外源基因表达系统课件.ppt

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1、外源基因表达系统2022-9-5现在学习的是第1页，共71页 基因工程所用的宿主菌基因工程所用的宿主菌,皆经过人工改造皆经过人工改造原因是原因是 野生型细菌具有针对外源野生型细菌具有针对外源DNA的限制和修饰系统的限制和修饰系统,会会切割未经修饰的外源切割未经修饰的外源DNA.经过改造的宿主菌一般具备下列特点经过改造的宿主菌一般具备下列特点 限制系统缺陷型限制系统缺陷型:不切割外源不切割外源DNA.DNA.重组缺陷型重组缺陷型:避免外源避免外源DNADNA与宿主与宿主DNADNA的重组的重组.转化亲和型转化亲和型:改变细胞壁的通透性改变细胞壁的通透性,提高转化效率提高转化效率.2022-9-5

2、2现在学习的是第2页，共71页第一节第一节 大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统一一.大肠杆菌表达体系的优点：大肠杆菌表达体系的优点：外源基因可以高水平表达外源基因可以高水平表达培养方便、价廉、可大规模生产培养方便、价廉、可大规模生产生物学、遗传学背景清楚生物学、遗传学背景清楚 安全性好安全性好 寄主菌株及载体较多寄主菌株及载体较多2022-9-53现在学习的是第3页，共71页大肠杆菌大肠杆菌2022-9-54现在学习的是第4页，共71页二二.大肠杆菌的表达条件大肠杆菌的表达条件 克隆的真核基因必须连续，无内含子序列。克隆的真核基因必须连续，无内含子序列。大肠杆菌不能识别真核启动子，外源基因须置于

3、原大肠杆菌不能识别真核启动子，外源基因须置于原核启动子的控制之下。常用的启动子有核启动子的控制之下。常用的启动子有 Lac、trp、tac、T7、PL等。等。强启动子强启动子 外源蛋白质的表达占菌体总蛋外源蛋白质的表达占菌体总蛋 白质的白质的10-30。2022-9-55现在学习的是第5页，共71页启动子有关知识启动子有关知识 大肠杆菌的启动子是控制外源基因转录的重要元件，大肠杆菌的启动子是控制外源基因转录的重要元件，基因表达程度与启动子的强弱密切相关。基因表达程度与启动子的强弱密切相关。启动子的强弱主要取决于启动子的强弱主要取决于启动子本身的序列，尤其是启动子本身的序列，尤其是10区区(TA

4、TAA)和和35区区(TTGACA)的组成。的组成。在真核基因中发现了类似在真核基因中发现了类似Pribnow框的共同序框的共同序列，即位于列，即位于2530 bp处的处的TATAAAAG，也称也称TATA框框(TATAbox)。2022-9-56现在学习的是第6页，共71页常用的大肠杆菌启动子常用的大肠杆菌启动子 Plac 来源于乳糖操纵子来源于乳糖操纵子 Ptrp来源于色氨酸操纵子来源于色氨酸操纵子 PL来源于来源于噬菌体早期操纵子噬菌体早期操纵子 PrecA来源于来源于recA基因基因2022-9-57现在学习的是第7页，共71页启动子的可控性启动子的可控性 目前使用的大肠杆菌启动子，一

5、般含有与目前使用的大肠杆菌启动子，一般含有与阻遏蛋白特异性结合的序列，因此由这些启动阻遏蛋白特异性结合的序列，因此由这些启动子介导的外源基因在大肠杆菌细胞内通常是痕子介导的外源基因在大肠杆菌细胞内通常是痕量表达的。例如在不含乳糖的培养基内，量表达的。例如在不含乳糖的培养基内，Plac 启动子处于阻遏状态，外源基因极少表达。启动子处于阻遏状态，外源基因极少表达。2022-9-58现在学习的是第8页，共71页 当重组大肠杆菌生长到某一阶段，向培养物中加当重组大肠杆菌生长到某一阶段，向培养物中加入乳糖或入乳糖或IPTG（异丙基硫代半乳糖苷异丙基硫代半乳糖苷 isopropylthiogalactos

