高速逆流色谱 [高速逆流色谱在天然产物分离中的应用] .docx

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1、高速逆流色谱 高速逆流色谱在天然产物分离中的应用 摘要：高速逆流色谱是一种连续液-液色谱技术，具有无固相载体的优点。现将近年高速逆流色谱在自然产物分别中的应用作一介绍。 关键词：高速逆流色谱；自然产物；应用 中图分类号：O657.7文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)05-0024-04 Application of High-speed Counter-current Chromatography in Isolation of Natural Products ZHAO Ying (School of Pharmaceutical Sciences, Shandong U

2、niversity, Jinan 250012, China) Abstract：High-speed countercurrent chromatography (HSCCC) is one kind of continuous liquid-liquid distribution chromatography with the unique feature of eliminating the use of a solid support. This paper reviews the application of HSCCC in the isolation of natural pro

3、ducts. Key words：high-speed countercurrent chromatography; natural product; application 20世纪80年头，美国国立卫生探讨院（National Institutes of Health，NIH）Ito等在液-液安排色谱的基础上独创了高速逆流色谱（high-speed countercurrent chromatography，HSCCC）。HSCCC技术主要有离子对逆流色谱（ion-pair countercurrent chromatography）、pH区带逆流色谱（pH-zone-refining c

4、ountercurrent chromatography）及多维逆流色谱（multidimensional countercurrent chromatography）1。HSCCC是一项高效快速的液-液安排色谱技术，由于该色谱无需固相载体支持，避开了因不行逆吸附而引起的样品损失、变性等问题，特殊适用于分别（单离）极性物质和用其他分别方法易引起结构改变的物质。随着方法的改进2，用该法进行自然产物分别制备的量和纯度都有了极大的提高，国内外已广泛用于生物碱类、黄酮类、苷类等化合物的分别。现对HSCCC及其在自然产物分别中的应用作一介绍。 1HSCCC在自然产物分别中的应用 1.1生物碱类 Liu等

5、3用HSCCC，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（5:5:7:5，v/v）为溶剂体系，从吴茱萸Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth.分别纯化得到5个生物碱类化合物，纯度分别为98.7，98.4，96.9，98.0和97.2。蒋凯等4用HSCCC，以氯仿-甲醇-0.2 mol/ L HCl（10:3:3，v/v）为溶剂系统，从黄花乌头Aconitum coreanum (Ll.) Rapaics分别并鉴定了8个C20二萜生物碱。 1.2黄酮类 Zhou等5用HSCCC从短瓣金莲花（Trollius ledebouri Reichb.）分别得到2个黄酮苷类、1个未知化合物（纯

6、度均在97.0%以上）和1个部分纯化的组分（纯度为85.1，随后用半制备型HPLC纯化），其溶剂体系为乙酸乙酯-正丁醇-水（2:1:3，v/v）。土茯苓为百合科菝葜属植物光叶菝葜（Smilax glabra Roxb.）的干燥根茎，Du等6用制备型HSCCC对落新妇苷进行分别纯化，一次分别粗提物1.5 g，以正己烷-正丁醇-水（1:1:2，v/v）为溶剂体系，得到落新妇苷和异落新妇苷。利用HSCCC分别的其他黄酮类化合物见表1。 表 1利用HSCCC分别黄酮类化合物 1.3倍半萜 木香是菊科植物木香（Aucklandia lappa Decne）的干燥根，其中广木香内酯和去氢-姜黄烯具有抗菌、

7、抗病毒和止痛等作用。Li等16用制备型HSCCC，以石油醚-甲醇-水（5:6.5:3.5，v/v）的上相作为固定相，胜利分别纯化了广木香内酯和去氢-姜黄烯，纯度分别为100和99.6。Ma等17利用HSCCC从新疆一枝蒿（Artemisia rupestris L.）二氯甲烷提取物中分别得到一枝蒿酮酸，纯度大于98.0，其中以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（6:4:3.5:6.5， v/v）的上相和0.5的醋酸为固定相。Yan等18利用HSCCC从姜科植物温郁金（Curcuma wenyujin）根茎的挥发油中胜利分别得到吉玛酮和莪术二酮，溶剂系统为石油醚-乙醇-乙醚-水（5:4:0.5:1，v/

8、v），纯度大于95.0。 1.4醌类 紫草（Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc.）含萘醌类色素：紫草素、乙酰紫草素等，Lu等19用HSCCC，以正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水（16:14:14:5，v/v）为溶剂体系，从52 mg紫草粗提物（含38.9紫草素）中分别纯化得到紫草素19.6 mg（纯度为98.9），回收率为96.9，完成一次分别用时200 min。何首乌为蓼科植物何首乌（Polygonum multiflorum Thunb.）的块根，主要含有蒽醌类、二苯乙烯苷等活性成分，Yao等20利用HSCCC分别其乙醚、正丁醇和水的提取物，流淌相分

