凝胶层析法讲稿.ppt

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1、关于凝胶层析法第一页，讲稿共一百三十三页哦n凝胶层析（凝胶层析（gel chromatography）也称：也称：分子筛层析分子筛层析 分子排阻层析分子排阻层析 凝胶过滤凝胶过滤 凝胶色谱等凝胶色谱等是指混合物随流动相经过凝胶层析柱时，由于各组分流经体积的差异，使不同分子量的组分得以分离的层析方法。第二页，讲稿共一百三十三页哦简介简介 凝胶色谱是以各种多孔性凝胶填料为固定相，利用凝胶色谱是以各种多孔性凝胶填料为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种技术。分离的一种技术。突出优点是：突出优点是：凝胶不带电荷、吸附力弱

2、、不需再生处凝胶不带电荷、吸附力弱、不需再生处理可反复使用、操作条件温和、对分离成分不变性和破坏、理可反复使用、操作条件温和、对分离成分不变性和破坏、对高分子物质有很好的分离效果。对高分子物质有很好的分离效果。第三页，讲稿共一百三十三页哦4第一节第一节 凝胶层析的基本原理凝胶层析的基本原理 n凝胶层析的分离过程是在装有多凝胶层析的分离过程是在装有多孔物质填料的柱中进行的。孔物质填料的柱中进行的。n柱的总体积为柱的总体积为V VA A，它包括填料的，它包括填料的骨架体积骨架体积V VGMGM，填料的孔体积，填料的孔体积V Vi i(内内水体积水体积)以及填料颗粒之间的体积以及填料颗粒之间的体积V

3、 V0 0（外水体积）。（外水体积）。nV VA A=V Vi i+V V0 0+V VGMGM 第四页，讲稿共一百三十三页哦 1 1、外水体积：、外水体积：指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，即凝胶指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，即凝胶颗粒间液体颗粒间液体流动相流动相的体积的体积。（用。（用VoVo表示）表示）2 2、内水体积：、内水体积：指凝胶颗粒中孔穴的体积，即凝胶层析中指凝胶颗粒中孔穴的体积，即凝胶层析中固定相固定相体体积积。（用。（用ViVi表示）表示）3 3、骨架体积：、骨架体积：指凝胶颗粒实际骨架体积。指凝胶颗粒实际骨架体积。（用（用V VGMGM表示）表示）4 4、柱的总体积：

4、、柱的总体积：指凝胶柱所能容纳的总体积指凝胶柱所能容纳的总体积。（用。（用V VA A表示）表示）5 5、洗脱体积：、洗脱体积：指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。（用积。（用Ve Ve 表示）表示）第五页，讲稿共一百三十三页哦则：则：Vt=Vo+Vi+Vg 流动相体积流动相体积固定相体积固定相体积总体积总体积第六页，讲稿共一百三十三页哦7第七页，讲稿共一百三十三页哦8原理原理n当具有一定分子量分布的高聚物溶当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时，液从柱中通过时，较小的分子在柱较小的分子在柱中停留时间比大分子停留的时间中停留时间比大分子停留

5、的时间要长，要长，于是样品各组分即按分子于是样品各组分即按分子大小顺序而分开，最先淋出的是大小顺序而分开，最先淋出的是最大的分子。最大的分子。Ve=V0+Vi Kd 第八页，讲稿共一百三十三页哦 1 1、比孔穴孔径大的分子、比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；2 2、较小的分子、较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速

6、度慢，所以最后流出；经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；3 3、分子大小介于二者之间的分子、分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间。时间介于二者之间。第九页，讲稿共一百三十三页哦第十页，讲稿共一百三十三页哦凝胶过滤层析过程示意图凝胶过滤层析过程示意图小分子小分子大分子大分子凝胶基质凝胶基质凝胶凝胶珠珠第十一页，讲稿共一百三十三页哦 分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便

7、按分子从大到小的这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。顺序依次流出，从而达到了分离的目的。第十二页，讲稿共一百三十三页哦13（一）平衡排除理论（一）平衡排除理论n当溶质层流过一个填料颗料这段距离时，溶质分当溶质层流过一个填料颗料这段距离时，溶质分子已多次进出于填料的孔，达到平衡。子已多次进出于填料的孔，达到平衡。n平衡条件只是在流速很慢时的一个极端情况。平衡条件只是在流速很慢时的一个极端情况。第十三页，讲稿共一百三十三页哦14（二）（二）扩散分离理论扩散分离理论 n溶质分子在流经色谱柱的溶质分子在流经色谱柱的过程中，在流动相和固定过程中，在流动相

8、和固定相之间没有达到平衡，存相之间没有达到平衡，存在着在着流速依赖性。流速依赖性。聚苯乙烯和苯乙烯样品淋出曲线的流速依赖性1流速为0.65ml/min；2流速为2.0ml/min溶剂为甲苯 第十四页，讲稿共一百三十三页哦15（三）（三）流动分离理论流动分离理论 n红细胞在毛血细管中流动时比血红细胞在毛血细管中流动时比血浆流得快。浆流得快。n较大的分子较先通过或绕过这个填较大的分子较先通过或绕过这个填料颗粒，使溶质能按其大小进行分料颗粒，使溶质能按其大小进行分离。离。第十五页，讲稿共一百三十三页哦16分离过程分离过程n三种不同分子量物质的三种不同分子量物质的混合样品用某种规格的混合样品用某种规格