6、ide，IPTG),它们特异性它们特异性的与阻遏蛋白结合，使之从操纵子上脱落下来，的与阻遏蛋白结合，使之从操纵子上脱落下来，启动子打开并启动外源基因转录。（化学诱导）启动子打开并启动外源基因转录。（化学诱导）2022-9-59现在学习的是第9页，共71页温度诱导温度诱导PL启动子启动子 将工程菌先置于将工程菌先置于300进行培养，在此进行培养，在此温度范围内，由大肠杆菌合成的温度范围内，由大肠杆菌合成的CI 857阻遏蛋阻遏蛋白与白与PL的操纵子区域结合，关闭外源基因的转录。的操纵子区域结合，关闭外源基因的转录。当工程菌培养到合适的生长阶段，（一般为对数生当工程菌培养到合适的生长阶段，（一般为

7、对数生长中期）时，迅速将培养温度提高到长中期）时，迅速将培养温度提高到42 0，此，此时时CI 857失活，从操纵子上脱落下来，失活，从操纵子上脱落下来，PL启动子启动子遂启动外源基因转录。遂启动外源基因转录。2022-9-510现在学习的是第10页，共71页 化学诱导与温度诱导在实验室规化学诱导与温度诱导在实验室规模比较容易做到，（发酵罐模比较容易做到，（发酵罐15升）。升）。但在工业化生产时（发酵罐数十升但在工业化生产时（发酵罐数十升数百升乃至数千升），生产成本很高。数百升乃至数千升），生产成本很高。2022-9-511现在学习的是第11页，共71页 为解决此问题，可对工程菌进行改造。为解

8、决此问题，可对工程菌进行改造。例如：采用双质粒表达系统将例如：采用双质粒表达系统将CI 857阻遏蛋白编阻遏蛋白编码基因置于码基因置于Ptrp启动子之下，克隆在一个低表达质启动子之下，克隆在一个低表达质粒上，从而保证阻遏蛋白表达较低；第二个重组质粒粒上，从而保证阻遏蛋白表达较低；第二个重组质粒则含有则含有PL启动子控制的目的基因。当培养基中缺启动子控制的目的基因。当培养基中缺少色氨酸时，少色氨酸时，Ptrp打开，打开，CI 857 阻遏蛋白生成，阻遏蛋白生成，由由PL介导的目的基因不表达；相反，当色氨酸大量介导的目的基因不表达；相反，当色氨酸大量存在时，存在时，Ptrp启动子关闭，启动子关闭，

9、CI 阻遏蛋白不再生成，阻遏蛋白不再生成，PL开放。开放。2022-9-512现在学习的是第12页，共71页 此工程菌可用糖蜜和酪蛋白水解物组成的此工程菌可用糖蜜和酪蛋白水解物组成的廉价培养基进行发酵，内含微量的色氨酸，欲廉价培养基进行发酵，内含微量的色氨酸，欲使外源基因表达时，可加入富含色氨酸的胰蛋使外源基因表达时，可加入富含色氨酸的胰蛋白胨进行诱导。白胨进行诱导。2022-9-513现在学习的是第13页，共71页原核表达存在的问题原核表达存在的问题翻译后的加工修饰翻译后的加工修饰 真核细胞的某些蛋白质翻译合成后，还需要真核细胞的某些蛋白质翻译合成后，还需要加工和修饰，如糖基化，但大肠杆菌细

10、胞无此功加工和修饰，如糖基化，但大肠杆菌细胞无此功能。能。细菌蛋白酶的存在细菌蛋白酶的存在 细菌蛋白酶对外源蛋白质的切割细菌蛋白酶对外源蛋白质的切割2022-9-514现在学习的是第14页，共71页真核基因在大肠杆菌细胞中表达的部位1.表达产物存在的部位表达产物存在的部位 细胞质；细胞质；细胞周质；细胞周质；分泌到细胞外分泌到细胞外 细胞质中表达：细胞质中表达：包涵体（包涵体（inclusion body):细胞质中不溶性的细胞质中不溶性的蛋白质聚集形成的颗粒。蛋白质聚集形成的颗粒。2022-9-515现在学习的是第15页，共71页 优点：优点：形成包涵体，易于纯化分离，抵抗细菌蛋白酶形成包涵