9、别为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（3:7:5:5，v/v），乙酸乙酯-甲醇-水（50:1:50，v/v）和乙酸乙酯-正丁醇-水（20:1:20，v/v）的下相，共得到9个化合物，纯度均大于97.0，其中5个是蒽醌类化合物。 1.5苯丙酸类 丹参为唇形科植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根及根茎，其所含丹酚酸B具有剧烈的抗氧化和清除氧自由基的活性。Chen等21用HSCCC分别纯化丹参水溶性成分丹酚酸类物质，制备丹酚酸B化学比照品，其纯度为98.6，采纳的溶剂体系为正己烷-乙酸乙酯-水-甲醇（1.5:5:5:1.5），上相做固定相，下相做流淌相。 1.6香豆素类 近

10、来探讨表明，香豆素类及结构相关的化合物具有抑制HIV的活性，此类化合物可能对AIDS有治疗作用。白芷为伞形科植物白芷Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm.）Benth.et Hook. f.的干燥根，Wei等22利用制备型HSCCC从白芷中胜利分别纯化了戊烯氧呋豆素、氧化前胡内酯和异欧前胡素，纯度大于98.0，采纳的溶剂体系为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1:1:1:1和5:5:4.5:5.5，v/v）。Liu等利用制备型HSCCC，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（5:5:7:4，v/v）为溶剂体系，从紫花前胡（Radix Peucedani）中分别纯化了6个香豆素类化

11、合物，纯度分别为88.3 ，98.0 ，94.2 ，97.1 ，97.8 和98.4 ，若利用HSCCC再作一次分别，溶剂体系为石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（5:5:4:5，v/v），紫花前胡苷元（nodakenetin）的纯度可达到99.423。Liu等24还用HSCCC，以正丁醇-甲醇-0.5%醋酸（5:1.5:5，v/v）为溶剂体系，从Cortex fraxinus中分别纯化了4个香豆素类化合物，纯度分别为97.6，99.5，97.2和98.7。 1.7苷类 仙茅（Curculigo orchioides Gaertn.）是中医常用的补肾壮阳药物，具有很多生物活性，如抗骨质疏松、抗苍老、抗

12、炎症反应、增加免疫力等。Peng等25利用制备型HSCCC从仙茅中胜利分别纯化了仙茅苷和仙茅苷乙，纯度分别为96.5和99.4，并探讨了一些参数，包括溶剂体系为乙酸乙酯-乙醇-水（5:1:5，v/v），分别温度、流淌相流速和仪器的转速。 Zhou等26用制备型HSCCC对栀子（Gardenia jasminoides Ellis）的果实京尼平苷进行了大规模的分别纯化，一次分别粗提物1 g，溶剂体系为乙酸乙酯-正丁醇-水（2:1.5:3，v/v），得到京尼平苷的纯度大于98。Li等27用HSCCC对连翘（Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl）的果实50.0乙醇粗提物进行了

13、分别纯化，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1:9:1:9，v/v）为溶剂体系，得到连翘苷的纯度大于98.6。 1.8木脂素类 板蓝根（Radix Isatidis）为十字花科植物菘蓝（Isatis indigotica Fort.）的干燥根，有清热解毒、凉血利咽功能，有抗菌、抗病毒、抗内毒素和抗肿瘤等药理作用。Peng等28用制备型HSCCC从板蓝根胜利地分别纯化了clemastanin B和indigoticoside A，纯度分别为94.6和99.0，其中溶剂体系为乙酸乙酯-正丁醇-水（2:7:9，v/v）。Peng等29还用制备型HSCCC，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1:0.9:1:0

14、.9，v/v）为溶剂体系，对经D-101大孔吸附树脂处理的北五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.粗提物进行了分别纯化，得到五味子素和戈米辛A，纯度均大于99.0，用时小于3 h。Huang等30用HSCCC，以正己烷-甲醇-水（35:30:3，v/v）为溶剂体系，从北五味子的石油醚提取物中胜利分别纯化了去氧五味子素和-五味子素，纯度分别为98.0和96.0。 1.9其他 腐败菌素为亲脂性环肽类化合物，具有多种生物活性，其杀虫活性和植物毒性广为人知，还有细胞毒性，在医学上可能有重大意义。Seger等31首先利用液液提取和Sephadex LH-20浓缩得到粗

15、提物，再利用HSCCC分别纯化得到腐败菌素A、B和E，纯度大于98.0，总收率大于40.0%。 2结论和展望 Ito32为了帮助科学家们更好的应用HSCCC，总结了很多运用阅历。HSCCC分别效果与仪器参数和溶剂体系的选择关系亲密，其中溶剂体系的选择是至关重要的一步，占总工作量的90.0%。溶剂体系应符合以下要求：（1）样品在溶剂体系中性质稳定且溶解度足够大；（2）溶剂体系的两相有适当的体积比，以免溶剂奢侈；（3）样品在溶剂体系中有合适的安排系数K（0.5K1.0）；（4）溶剂体系应保证适当的固定相保留值。 HSCCC的优点有：溶剂体系的组成与配比敏捷，从理论上讲可适用于任何极性范围的样品分别