9、的凝胶柱进行分离。凝胶柱进行分离。n样品加入，以水或其他样品加入，以水或其他溶液进行洗脱，即得洗溶液进行洗脱，即得洗脱曲线脱曲线。第十六页，讲稿共一百三十三页哦17分离过程分离过程n最先流出物质最先流出物质A，A分子量最大分子量最大，完全不能进入颗粒内，完全不能进入颗粒内部，部，只能从颗粒间隙流过只能从颗粒间隙流过，“全排阻全排阻”。其流经体。其流经体积最小，等于外水体积积最小，等于外水体积V0。n最后流出物质最后流出物质C，它，它分子量最小，分子量最小，其分子可以其分子可以自由进出自由进出凝胶颗粒，凝胶颗粒，“全渗入全渗入”。流经体积是外水体积与内水。流经体积是外水体积与内水体积之和体积之和

10、V0+Vi。n物质物质B分子量介于渗入限与排阻限之间，其分子能分子量介于渗入限与排阻限之间，其分子能够部分地进入凝胶颗粒中。够部分地进入凝胶颗粒中。“部分排阻部分排阻”或或“部部分渗入分渗入”。流径体积。流径体积Ve是全部外水体积加上内水体积是全部外水体积加上内水体积的一部分，即的一部分，即Ve=V0+KdVi 第十七页，讲稿共一百三十三页哦18分配系数分配系数Kdn排阻系数：排阻系数：n当当Kd=1时，洗脱体积时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。，为全渗入。n当当Kd=0时，洗脱体积时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。，为全排阻。n0Kd1时，洗脱体积时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi，为部

11、分渗入。，为部分渗入。第十八页，讲稿共一百三十三页哦19物质的物质的Kd值值第十九页，讲稿共一百三十三页哦20凝胶层析的特点凝胶层析的特点（1）凝胶层析操作简便，所需设备简单。）凝胶层析操作简便，所需设备简单。（2）分离效果较好，重复性高。）分离效果较好，重复性高。（3）分离条件缓和。）分离条件缓和。（4）应用广泛。）应用广泛。（5）分辨率不高，分离操作较慢。）分辨率不高，分离操作较慢。第二十页，讲稿共一百三十三页哦21第二节第二节 凝胶的结构和性质凝胶的结构和性质 一、一、葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶(Sephadex)二、修饰葡聚糖凝胶二、修饰葡聚糖凝胶(Modified Sephadex)三、三

12、、聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P）四、四、琼脂糖类凝胶琼脂糖类凝胶（Sepharose）五、多孔玻璃微球五、多孔玻璃微球(Bio-glas)六、疏水性凝胶六、疏水性凝胶（hydrophobic gels）第二十一页，讲稿共一百三十三页哦22一、葡聚糖凝胶一、葡聚糖凝胶(Sephadex)n商品名为商品名为Sephadex G类。类。n交联葡聚糖的基本骨架是葡聚糖。交联葡聚糖的基本骨架是葡聚糖。n再经再经3-氯氯-1，2-环氧丙烷为环氧丙烷为交联交联剂，剂，形成三维网状结构的高分子形成三维网状结构的高分子化合物。化合物。n其其交联度是通过交联剂的加量交联度是通过交联剂的加量及反

13、应条件来控制的。及反应条件来控制的。第二十二页，讲稿共一百三十三页哦交联葡聚糖凝胶的化学结构交联葡聚糖凝胶的化学结构 第二十三页，讲稿共一百三十三页哦 葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反应条葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制。交联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越小。交联度越小，件来控制。交联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越小。交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大网孔越大，吸水膨胀就越大 。G G类葡聚糖凝胶常用类葡聚糖凝胶常用G-XG-X代表，代表，X X数字既代表交联度，也代表特数字既代表交联度，也代表特水量。水量。X X数字越小，交联度越大，网孔

14、越小，适用于分离低分子质数字越小，交联度越大，网孔越小，适用于分离低分子质量生化产品。量生化产品。X X数字越大，交联度越小，网孔越大，适用于分离高数字越大，交联度越小，网孔越大，适用于分离高分子生化产品。分子生化产品。X X数字也代表凝胶的持水量，数字也代表凝胶的持水量，如如G-25G-25表示表示1g1g干胶持干胶持水水2.5mL2.5mL，G-100G-100表示表示 1g1g干胶持水干胶持水10mL10mL，依次类推。，依次类推。第二十四页，讲稿共一百三十三页哦25Sephadex G编号意义：编号意义：1、吸液量；、吸液量；2、溶涨时间；、溶涨时间；3、凝胶孔径凝胶孔径；4、分离范围