11、体，易于纯化分离，抵抗细菌蛋白酶的水解；对寄主无毒害的水解；对寄主无毒害 蛋白质产量高蛋白质产量高 表达载体构建比较简单表达载体构建比较简单2022-9-516现在学习的是第16页，共71页缺点：缺点：形成包涵体的外源蛋白质，一般没有生物活性。形成包涵体的外源蛋白质，一般没有生物活性。恢复生物学活性的过程，有时非常困难。活性蛋恢复生物学活性的过程，有时非常困难。活性蛋白质的终产量低。白质的终产量低。细胞质还原的环境不利于形成二硫键细胞质还原的环境不利于形成二硫键 N-末端存在甲硫氨酸，蛋白质真实性受影响末端存在甲硫氨酸，蛋白质真实性受影响 蛋白质种类多，纯化工作量比较大。蛋白质种类多，纯化工作

12、量比较大。2022-9-517现在学习的是第17页，共71页周质中表达周质中表达 周质（周质（periplasm)大肠杆菌一类格兰氏阴性细大肠杆菌一类格兰氏阴性细菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结构菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结构 表达于细胞质中的蛋白，借助信号肽穿过细胞表达于细胞质中的蛋白，借助信号肽穿过细胞内膜到达周质内膜到达周质2022-9-518现在学习的是第18页，共71页优点：优点：蛋白种类少，易纯化蛋白种类少，易纯化 酶解程度低酶解程度低 促进二硫键的形成和蛋白质的折叠促进二硫键的形成和蛋白质的折叠 蛋白质蛋白质N-端真实性端真实性缺点：缺点：转运的效率不稳定转运的效率不稳定20

13、22-9-519现在学习的是第19页，共71页 表达产物分泌到细胞外表达产物分泌到细胞外 诱导大肠杆菌细胞分泌外源蛋白质诱导大肠杆菌细胞分泌外源蛋白质 利用信号肽；利用信号肽；融合蛋白配体；融合蛋白配体；透化剂；透化剂；2022-9-520现在学习的是第20页，共71页蛋白质合成后需要经过复杂机制，蛋白质合成后需要经过复杂机制，定向定向输送到最终发挥生物功能的细胞靶部位输送到最终发挥生物功能的细胞靶部位，这一过程称为蛋白质的靶向输送。这一过程称为蛋白质的靶向输送。蛋白质合成后的靶向输送蛋白质合成后的靶向输送 蛋白质的靶向输送蛋白质的靶向输送(protein targeting)现在学习的是第2

14、1页，共71页所有靶向输送的蛋白质结构中存在分选所有靶向输送的蛋白质结构中存在分选信号，主要为信号，主要为N末端特异氨基酸序列末端特异氨基酸序列，可引导，可引导蛋白质转移到细胞的适当靶部位，这一序列称蛋白质转移到细胞的适当靶部位，这一序列称为信号序列为信号序列。信号序列信号序列(signal sequence)现在学习的是第22页，共71页 常见的信号序列由常见的信号序列由10104040个氨基酸残基组成，个氨基酸残基组成，N N端为带正电荷的氨基酸残基，中间为疏水的核端为带正电荷的氨基酸残基，中间为疏水的核心区，而心区，而C C端由小分子氨基酸残基组成（加工区端由小分子氨基酸残基组成（加工区

15、），可被信号肽酶识别并裂解。），可被信号肽酶识别并裂解。现在学习的是第23页，共71页信号假说：分泌型蛋白质的定向输送，就是靠信号肽与胞浆中的信号肽识别粒子（SRP）识别并特异结合，然后再通过SRP与膜上的对接蛋白（DP，即SRP受体）结合后开放膜蛋白通道分泌性蛋白穿过膜膜外侧面信号肽酶切断信号肽加工区。现在学习的是第24页，共71页信号肽的一级结构信号肽的一级结构现在学习的是第25页，共71页优点优点：酶解作用低酶解作用低 纯化方便纯化方便 增进蛋白折叠增进蛋白折叠 N-端的结构真实端的结构真实2022-9-526现在学习的是第26页，共71页分泌表达形式的缺点：分泌表达形式的缺点：相对其它