16、；仪器操作简洁，对样品的预处理要求低；避开了有效成分被固相载体的不行逆性吸附，理论上样品的回收率可达100；峰的保留相对标准偏差小于2，重现性好；有机溶剂消耗少，无损失、无污染；分别效率高和大制备量分别等。与制备HPLC相比，HSCCC不存在色谱柱污染的问题，且进样量较大，最多可达几g，是HPLC的l04l05倍；而与常压和低压色谱相比，HSCCC的分别实力强，有些样品经过一次分别就可以得到1个甚至多个单体，并且分别时间也较短，一般几小时就可以完成一次分别。 自HSCCC问世以来，在自然产物的提取纯化中发挥着很大的优势，应用前景非常广袤。HSCCC的任何关键性进展都有可能对自然产物的探讨产生深

17、远的影响，是值得关注的探讨领域。目前HSCCC主要用于定性、分别制备，定量分析少见报道，随着探讨的深化，HSCCC也会用于定量分析。例如高速逆流色谱-质谱（HSCCC-MS）联用，这将为HSCCC开拓更加广袤的应用领域。 参考文献 1郅文波，顾铭，宋江楠，等. 高速逆流色谱技术在生物大分子分别纯化中的应用J. 生物技术通讯，2005，16（1）：96-99. 2王凤美，陈军辉，李磊，等. 高速逆流色谱法分别制备丹酚酸BJ. 自然产物探讨与开发，2006，18（1）：100-104. 3Liu R M, Chu X, Sun A L, et al. Preparative isolation a

18、nd purification of alkaloids from the Chinese medicinal herb Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth by high-speed counter-current chromatography J. J Chromatogr A, 2005, 1074(1-2): 139-144. 4蒋凯，杨春华，刘静涵，等. 黄花乌头中Hetisine型生物碱的高速逆流色谱分别与结构鉴定J. 药学学报，2006，41（2）：128-131. 5Zhou X, Peng J Y, Fan G R, et al. Isolatio

19、n and purification of flavonoid glycosides from Trollius ledebouri using high-speed counter-current chromatography by stepwise increasing the flow-rate of the mobile phase J. J Chromatogr A, 2005, 1092(1): 216-221. 6Du Q, Li L, Jerz G. Purification of astilbin and isoastilbin in the extract of smila

20、x glabra rhizome by high-speed counter-current chromatography J. J Chromatogr A, 2005, 1077(1): 98-101. 7Peng J Y, Yang G J, Fan G R, et al. Preparative isolation and separation of a novel and two known flavonoids from Patrinia villosa Juss by high-speed counter-current chromatography J. J Chromatog

21、r A, 2005, 1092(2): 235-240. 8Peng J Y, Fan G R, Hong Z Y, et al. Preparative separation of isovitexin and isoorientin from Patrinia villosa Juss by high-speed counter-current chromatography J. J Chromatogr A, 2005, 1074(1-2): 111-115. 9Wang X, Li F W, Zhang H X, et al. Preparative isolation and pur

22、ification of polymethoxylated flavones from Tangerine peel using high-speed counter-current chromatography J. J Chromatogr A, 2005, 1090(1-2): 188-192. 10 Zhao M B, Ito Y, Tu P F. Isolation of a novel flavanone 6-glucoside from the flowers of Carthamus tinctorium (Honghua) by high-speed counter-curr

23、ent chromatography J. J Chromatogr A, 2005, 1090(1-2): 193-196. 11 Ma C J, Li G S, Zhang D L, et al. One step isolation and purification of liquiritigenin and isoliquiritigenin from Glycyrrhiza uralensis Risch. using high-speed counter-current chromatography J. J Chromatogr A, 2005, 1078(1-2): 188-1

24、92. 12 Wang X, Cheng C G, Sun Q L, et al. Isolation and purification of four flavonoid constituents from the lowers of Paeonia suffruticosa by high-speed counter-current chromatography J. J Chromatogr A, 2005, 1075(1-2): 127-131. 13 Li H B, Chen F. Isolation and purification of baicalein, wogonin an

25、d oroxylin A from the medicinal plant Scutellaria baicalensis by high-speed counter-current chromatography J. J Chromatogr A, 2005, 1074(1-2): 107-110. 14 Wu S J, Sun A L, Liu R M. Separation and purification of baicalin and wogonoside from the Chinese medicinal plant Scutellaria baicalensis Georgi