15、分离范围 蛋白质、多糖蛋白质、多糖第二十五页，讲稿共一百三十三页哦26葡聚糖凝胶性能与编号的关系葡聚糖凝胶性能与编号的关系编号交联度吸液量膨胀速度凝胶孔径分离限凝胶强度大（Sephadex G150）小大慢大大小小（Sephadex G 50）大小快小小大第二十六页，讲稿共一百三十三页哦27葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（G类）的规格类）的规格第二十七页，讲稿共一百三十三页哦28葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（G类）特点类）特点1、孔径孔径。2、稳定性。、稳定性。3、吸附作用吸附作用。4、芳香族化合物和杂环化合物。、芳香族化合物和杂环化合物。第二十八页，讲稿共一百三十三页哦 1 1、SephadexSepha

16、dex在水、盐、碱、弱酸以及有机溶液中都在水、盐、碱、弱酸以及有机溶液中都比较稳定，可以多次重复使用。比较稳定，可以多次重复使用。2 2、稳定工作、稳定工作pHpH为为2 21010，强酸溶液和氧化剂会使，强酸溶液和氧化剂会使交联的糖苷键水解断裂。交联的糖苷键水解断裂。3 3、在高温下稳定，可煮沸消毒，在、在高温下稳定，可煮沸消毒，在100 100 C C下下40 40 minmin对凝胶的结构和性能都没有明显的影响。对凝胶的结构和性能都没有明显的影响。性质与特点性质与特点第二十九页，讲稿共一百三十三页哦 4 4、含有羟基，呈弱酸性，有可能与分离物中的一、含有羟基，呈弱酸性，有可能与分离物中的

17、一些带电基团（尤其是碱性蛋白）发生吸附作用。但一些带电基团（尤其是碱性蛋白）发生吸附作用。但一般在离子强度大于般在离子强度大于0.050.05的条件下，几乎没有吸附作用。的条件下，几乎没有吸附作用。5 5、有各种颗粒大小（粗、中、细、超细）可以选、有各种颗粒大小（粗、中、细、超细）可以选择，择，一般粗颗粒流速快，但分辨率较差；细颗粒流速一般粗颗粒流速快，但分辨率较差；细颗粒流速慢，但分辨率高。慢，但分辨率高。6 6、机械稳定性相对较差，不耐压，分辨率高的细颗粒、机械稳定性相对较差，不耐压，分辨率高的细颗粒要求流速较慢，所以不能实现快速而高效的分离。要求流速较慢，所以不能实现快速而高效的分离。第

18、三十页，讲稿共一百三十三页哦31保存保存n保存的方法有保存的方法有干法、湿法和半缩法干法、湿法和半缩法三种。三种。n湿法：湿法：加入一定量的防腐剂置于冰箱中作短期保存加入一定量的防腐剂置于冰箱中作短期保存（6个月以内）。个月以内）。n常用常用0.02%叠氮化钠叠氮化钠、0.02%三氯叔丁醇、三氯叔丁醇、20%乙醇等。乙醇等。n干法：干法：用浓度逐渐升高的乙醇分步处理洗净的凝胶，用浓度逐渐升高的乙醇分步处理洗净的凝胶，脱水收缩，抽滤，用脱水收缩，抽滤，用6080吹干。吹干。n半缩法：半缩法：第三十一页，讲稿共一百三十三页哦32二、修饰葡聚糖凝胶二、修饰葡聚糖凝胶(Modified Sephade

19、x)（一）（一）亲脂性葡聚糖凝胶亲脂性葡聚糖凝胶（Lipophilic Sephadex）骨架结构上引入一些有机基团，如甲基、羟丙基，使呈亲脂性，骨架结构上引入一些有机基团，如甲基、羟丙基，使呈亲脂性，同时保留亲水性。同时保留亲水性。这种凝胶既亲脂又亲水，可在多种有机溶剂中膨胀。这种凝这种凝胶既亲脂又亲水，可在多种有机溶剂中膨胀。这种凝胶在胶在pH2的不含氧化剂的溶液中稳定。用低级醇为溶剂时，对的不含氧化剂的溶液中稳定。用低级醇为溶剂时，对芳香族、杂环族化合物仍有吸附作用。但用氯仿时则可去除对上芳香族、杂环族化合物仍有吸附作用。但用氯仿时则可去除对上述化合物的吸附作用，而对含羟基与羧基的化合物

20、却有吸附作用述化合物的吸附作用，而对含羟基与羧基的化合物却有吸附作用。第三十二页，讲稿共一百三十三页哦 国产国产Sephadex LHSephadex LH2020可用于分子筛层析、吸附层析和可用于分子筛层析、吸附层析和分配层析。很适用于脂肪酸、甘油脂、类固醇、维生素、分配层析。很适用于脂肪酸、甘油脂、类固醇、维生素、激素类生化产品的分离。洗脱剂可用单一有机溶剂如甲醇、激素类生化产品的分离。洗脱剂可用单一有机溶剂如甲醇、氯仿等，也可用混合溶剂如氯仿与甲醇的混合液。氯仿等，也可用混合溶剂如氯仿与甲醇的混合液。第三十三页，讲稿共一百三十三页哦（二）葡聚糖凝胶离子交换剂（二）葡聚糖凝胶离子交换剂 在