16、生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因即便能分杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因即便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多。泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多。2022-9-527现在学习的是第27页，共71页短小芽孢杆菌表达蛋白质短小芽孢杆菌表达蛋白质 例例1：表达白细胞介素：表达白细胞介素2，表达产物无需复性处，表达产物无需复性处理，即具有生物活性。产率达理，即具有生物活性。产率达50mg/L。例例2：表达人表皮生长因子（：表达

17、人表皮生长因子（EGF），产率达），产率达1g/L以上。以上。澳大利亚盛产羊毛，每年需要大批的剪羊毛的技工，澳大利亚盛产羊毛，每年需要大批的剪羊毛的技工，由于由于EGF可引起羊毛从根部自行脱落，故每只羊可引起羊毛从根部自行脱落，故每只羊注射注射5mgEGF，在，在1月后可用手直接抓下羊毛。月后可用手直接抓下羊毛。2022-9-528现在学习的是第28页，共71页利用梭菌属嗜热菌株利用梭菌属嗜热菌株由纤维素生产乙醇由纤维素生产乙醇 纤维素是由葡萄糖单体以纤维素是由葡萄糖单体以1 1，4 4糖苷键连糖苷键连接的多糖，接的多糖，利用梭菌属嗜热菌株可由纤维素直接利用梭菌属嗜热菌株可由纤维素直接发酵生产

18、乙醇。利用基因工程技术改造菌株，增加发酵生产乙醇。利用基因工程技术改造菌株，增加乙醇的产率，降低副产物（如乙酸、丁酸等）。乙醇的产率，降低副产物（如乙酸、丁酸等）。2022-9-529现在学习的是第29页，共71页第二节第二节 酵母菌表达体系酵母菌表达体系2022-9-530现在学习的是第30页，共71页酵母菌的种类酵母菌的种类 酵母菌（酵母菌（Yeast）有有56个属个属500多个种组成。多个种组成。如果说大肠杆菌是最成熟的原核表达系统，如果说大肠杆菌是最成熟的原核表达系统，则则酵母菌是最成熟的真核表达系统。酵母菌是最成熟的真核表达系统。常用的有：常用的有：酵母属（如酿酒酵母）酵母属（如酿酒

19、酵母）毕赤酵母属（如巴斯德毕赤酵母属）毕赤酵母属（如巴斯德毕赤酵母属）裂殖酵母属（如非洲酒裂殖酵母）裂殖酵母属（如非洲酒裂殖酵母）2022-9-531现在学习的是第31页，共71页一一.啤酒酵母啤酒酵母 啤酒酵母又名面包酵母，被称为真核生物中的啤酒酵母又名面包酵母，被称为真核生物中的“大大肠杆菌肠杆菌”。易于培养易于培养 其单倍体核酸其单倍体核酸DNADNA容量为大肠杆菌基因组的容量为大肠杆菌基因组的3.53.5倍倍2022-9-532现在学习的是第32页，共71页啤酒酵母特点啤酒酵母特点 培养简单培养简单,经济经济,快捷快捷 适于有氧和无氧条件下的大规模培养适于有氧和无氧条件下的大规模培养

20、单倍体酵母细胞含有单倍体酵母细胞含有15Mb15Mb的基因组的基因组,16,16条大小约条大小约200-2200Kb200-2200Kb的线性染色体。的线性染色体。（培养室内空气可闻培养室内空气可闻）2022-9-533现在学习的是第33页，共71页二二.甲醇酵母表达体系甲醇酵母表达体系2022-9-534现在学习的是第34页，共71页1.甲醇酵母的生物学特点甲醇酵母的生物学特点 甲醇酵母是一种甲基营养型酵母甲醇酵母是一种甲基营养型酵母.在缺乏碳源如葡在缺乏碳源如葡萄糖萄糖甘油时甘油时,能利用甲醇作为唯一的碳源能利用甲醇作为唯一的碳源;生长温生长温度度28-30 C。如巴斯德毕赤酵母就是常用的