26、by high-speed counter-current chromatography J. J Chromatogr A, 2005, 1066(1-2): 243-247. 15 Liu R M, Li A F, Sun A L, et al. Preparative isolation and purification of three flavonoids from the Chinese medicinal plant Epimedium koreamum Nakai by high-speed counter-current chromatography J. J Chromat

27、ogr A, 2005, 1064(1): 53-57. 16 Li A F, Sun A L, Liu R M. Preparative isolation and purification of costunolide and dehydrocostuslactone from Aucklandia lappa Decne by high-speed counter-current chromatography J. J Chromatogr A, 2005, 1076(1-2): 193-197. 17 Ma Y M, Aisha H A, Liao L X, et al. Prepar

28、ative isolation and purification of rupestonic acid from the Chinese medicinal plant Artemisia rupestris L. by high-speed counter-current chromatography J. J Chromatogr A, 2005, 1076(1-2): 198-201. 18 Yan J Z，Chen G，Tong S Q，et al. Preparative isolation and purification of germacrone and curdione fr

29、om the essential oil of the rhizomes of Curcuma wenyujin by high-speed counter-current chromatography J. J Chromatogr A, 2005, 1070(1-2): 207-210. 19 Lu H T, Jiang Y, Chen F. Preparative high-speed counter-current chromatography for purification of shikonin from the Chinese medicinal plant Lithosper

30、mum erythrorhizon J. J Chromatogr A, 2004, 1023(1): 159-163. 20 Yao S H, Li Y, Kong L Y. Preparative isolation and purification of chemical constituents from the root of Polygonum multiflorum by high-speed counter-current chromatography J. J Chromatogr A, 2006, 1115(1-2): 64-71. 21 Chen J H, Wang F

31、M, Frank Sen-Chun Lee, et al. Separation and identification of water-soluble salvianolic acids from Salvia miltiorrhiza Bunge by high-speed counter-current chromatography and ESI-MS analysis J. Talanta, 2006, 69(1): 172-179. 22 Wei Y, Ito Y. Preparative isolation of imperatorin, oxypeucedanin and is

32、oimperatorin from traditional Chinese herb“bai zhi”Angelica dahurica (Fisch. ex Hoffm) Benth. et Hook using multidimensional high-speed counter-current chromatography J. J Chromatogr A, 2006, 1115(1-2): 112-117. 23 Liu R M, Sun Q H, Shi Y R, et al. Isolation and purification of coumarin compounds fr

33、om the root of Peucedanum decursivum (Miq.) Maxim by high-speed counter-current chromatography J. J Chromatogr A, 2005, 1076(1-2): 127-132. 24 Liu R M, Sun Q H, Su A L, et al. Isolation and purification of coumarin compounds from Cortex fraxinus by high-speed counter-current chromatography J. J Chro

34、matogr A, 2005, 1072(2): 195-199. 25 Peng J Y, Jiang Y Y, Fan G R, et al. Optimization suitable conditions for preparative isolation and separation of curculigoside and curculigoside B from Curculigo orchioides by high-speed counter-current chromatography J. Sep Purif Technol, 2006, 52(1): 22-28. 26

35、 Zhou T T, Fan G R, Hong Z Y, et al. Large-scale isolation and purification of geniposide from the fruit of Gardenia jasminoides Ellis by high-speed counter-current chromatography J. J Chromatogr A, 2005, 1100(1): 76-80. 27 Li H B, Chen F. Preparative isolation and purification of phillyrin from the

36、 medicinal plant Forsythia suspensa by high-speed counter-current chromatography J. J Chromatogr A, 2005, 1083(1-2): 102-105. 28 Peng J Y, Fan G R, Wu Y T. Isolation and purification of clemastanin B and indigoticoside A from Radix Isatidis by high-speed counter-current chromatography J. J Chromatog

37、r A, 2005, 1091(1-2): 89-93. 29 Peng J Y, Fan G R, Qu L P, et al. Application of preparative high-speed counter-current chromatography for isolation and separation of schizandrin and gomisin A from Schisandra chinensis J. J Chromatogr A, 2005, 1082(2): 203-207. 30Huang T H, Shen P N, Shen Y J. Prepa

38、rative separation and purification of deoxyschisandrin and ?schisandrin from Schisandra chinensis (Turcz.) Baill by high-speed counter-current chromatography J. J Chromatogr A, 2005, 1066(1-2): 239-242. 31 Seger C, Eberhart K, Sturm S, et al. Apolar chromatography on Sephadex LH-20 combined with hig

39、h-speed counter-current chromatography: High yield strategy for structurally closely related analytes-Destruxin derivatives from Metarhizium anisopliae as a case study J. J Chromatogr A, 2006, 1117(1): 67-73. 32 Ito Y. Golden rules and pitfalls in selecting optimum conditions for high-speed counter-current chromatography J. J Chromatogr A, 2005, 1065(2): 145-168. 注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”