21、在G G类凝胶上引入一些酸性或碱性基团后，则制得类凝胶上引入一些酸性或碱性基团后，则制得各种葡聚糖凝胶离子交换剂各种葡聚糖凝胶离子交换剂 。如引入磺乙基（如引入磺乙基（SE-SephadexSE-Sephadex）、羧甲基（）、羧甲基（CM-SephadexCM-Sephadex）及二乙胺基）及二乙胺基乙基（乙基（DEAE-Sephadex ADEAE-Sephadex A）等。葡聚糖凝胶离子交换剂具有离子交换和分）等。葡聚糖凝胶离子交换剂具有离子交换和分子筛双重作用。其结构多孔、疏松、非特异性吸附很少，层析时流速易控子筛双重作用。其结构多孔、疏松、非特异性吸附很少，层析时流速易控制，特别适用

22、于蛋白质、酶、激素、多核苷酸等的分离纯化，以及生化制制，特别适用于蛋白质、酶、激素、多核苷酸等的分离纯化，以及生化制剂的除热原。剂的除热原。第三十四页，讲稿共一百三十三页哦35交联葡聚糖离子交换剂交联葡聚糖离子交换剂第三十五页，讲稿共一百三十三页哦36 （三）（三）Supperdex系凝胶系凝胶由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而成。由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而成。（四）（四）Sephacryl系凝胶系凝胶是由烯丙烷基葡聚糖经甲叉双丙烯酰胺共价交联制是由烯丙烷基葡聚糖经甲叉双丙烯酰胺共价交联制成的。成的。理化稳定性好，为硬性凝胶，可耐高压灭菌。理化稳定性好，为硬性凝胶，可耐高压灭菌

23、。第三十六页，讲稿共一百三十三页哦37Supperdex系凝胶系凝胶第三十七页，讲稿共一百三十三页哦38Sephacryl系凝胶系凝胶第三十八页，讲稿共一百三十三页哦39三、聚丙烯酰胺凝胶三、聚丙烯酰胺凝胶 n商品名为商品名为生物凝胶生物凝胶-P-P（Bio-Gel PBio-Gel P）。）。n该凝胶由该凝胶由丙烯酰胺丙烯酰胺组成；以组成；以亚甲基双丙烯亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，酰胺为交联剂，聚合而成。只要控制单体聚合而成。只要控制单体用量和交联剂的比例，就能得到不同型号用量和交联剂的比例，就能得到不同型号的凝胶。的凝胶。n特点特点：1、孔径；孔径；2、稳定性、强度；、稳定性、强度；3、无非

24、特异吸附，保存方便；、无非特异吸附，保存方便；4、编号反映出它的分离界限编号反映出它的分离界限。第三十九页，讲稿共一百三十三页哦在聚丙烯酰胺凝胶的合成过程中，单体和交联剂的配比可以在聚丙烯酰胺凝胶的合成过程中，单体和交联剂的配比可以任意改变。以（任意改变。以（T T）代表）代表100mL100mL凝胶溶液中含有的单体和交联剂总凝胶溶液中含有的单体和交联剂总克数，称为克数，称为凝胶浓度凝胶浓度。而其中交联剂占单体和交联剂总量的百分。而其中交联剂占单体和交联剂总量的百分比称为比称为交联度交联度，以（，以（C C）表示，交联度越大，网孔越小，交联度越小，）表示，交联度越大，网孔越小，交联度越小，则网

25、孔越大。聚丙烯酰胺凝胶全是由碳一碳骨架构成，稳定性较好，适则网孔越大。聚丙烯酰胺凝胶全是由碳一碳骨架构成，稳定性较好，适合于做凝胶层析的载体。只有在极端合于做凝胶层析的载体。只有在极端pHpH条件下酰胺键才被水解为羧基，条件下酰胺键才被水解为羧基，使凝胶带有一定的离子交换基团，故一般只在使凝胶带有一定的离子交换基团，故一般只在pH2pH21111的范围内使用。的范围内使用。第四十页，讲稿共一百三十三页哦 像Sephadex一样，商品聚丙烯酰胺为颗粒状的干粉，它有十分明显形成块状并粘附在一起的倾向，在溶剂中能自动溶胀成胶。根据聚丙烯酰胺凝胶的溶胀性质和分离范围的不同，可分成10种类型。各种类型均