21、表达系统。如巴斯德毕赤酵母就是常用的表达系统。2022-9-535现在学习的是第35页，共71页2.甲醇酵母表达系统的优点甲醇酵母表达系统的优点 具有强有力的乙醇氧化酶基因（具有强有力的乙醇氧化酶基因（AOX1）启动子，）启动子，可严格调控外源蛋白的表达可严格调控外源蛋白的表达 作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工和修饰，从而表达出有生物活性的外后的加工和修饰，从而表达出有生物活性的外源蛋白源蛋白 营养要求低，生长快，培养基廉价，便于工业化生营养要求低，生长快，培养基廉价，便于工业化生产产 可高密度发酵培养可高密度发酵培养.2022-9-53

22、6现在学习的是第36页，共71页 表达量高，数百表达量高，数百mg/L以上水平以上水平 表达的蛋白既可存在于细胞，又可分泌到胞外。由表达的蛋白既可存在于细胞，又可分泌到胞外。由于甲醇酵母自身分泌的蛋白（背景蛋白）非常少，于甲醇酵母自身分泌的蛋白（背景蛋白）非常少，十分有利于纯化。十分有利于纯化。糖基化程度低。糖基化程度低。2022-9-537现在学习的是第37页，共71页多型汉逊酵母表达系统多型汉逊酵母表达系统 已用于表达乙肝表面抗原已用于表达乙肝表面抗原2022-9-538现在学习的是第38页，共71页3.应用举例应用举例 毕赤酵母毕赤酵母 牛溶菌酶；牛溶菌酶；乙肝表面抗原；乙肝表面抗原；人

23、肿瘤坏死因子；人肿瘤坏死因子；人表皮生长因子；人表皮生长因子；人组织纤溶酶原活化剂；人组织纤溶酶原活化剂；链激酶；链激酶；破伤风毒素片段破伤风毒素片段C；2022-9-539现在学习的是第39页，共71页乳酸克鲁维酵母乳酸克鲁维酵母 牛凝乳酶；人白细胞介素牛凝乳酶；人白细胞介素1；半乳糖苷酶半乳糖苷酶多型汉逊酵母多型汉逊酵母 乙肝表面抗原乙肝表面抗原 半乳糖苷酶半乳糖苷酶 葡萄糖淀粉酶葡萄糖淀粉酶2022-9-540现在学习的是第40页，共71页第三节第三节 昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统 昆虫属于动物界节肢动物门昆虫纲，其发育过昆虫属于动物界节肢动物门昆虫纲，其发育过程以变态而著称。程以变

24、态而著称。昆虫是地球上分布最广、数量最多的动物，昆虫是地球上分布最广、数量最多的动物，有上百万种。有上百万种。用于表达外源基因的多为家蚕系统。用于表达外源基因的多为家蚕系统。2022-9-541现在学习的是第41页，共71页昆虫表达系统昆虫表达系统 昆虫是高等真核生物昆虫是高等真核生物,能进行翻译后加工和能进行翻译后加工和修饰修饰.昆虫细胞常用于真核蛋白质的生产昆虫细胞常用于真核蛋白质的生产.其生长其生长速度快速度快,不需要不需要CO2培养箱培养箱,易于悬浮培养易于悬浮培养,可用于可用于大规模表达蛋白质大规模表达蛋白质.2022-9-542现在学习的是第42页，共71页家蚕表达系统家蚕表达系统

25、 家蚕属于鳞翅目家蚕科，人类饲养家蚕已有家蚕属于鳞翅目家蚕科，人类饲养家蚕已有5000余年历史。我国是家蚕业的发祥地，自古以余年历史。我国是家蚕业的发祥地，自古以来农桑并茂，丝绸之路名扬天下。我国的生丝产量来农桑并茂，丝绸之路名扬天下。我国的生丝产量占世界总产量的占世界总产量的70，丝绸业的年产值达，丝绸业的年产值达700亿元。亿元。2022-9-543现在学习的是第43页，共71页 我国科学家于我国科学家于2003年率先完成家蚕基因组年率先完成家蚕基因组框架图，覆盖率和精确度分别达到框架图，覆盖率和精确度分别达到95.54和和99.95，是我国科学家向人类社会贡献的第三大，是我国科学家向人类

