱管和固定相组成分析柱、制备柱分析柱、制备柱 性

27、能评价性能评价 H H、n n、f fs s、k k和和的重复性，或的重复性，或R R。第四十三页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法u（一）检测器（一）检测器(detector)(detector)的主要性能的主要性能要求要求：灵灵敏度（敏度（sensitivitysensitivity）高（检测限低）噪音）高（检测限低）噪音（noisenoise）低）低 线性范线性范围（围（linear rangelinear range）宽）宽 重复性重复性（repeatabilityrepeatability）好）好 适用范围广适用范围广（通用型、专属型）（通用型、专属型）第四十四页，讲稿共五十

28、四页哦第十八章 高效液相色谱法u检测原理：朗伯比尔(Lambert-Beer)定律，响应信号（吸光度）与浓度成正比A=Clu特点：灵敏度较高（10-610-9 g/ml），噪音低，线性范围宽，稳定性好，适于梯度，不破坏样品，应用广（分析、制备）。第四十五页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法u局限局限：只能检测有紫外吸收的物质，流动相的只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长应小于检测波长。截止波长应小于检测波长。u专属型、浓度型检测器专属型、浓度型检测器第四十六页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法u固定波长检测器固定波长检测器 ：254nm254nmu可变波长检测器：可变波长

29、检测器：光源：氘灯（和钨灯），光源：氘灯（和钨灯），200200400400（800800）nmnm，单色器，单色器，流通池（试样），光电管流通池（试样），光电管光路系统和紫外分光光度计相似光路系统和紫外分光光度计相似 u光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器 (photodiode array detector(photodiode array detector；PDAD)PDAD)：一系列光电二极管，一个二极管对应接受光谱上约一系列光电二极管，一个二极管对应接受光谱上约1nm1nm谱带宽的单色光谱带宽的单色光 第四十七页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法u光电二极管阵列检测器光电

30、二极管阵列检测器u工作原理工作原理：复光通过流通池，再进入单色器，分：复光通过流通池，再进入单色器，分光后照射在二极管阵列装置上，同时获得各波长光后照射在二极管阵列装置上，同时获得各波长的信号强度，即获得组分的吸收光谱。获得三维的信号强度，即获得组分的吸收光谱。获得三维光谱色谱图。光谱色谱图。u用途用途：吸收光谱用于组分的定性，色谱峰面积用于定：吸收光谱用于组分的定性，色谱峰面积用于定量量,判断峰纯度。判断峰纯度。第四十八页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法第四十九页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法u检测原理检测原理：化合物受紫外光激发后，发射出比激发光波长更长的光，称化合物

31、受紫外光激发后，发射出比激发光波长更长的光，称为荧光；为荧光；荧光强度荧光强度 (F F)与激发光强度与激发光强度 (I I0 0)及荧光物质浓度及荧光物质浓度 (C C)之间的关系为：之间的关系为：F F=2.3=2.3QKIQKI0 0ClCl Q Q为量子产率，为量子产率，K K为荧光效率，为荧光效率，为摩尔吸光系数，为摩尔吸光系数，l l为光为光径长度。径长度。F F=KCKC 第五十页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法u特点特点：选择性好，专属型检测器选择性好，专属型检测器灵敏度比紫外检测器高（检测限灵敏度比紫外检测器高（检测限1010-10-10 g/ml g/ml）u激发波长激发波长(exex)和发射波长和发射波长(emem)的选择的选择第五十一页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法u定性分析方法定性分析方法u定量分析方法：定量分析方法：外标法、内标法外标法、内标法同同GCGC（自己看）（自己看）第五十二页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法u化学键合相色谱法的原理：反相键合相色谱法 反相离子对色谱法 正相键合相色谱法u化学键合相色谱法的固定相、流动相第五十三页，讲稿共五十四页哦第十八章 高效液相色谱法感谢大家观看感谢大家观看第五十四页，讲稿共五十四页哦