26、以英文字母P和阿拉伯数字表示，从Bio-Gel P-2至Bio-Ge1 P-300。P后面的阿拉伯数字乘以1000即相当于排阻限度（按球蛋白或肽计算）。目前，美国Bio-Rad Laboratories生产并出售多种规格的Bio-Gel P。第四十一页，讲稿共一百三十三页哦42聚丙烯酰胺凝胶的性质聚丙烯酰胺凝胶的性质 n生物凝胶的编号反映出它的分离界限。生物凝胶的编号反映出它的分离界限。n如如Bio-Gel P-100。第四十二页，讲稿共一百三十三页哦43四、琼脂糖类凝胶四、琼脂糖类凝胶（Sepharose）（一）琼脂糖凝胶（一）琼脂糖凝胶n结构是由结构是由-D-半乳糖半乳糖与与3，6-脱水脱

27、水-L-半乳糖半乳糖以以-1，3-和和-1，4-糖苷键相间连接而成的链状分子。糖苷键相间连接而成的链状分子。第四十三页，讲稿共一百三十三页哦SepharoseSepharose琼脂糖凝胶（琼脂糖凝胶（agarose gelagarose gel）可以分离葡聚糖凝胶和）可以分离葡聚糖凝胶和生物胶所不能分离的大分子，生物胶所不能分离的大分子，使凝胶层析的分离区间扩大使凝胶层析的分离区间扩大到大分子和病毒颗粒，其最大范围可达相对分子质量到大分子和病毒颗粒，其最大范围可达相对分子质量10108 8，但但是由于琼脂有强烈的吸附作用，给使用造成了困难，后来，是由于琼脂有强烈的吸附作用，给使用造成了困难，后

28、来，从琼脂中分离出两个组分，一个组分为带负电荷的琼脂果胶，从琼脂中分离出两个组分，一个组分为带负电荷的琼脂果胶，含有磺酸基和羧基；另一组分叫琼脂糖，它不含有带电基团，含有磺酸基和羧基；另一组分叫琼脂糖，它不含有带电基团，其结构是有其结构是有-D-吡喃半乳糖和吡喃半乳糖和3，6脱水脱水-L-吡喃半乳糖相结合吡喃半乳糖相结合的链状多糖。的链状多糖。第四十四页，讲稿共一百三十三页哦这种琼脂糖被用来进行凝胶层析，它既具有琼脂凝胶相同这种琼脂糖被用来进行凝胶层析，它既具有琼脂凝胶相同的分离区间，又没有吸附作用。但其稳定性远不如葡聚糖的分离区间，又没有吸附作用。但其稳定性远不如葡聚糖凝胶和生物胶凝胶和生物

29、胶P P，强酸强碱能引起结构破坏。最好使用条件，强酸强碱能引起结构破坏。最好使用条件控制在控制在pH 4pH 49 9之间，温度之间，温度0 04040，超出此范围，超出此范围,可能被破可能被破坏。坏。第四十五页，讲稿共一百三十三页哦46琼脂糖凝胶特点：琼脂糖凝胶特点：1、没有共价键的交联。、没有共价键的交联。2、孔径依赖于琼脂糖的浓度。孔径依赖于琼脂糖的浓度。3、琼脂糖凝胶的化学稳定性较差。、琼脂糖凝胶的化学稳定性较差。4、非特异性吸附力低。、非特异性吸附力低。5、分离范围大分离范围大。6、颗粒强度差颗粒强度差。第四十六页，讲稿共一百三十三页哦 琼脂糖的商品名称有琼脂糖的商品名称有:Seph

30、arose(Sepharose(瑞典瑞典)Bio-gel A(Bio-gel A(美国美国)Segavac(Segavac(英国英国)Gelarose(Gelarose(丹麦丹麦)等多种，因生产厂家不同名称各异。等多种，因生产厂家不同名称各异。第四十七页，讲稿共一百三十三页哦 琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶。它的商品名因生产厂家不同而异。瑞典的商品名称为Sepharose，有3种型号，即Sepharose 2B，4B和6B（同中国相同）。阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分含量。美国的为BioGA，有6个型号，即Bio-G 0.5M，1.5M，5M，15M，50M和150M。阿拉伯数字乘以1

31、06表示排阻限度。第四十八页，讲稿共一百三十三页哦 英国的称为Sagavac，又分为Sagavac 2F，4F，6F，8F，10F和2C，4C，6C，8C，10C。前面的阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分数，F代表粉末状，C代表颗粒状。丹麦的称为Gelarose，有5种类型，即2，4，6%，8和10。第四十九页，讲稿共一百三十三页哦 琼脂糖凝胶做成珠状后不再脱水干燥，否则不能再溶胀恢复原有形状，因此商品大都以含水状态供应，并应在湿态保存。一般悬浮在l0-3 mo1/L EDTA和0.02%叠氮化钠溶液中。百分数表示干胶量。第五十页，讲稿共一百三十三页哦51琼脂糖凝胶分离范围琼脂糖凝胶分离范围琼脂糖