26、社会贡献的第三大基因组研究成果。基因组研究成果。2022-9-544现在学习的是第44页，共71页 家蚕的特点是丝素蛋白的高效表达。蚕丝的主要成家蚕的特点是丝素蛋白的高效表达。蚕丝的主要成分是丝素蛋白。在家蚕的丝素蛋白合成期，每个细分是丝素蛋白。在家蚕的丝素蛋白合成期，每个细胞每秒合成数万个丝素分子。胞每秒合成数万个丝素分子。2022-9-545现在学习的是第45页，共71页杆状病毒载体杆状病毒载体 杆状病毒是含有包膜的双链杆状病毒是含有包膜的双链DNA病毒，宿主为病毒，宿主为无脊椎动物。主要感染昆虫，包括鳞翅目、膜无脊椎动物。主要感染昆虫，包括鳞翅目、膜翅目、鞘翅目、毛翅目等。翅目、鞘翅目、

27、毛翅目等。杆状病毒表达载体可分为两大类：杆状病毒表达载体可分为两大类：1.表达单个外源基因表达单个外源基因 2.表达多个外源基因表达多个外源基因2022-9-546现在学习的是第46页，共71页杆状病毒载体的构建杆状病毒载体的构建以以pUC质粒为基础构建，提供质粒为基础构建，提供Amp抗性；抗性；多角体蛋白编码基因的启动子；多角体蛋白编码基因的启动子；多克隆位点位于该启动子的下游；多克隆位点位于该启动子的下游；家蚕丝心蛋白编码基因启动子：被认为是自然界家蚕丝心蛋白编码基因启动子：被认为是自然界最强的启动子，但由其介导的外源基因高效表最强的启动子，但由其介导的外源基因高效表达对宿主细胞的生理过程

28、有干扰。达对宿主细胞的生理过程有干扰。2022-9-547现在学习的是第47页，共71页二二.昆虫细胞宿主昆虫细胞宿主 常用的宿主为常用的宿主为sf9和和sf21。来源于草地夜蛾的卵巢细胞。来源于草地夜蛾的卵巢细胞。2022-9-548现在学习的是第48页，共71页第四节第四节 哺乳类细胞表达系统哺乳类细胞表达系统 优点：哺乳动物细胞可加工修饰表达的蛋白质，包括优点：哺乳动物细胞可加工修饰表达的蛋白质，包括二硫键的形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成、蛋二硫键的形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成、蛋白酶的定点切割产生具有天然活性的蛋白质白酶的定点切割产生具有天然活性的蛋白质 缺点：细胞生长缓慢，

29、培养周期长；缺点：细胞生长缓慢，培养周期长；生产成本高生产成本高；2022-9-549现在学习的是第49页，共71页2 2蛋白质切割蛋白质切割 末端切割末端切割膜蛋白、分泌蛋白：在氨基端具有一段信号肽。膜蛋白、分泌蛋白：在氨基端具有一段信号肽。信号肽必须切除多肽链才具有功能。信号肽必须切除多肽链才具有功能。脊椎动物前胰岛素原长脊椎动物前胰岛素原长105105aaaa，首先切除氨基端，首先切除氨基端的的2424aaaa，成为前体胰岛素，成为前体胰岛素再将中间的一段切除，留下两端有活性的部分，再将中间的一段切除，留下两端有活性的部分，即即2121aaaa酸残基的酸残基的A A链和链和3030aaa

30、a的的B B链链两条链由两个二硫键连接成有生物活性的胰岛两条链由两个二硫键连接成有生物活性的胰岛素。素。现在学习的是第50页，共71页3 3、蛋白质的化学修饰、蛋白质的化学修饰简单的化学修饰：简单的化学修饰：将乙酰基、甲基、磷酸基、羟基等小基团将乙酰基、甲基、磷酸基、羟基等小基团加到氨基酸侧链上，或者加到氨基端或羧基端加到氨基酸侧链上，或者加到氨基端或羧基端不同蛋白质可以有完全相同的修饰不同蛋白质可以有完全相同的修饰相同的蛋白质可以有完全不同的修饰相同的蛋白质可以有完全不同的修饰磷酸化在基因表达中具有重要的调控作用磷酸化在基因表达中具有重要的调控作用现在学习的是第51页，共71页复杂的修饰复杂