32、凝胶有琼脂糖凝胶有3个规格：个规格：Sepharose2B、4B、6B分别表示琼脂糖分别表示琼脂糖浓度为浓度为2%，4%，6%。第五十一页，讲稿共一百三十三页哦52几种蛋白质Kav值 第五十二页，讲稿共一百三十三页哦53（二）架桥琼脂糖凝胶（二）架桥琼脂糖凝胶（Sepharose CL）n架桥琼脂糖凝胶为琼脂线性分子架桥琼脂糖凝胶为琼脂线性分子经经1，3-二溴丙醇二溴丙醇交联的凝胶。交联的凝胶。n它的凝胶孔径均匀，它的凝胶孔径均匀，机械强度机械强度明显加大。明显加大。n对热和化学物质的稳定性大大对热和化学物质的稳定性大大增加增加,在在pH314范围内稳定范围内稳定。第五十三页，讲稿共一百三十三

33、页哦54Sepharose CL的性质 第五十四页，讲稿共一百三十三页哦55（三）超胶（三）超胶（Utro-gel ACA）n所谓超胶是所谓超胶是琼脂糖与聚丙烯酰胺琼脂糖与聚丙烯酰胺的混合凝胶。的混合凝胶。n商品名称后面的编号为两位数，各商品名称后面的编号为两位数，各表示混合胶中聚表示混合胶中聚丙烯酰胺与琼脂糖的百分浓度。丙烯酰胺与琼脂糖的百分浓度。第五十五页，讲稿共一百三十三页哦56（四）（四）Superose系凝胶系凝胶 n是由珠状琼脂糖经两次交联制得的可用于是由珠状琼脂糖经两次交联制得的可用于HPLC的的高高速速凝胶过滤介质。凝胶过滤介质。n有有6%和和12%两个规格。两个规格。第五十六

34、页，讲稿共一百三十三页哦57五、多孔玻璃微球五、多孔玻璃微球(Bio-glas)特点：特点：1、化学稳定性高、化学稳定性高、强度大。强度大。2、对糖类、蛋白质等物质有吸附作用。对糖类、蛋白质等物质有吸附作用。3、编号表示其、编号表示其孔径孔径,越大，分离分子量也越大。越大，分离分子量也越大。第五十七页，讲稿共一百三十三页哦58六、疏水性凝胶（六、疏水性凝胶（hydrophobic gels）常见的有：聚甲基丙烯酸酯凝胶和聚苯乙烯凝胶。常见的有：聚甲基丙烯酸酯凝胶和聚苯乙烯凝胶。Styragel商品商品,分离范围为分离范围为1 60040 000 000。生物珠生物珠（Bio-Bead S），适

35、于分离分子量较小的物质。），适于分离分子量较小的物质。分离不溶水的有机物质分离不溶水的有机物质。第五十八页，讲稿共一百三十三页哦59常用的商品化凝胶介质常用的商品化凝胶介质 第五十九页，讲稿共一百三十三页哦60一第六十页，讲稿共一百三十三页哦第三节第三节 凝胶层析的实验条件和操作凝胶层析的实验条件和操作 61第六十一页，讲稿共一百三十三页哦62凝胶层析的实验条件和操作凝胶层析的实验条件和操作 一、凝胶的选择和处理一、凝胶的选择和处理 二、凝胶层析柱的设计和制备二、凝胶层析柱的设计和制备 三、凝胶层析操作三、凝胶层析操作 四、主要参数测算四、主要参数测算 第六十二页，讲稿共一百三十三页哦63一、

36、凝胶的选择和处理一、凝胶的选择和处理（一）凝胶的选择（一）凝胶的选择 选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。选取何种凝胶及其型号、粒度，一方面要考虑凝胶证。选取何种凝胶及其型号、粒度，一方面要考虑凝胶的性质，包括凝胶的分离范围（渗入限与排阻限）还有的性质，包括凝胶的分离范围（渗入限与排阻限）还有它的理化稳定性、强度、非特异吸附性质等；另一方面它的理化稳定性、强度、非特异吸附性质等；另一方面还要注意到分离目的和样品的性质。还要注意到分离目的和样品的性质。第六十三页，讲稿共一百三十三页哦 凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。凝胶粒度的大小对分

37、离效果有直接的影响。般来说，细粒凝胶柱般来说，细粒凝胶柱流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析等。粗粒凝胶流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析等。粗粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离，脱盐等。下图柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离，脱盐等。下图表示在同一流速下不同粒度的表示在同一流速下不同粒度的Sephadex G-25Sephadex G-25柱的洗脱效果。柱的洗脱效果。凝胶粒度与洗脱效果的关系图凝胶粒度与洗脱效果的关系图 第六十四页，讲稿共一百三十三页哦 对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式。一对生物样品来说，经常遇到的是两种

38、分离形式。一种是只将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与种是只将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作盐类，称作类分离类分离或或组分离组分离。另一类则是要将分子量相。另一类则是要将分子量相差不很大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与差不很大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做白蛋白，这叫做分级分离分级分离。后者对实验条件和操作要求都。后者对实验条件和操作要求都比较高。下面以最常用的葡聚糖凝胶类为例，分别加以讨比较高。下面以最常用的葡聚糖凝胶类为例，分别加以讨论论 。第六十五页，讲稿共一百三十三页哦66将分子量极为悬殊的两类物质分开，将分子量极为悬殊的两类物

39、质分开，如蛋如蛋白质与盐类，称作白质与盐类，称作类分离或组分离类分离或组分离。将分子量相差不大的大分子物质加以分离将分子量相差不大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分级分离分离。第六十六页，讲稿共一百三十三页哦1 1类分离类分离 目的是分开样品中分子量悬殊的目的是分开样品中分子量悬殊的“较大分子组较大分子组”和和“较小分子组较小分子组”两类物质，并不要求分离分子量相两类物质，并不要求分离分子量相近的组分。近的组分。选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限，而小分子组的分子量小于渗入限。也于

40、其排阻限，而小分子组的分子量小于渗入限。也就是说大分子的分配系数就是说大分子的分配系数Kd=0Kd=0，小分子的，小分子的KdKd1 1。这样能取得最好这样能取得最好的分离效果的分离效果。第六十七页，讲稿共一百三十三页哦例如从蛋白质溶液中除去无机盐。我们知道，蛋白质的分子例如从蛋白质溶液中除去无机盐。我们知道，蛋白质的分子量都大于量都大于5000D5000D，而无机盐的分子量一般在几十到几百之间。，而无机盐的分子量一般在几十到几百之间。所以常选用所以常选用Sephadex G-25Sephadex G-25凝胶作为分离固定相，因为它凝胶作为分离固定相，因为它的分离范围是的分离范围是100010

41、005000D5000D。被分离的两组物质的分子。被分离的两组物质的分子量正好落在分离范围的两侧。大分子组为全排阻，而量正好落在分离范围的两侧。大分子组为全排阻，而小分子组为全渗入，其小分子组为全渗入，其KdKd值的差可达最大值值的差可达最大值1 1。对于分。对于分子量小于子量小于5000D5000D的肽类进行脱盐操作则常选用的肽类进行脱盐操作则常选用Sephadex G-Sephadex G-1515凝胶。凝胶。第六十八页，讲稿共一百三十三页哦691类分离类分离（1）使大分子的分配系数）使大分子的分配系数Kd=0；（2）小分子的）小分子的Kd=1。选用选用Sephadex G-25凝胶，分离

42、范围凝胶，分离范围1 0005 000。第六十九页，讲稿共一百三十三页哦2分级分离 目的是分开分子量不很悬殊的大分子物质。选择凝胶型号时必须使各种物质的Kd值尽可能相差大一些。为此，首先决不能使它们的分子量都分布在凝胶分离范围的一侧，也就是Kd不要都接近于0或1，而要使组分的分子量尽可能分布在凝胶分离范围的两侧，或接近两侧的位置。如果样品中含有3个组分的话，最好一个接近全排阻，另一个接近全渗入，第三个为部分渗入，且分子量大于渗入限的3倍，并小于排阻限的13。第七十页，讲稿共一百三十三页哦因为分子量如与渗入限比较靠近，该组分分子在凝胶颗因为分子量如与渗入限比较靠近，该组分分子在凝胶颗粒中运动所受

43、的约束很小，不易与低分子组分分开。如粒中运动所受的约束很小，不易与低分子组分分开。如分子量与排阻限比较靠近则不易与高分子组分分开。如分子量与排阻限比较靠近则不易与高分子组分分开。如用用Sephadex G-200Sephadex G-200分离血清蛋白质的效果要比分离血清蛋白质的效果要比Sephadex Sephadex G-150G-150为好。但也有人选用为好。但也有人选用G-150G-150，那是因为，那是因为G-200G-200强度太强度太低不便操作的缘故（见下图）。低不便操作的缘故（见下图）。第七十一页，讲稿共一百三十三页哦不同分离范围的葡聚糖凝胶上，血清蛋白的层析图第七十二页，讲稿

44、共一百三十三页哦732分级分离分级分离（1 1）使各种物质的）使各种物质的Kd值尽可能相差大。值尽可能相差大。（2 2）不使分子量分布在凝胶分离范围的一侧。）不使分子量分布在凝胶分离范围的一侧。（3 3）分子量大于渗入限的分子量大于渗入限的3倍，并小于排阻限倍，并小于排阻限的的1/3。如用如用Sephadex G-200分离血清蛋白质分离血清蛋白质的效果的效果要比要比Sephadex G-150为好。为好。第七十三页，讲稿共一百三十三页哦74（二）凝胶粒度的选择（二）凝胶粒度的选择n细粒凝胶柱流速低，洗脱峰细粒凝胶柱流速低，洗脱峰窄，分辨率高窄，分辨率高，用于精制分，用于精制分离或分析。离或分