31、的修饰糖基化（糖基化（glycosylationglycosylation），），将不同的碳水化合物（糖类）加到多肽链上。将不同的碳水化合物（糖类）加到多肽链上。现在学习的是第52页，共71页人类的人类的ABOABO血型血型 控制控制ABOABO血型的是一个复等位基因座位，编码负责将糖基血型的是一个复等位基因座位，编码负责将糖基加到红细胞膜上的糖蛋白分子上的酶。加到红细胞膜上的糖蛋白分子上的酶。三个等位基因三个等位基因，编码三个不同的酶编码三个不同的酶 将将N N乙酰半乳糖胺（乙酰半乳糖胺（N Nacetyacetygalactosaminegalactosamine）加到加到糖蛋白上，糖蛋白

32、上，A A血型血型 将半乳糖（将半乳糖（galactosegalactose）加到糖蛋白上，加到糖蛋白上，B B血型血型 第三个基因编码的酶无功能，不能将任何糖加到糖蛋白上第三个基因编码的酶无功能，不能将任何糖加到糖蛋白上，O O血型血型现在学习的是第53页，共71页常用的哺乳动物表达细胞常用的哺乳动物表达细胞 CHO细胞细胞 中国仓鼠卵巢上皮细胞，是一株缺乏二中国仓鼠卵巢上皮细胞，是一株缺乏二氢叶酸还原酶的营养缺陷突变株。表达量可达氢叶酸还原酶的营养缺陷突变株。表达量可达10mg/L，可大规模培养（数千升）。已表达的，可大规模培养（数千升）。已表达的产物有组织纤溶酶原激活剂（产物有组织纤溶酶

33、原激活剂（tPA）、凝血因子）、凝血因子、红细胞生成素等。、红细胞生成素等。2022-9-554现在学习的是第54页，共71页 COS细胞细胞 来源于非洲绿猴肾细胞系（来源于非洲绿猴肾细胞系（CV1），），属于瞬时表达细胞。即由于转染质粒在宿主细胞中属于瞬时表达细胞。即由于转染质粒在宿主细胞中大量表达，导致细胞死亡。大量表达，导致细胞死亡。2022-9-555现在学习的是第55页，共71页 从从2000年以后，哺乳动物细胞表达系统更受重视。年以后，哺乳动物细胞表达系统更受重视。目前，美国目前，美国418种在研药物中约种在研药物中约70%是以哺乳动是以哺乳动物细胞表达的。在物细胞表达的。在FDA

34、已批准上市的生物技术已批准上市的生物技术药物中，哺乳动物细胞表达的产品占药物中，哺乳动物细胞表达的产品占70%以上。以上。2022-9-556现在学习的是第56页，共71页一一.用于哺乳动物细胞表达的载体用于哺乳动物细胞表达的载体 病毒载体：病毒载体：（1）含有能够被真核细胞识别的有效启）含有能够被真核细胞识别的有效启 动子动子 （2）在感染周期中能够持续复制，达到很）在感染周期中能够持续复制，达到很 高高的拷贝数。的拷贝数。（3）控制自己复制的元件）控制自己复制的元件 （4）有些载体可高效稳定地整合到寄主基）有些载体可高效稳定地整合到寄主基因组上因组上 （5）外壳蛋白识别细胞受体，可将外源基

35、）外壳蛋白识别细胞受体，可将外源基 因因高效导入受体细胞。高效导入受体细胞。2022-9-557现在学习的是第57页，共71页1.SV40病毒病毒载体载体 SV40：猿猴空泡病毒（：猿猴空泡病毒（Simian vacuolating virus 40,SV40)环型双链环型双链DNA分子，含分子，含5243bp。2022-9-558现在学习的是第58页，共71页重组的病毒-质粒载体 含有完整的早期区段和复制起点的病毒-质粒载体：病毒的早期区段和复制起点+大肠杆菌的质粒分子重组而成。例如：pC10早期区段和复制起点（多瘤病毒）质粒pBR322 这种载体既可在大肠杆菌中复制，也可在哺乳动物细胞中复

36、制，称之为穿梭载体。2022-9-559现在学习的是第59页，共71页2.反转录病毒载体反转录病毒载体 宿主范围广，感染动物或人的细胞。宿主范围广，感染动物或人的细胞。具有强启动子具有强启动子 不引起宿主细胞的死亡，可以维持许多代不引起宿主细胞的死亡，可以维持许多代2022-9-560现在学习的是第60页，共71页第四节 外源基因导入宿主细胞的物理化学方法参见教材第六章P121页2022-9-561现在学习的是第61页，共71页1.磷酸钙沉淀法转染技术 1973年年F.L.Graham等人建立等人建立 通过形成一种通过形成一种DNA-磷酸钙沉淀物，使之黏附磷酸钙沉淀物，使之黏附到培养的哺乳动物

37、单层细胞表面，就会迅速地到培养的哺乳动物单层细胞表面，就会迅速地被细胞捕获被细胞捕获 能将任何外源基因有效地导入培养的哺乳动物细能将任何外源基因有效地导入培养的哺乳动物细胞胞2022-9-562现在学习的是第62页，共71页DNA+CaCl2 混匀Hepes-磷酸盐溶液中DNA-磷酸钙沉淀沉淀吸附到细胞上共同孵育换培养液筛选，10%的细胞转入了外源DNA搅拌中逐滴加入到2022-9-563现在学习的是第63页，共71页2.DEAE-葡聚糖转染技术 DEAE-葡聚糖是一种高分子量的多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外源的DNA DEAE-葡聚糖与DNA形成复合物免受核酸酶的降解，与膜发生作用

38、，使DNA穿过细胞膜 方法简单、重复性高、特别适用于研究基因瞬时表达，转染效率高于磷酸钙转染法2022-9-564现在学习的是第64页，共71页3.电穿孔DNA转移技术 1982年T.K.Wang and E.Neumann 建立 在高压脉冲的作用下使细胞膜上出现微小的孔洞，从而导致细胞外界环境中的DNA 穿孔而入 操作简便、转染效率高，适用于各种细胞。可转移大于100Kb的质粒DNA。2022-9-565现在学习的是第65页，共71页Cell+DNA0oC24KV，10min（脉冲）换培养液筛选2022-9-566现在学习的是第66页，共71页4.脂质体载体法 外层是脂质双分子层，内含水溶液

39、，包括外层是脂质双分子层，内含水溶液，包括DNA分分子子2022-9-567现在学习的是第67页，共71页 脂质体载体法：脂质体载体法：将将DNA包装在脂质体内部，通过脂质体的双层包装在脂质体内部，通过脂质体的双层膜同受体细胞膜之间的融合作用，使外源基因膜同受体细胞膜之间的融合作用，使外源基因进入细胞质、细胞核进入细胞质、细胞核。2022-9-568现在学习的是第68页，共71页DNA-脂质体复合物法：脂质体复合物法：外源外源DNA与阳离子脂质体通过两者之间的静电引力与阳离子脂质体通过两者之间的静电引力结合在一起形成结合在一起形成DNA-脂质体复合物，并且阳离子脂质体复合物，并且阳离子脂质体与表面为负电荷的受体细胞发生强烈的作脂质体与表面为负电荷的受体细胞发生强烈的作用，导致脂质体与细胞膜之间发生融合作用，使用，导致脂质体与细胞膜之间发生融合作用，使DNA-脂质体复合物进入细胞。脂质体复合物进入细胞。2022-9-569现在学习的是第69页，共71页基因显微注射技术基因显微注射技术 应用显微注射器，把重组的应用显微注射器，把重组的DNA 直接注射到受体细胞质或细胞核。直接注射到受体细胞质或细胞核。2022-9-570现在学习的是第70页，共71页感谢大家观看感谢大家观看2022-9-5现在学习的是第71页，共71页