45、析。n粗粒凝胶柱流速高，洗脱峰粗粒凝胶柱流速高，洗脱峰平坦，分辨率低，用于粗制平坦，分辨率低，用于粗制分离，脱盐。分离，脱盐。第七十四页，讲稿共一百三十三页哦凝胶颗粒大小一般分为粗、中、细和超细四类。颗粒凝胶颗粒大小一般分为粗、中、细和超细四类。颗粒越细，分离效果越好，因为它容易达到平衡，但流速慢。越细，分离效果越好，因为它容易达到平衡，但流速慢。颗粒越粗，流速越快，会使区带扩散，使洗脱峰变平变颗粒越粗，流速越快，会使区带扩散，使洗脱峰变平变宽。在一般柱层析中，使用干颗粒直径在宽。在一般柱层析中，使用干颗粒直径在70m70m左右较合左右较合适。对于在水中保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在适。对

46、于在水中保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在150m150m左右。凝胶颗粒大小要均匀，这样流速稳定，效果左右。凝胶颗粒大小要均匀，这样流速稳定，效果较好。较好。第七十五页，讲稿共一百三十三页哦76（三）凝胶的预处理（三）凝胶的预处理n使用前须使用前须溶涨溶涨，使干胶颗粒充分吸收溶剂，并达到，使干胶颗粒充分吸收溶剂，并达到平衡。平衡。n干胶以干胶以10倍以上吸液量的溶剂浸泡。倍以上吸液量的溶剂浸泡。n热法溶涨热法溶涨(水浴中加热溶胀水浴中加热溶胀)。第七十六页，讲稿共一百三十三页哦 葡聚糖凝胶和生物胶多以干粉形式保存，使用前葡聚糖凝胶和生物胶多以干粉形式保存，使用前需用水或洗脱缓冲液充分溶账。在室

47、温下让其充分溶需用水或洗脱缓冲液充分溶账。在室温下让其充分溶账胀达到平衡，通常需要较长时间。账胀达到平衡，通常需要较长时间。较快的做法是将干胶往水里加，边加边搅，以防较快的做法是将干胶往水里加，边加边搅，以防凝胶结块，然后放到沸水浴中加热接近凝胶结块，然后放到沸水浴中加热接近100100，几个小，几个小时就可以使其溶胀，还可起到除去颗粒内部气泡和杀时就可以使其溶胀，还可起到除去颗粒内部气泡和杀菌作用。菌作用。第七十七页，讲稿共一百三十三页哦78二、凝胶层析柱的设计和制备二、凝胶层析柱的设计和制备（一）层析柱的选择（一）层析柱的选择层析柱长度与直径的比值称作层析柱长度与直径的比值称作“柱比柱比”

48、。对于类分离对于类分离，柱床体积一般为样品溶液体积的，柱床体积一般为样品溶液体积的5倍，倍，柱柱比比5:1到到10:1即可。即可。对于分级分离，对于分级分离，则要求柱床体积大于样品体积则要求柱床体积大于样品体积25倍以上，倍以上，甚至多达甚至多达100倍。倍。柱比在柱比在25至至100之间。之间。第七十八页，讲稿共一百三十三页哦79凝胶柱床大小与所需凝胶量的关系凝胶柱床大小与所需凝胶量的关系 第七十九页，讲稿共一百三十三页哦80（二）凝胶柱的装填（二）凝胶柱的装填n常用的常用的支持物支持物有棉花、玻璃纤维、玻璃珠、垂熔玻有棉花、玻璃纤维、玻璃珠、垂熔玻璃等。璃等。n空柱中应留约空柱中应留约1/

49、5的水或溶剂。的水或溶剂。n不断搅拌下使胶粒不断搅拌下使胶粒均匀沉降均匀沉降，使不发生凝胶分层和，使不发生凝胶分层和胶面倾斜。胶面倾斜。第八十页，讲稿共一百三十三页哦一般选用细长的柱作凝胶过滤。进行脱盐时，柱高50cm比较合适；分级分离时，100cm就足够了。一般是在柱内先装入约1/3高度的水或缓冲液，然后将溶胀好的凝胶在搅拌成稀浆的情况下慢慢倒入柱内，使其自然沉降。如此连续操作，可以得到一个均匀的柱床。柱装得不好往往造成洗脱区带加宽，甚至使一些本来可以分开的区带重叠。如装柱时的操作压力太大，会使凝胶床压得太实，从而降低流速。第八十一页，讲稿共一百三十三页哦 层析柱层析柱（a）自制简易层祈柱（

50、1玻璃管；2.橡皮塞；3尼龙网）；（b）普通商品柱；（c）双底板层析柱（1.洗脱液进出口；2.多孔底板；3柱床；4恒温水进口；5恒温水出口；6可调节的塞子）第八十二页，讲稿共一百三十三页哦 层析系统连接示意图 1密封橡皮塞；2恒压管；3.恒压瓶；4.层析流出液；5可调螺旋夹；6.自动收集器；7.核酸一蛋白质检测仪第八十三页，讲稿共一百三十三页哦 BSBS100100自动部分收集器安装圈自动部分收集器安装圈1反全阀；2.换管臂；3.滴管；4、5.换管臂固定螺丝；6.竖杆；7.竖杆囤定螺丝；8.报警板；9.试管；10收集盘；11.时间选挥旋钮；12.时间选择固定螺钉；13.自动开关；14.指示灯；