银杏平颤方及其拆方对ＰＤ小鼠行为学形态学的影响-小鼠行为学.docx

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1、银杏平颤方及其拆方对小鼠行为学形态学的影响|小鼠行为学 摘 要：目的：探讨中药治疗帕金森病(PD)的作用和机制，视察银杏平颤方及其拆方对帕金森病(PD)模型小鼠行为学和形态学的影响。方法：应用MPTP制作PD小鼠模型。应用爬竿试验测试行为学改变和HE染色视察黑质和纹状体形态结构的改变。结果：(1)模型组行为学评分明显高于正常组(P0.05).(2)GBPR and its three similar prescriptions protected neurons in SNc. The HE showed that, there were seldom neurons in SNc in mo

2、del group;while there were much more neurons presented in the treatment groups than that in model group.Conclusion：Ginkgo Biloba Pingchan Recipe plays role in improving disability in pole test and increased spontaneous motor activity and in protection the neurons Keywords：Ginkgo Biloba Pingchan Reci

3、pe;MPTP;behavioral test;morphology;Parkinsons disease；Chinese medicine 帕金森病又称震颤麻痹，是一种好发于中老年人1的多巴胺能神经元功能降低引起的锥体外系慢性病，现在多数学者认为与氧化应激自由基有关2-3。原发性帕金森病的主要临床症状和体征为静止性震颤、肌强直、少动和体位障碍。有时可出现面目呆滞、发音低、书写字体过小、唾液增多、皮脂外溢、体温增高、出汗增多、便秘、疲乏、手脚痉挛引起的难受、抑郁及情感方面变更等。延缓PD功能障碍的抗氧化治疗有诱发精神障碍的副作用4-5。为了探讨探讨PD的发病因病机，建立了不同的动物模型。以往的

4、探讨已证明MPTP小鼠模型的生物化学和组织化学特征均与临床PD相像。因此，本试验采纳以MPTP腹腔注射诱发PD小鼠模型，视察PD小鼠行为学、病理学的改变，探讨中药银杏平颤方及其拆方对PD小鼠行为及DA能神经元形态结构的影响，以探讨其防治PD的机制。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1动物C57/BL6J小鼠，雄性，67周龄，体重（182）g，购于北京维通利华公司试验动物中心。动物自由进食饮水，动物房12h光、暗交替，平均温度22，相对湿度30%。 1.1.2主要仪器1510石蜡切片机：德国LETIZ公司。H-160万能探讨显微镜：美国POLYVAR公司。Olympus BX5显微镜：日本Ol

5、ympus株式会社。Image-pro Plus 5.0图象分析系统:日本Olympus株式会社。自制小鼠测试杆。 1.1.3化学试剂MPTP（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine）购于美国Sigma公司。 1.2方法 1.2.1中药制备乙醇提取法获得浸膏,溶于蒸馏水中，依据药理学方法计算小鼠给药量6，动物用药量依据成人6倍量计算，根据每次灌胃量0.5mL配制。0.1mPa灭菌15min，4保存备用。每次腹腔注射MPTP前40min给小鼠灌胃。 1.2.2小鼠PD模型的建立参照Nobutaka Arai,Kazuaki Misugi的试验方法

6、7，略加修改，小鼠造模前采纳爬杆法8进行筛选：动物给药前，先引导动物在15s内由杆顶爬至杆底，每只训练4次，训练完毕对其进行测定，选用0分C57-BL/6J小鼠（评分标准见表1），用生理盐水配制的0.3%MPTP（按30mg•kg-1•d-1）腹腔注射，连续5天。 1.2.3动物分组及处理选取0分小鼠随机分成6组,每组12只: 正常比照组(简称正常组，Normal control，NC)：不作任何处理。模型比照组(简称模型组，Model control，MC)：生理盐水每天灌胃0.5mL/只。银杏平颤方全方治疗组(简称全方组,Ginkgo Biloba Pingchan

7、 Recipe,G)：灌胃全方中药每天约0.5mL/只(含生药量1.18g/mL)。清热解毒方治疗组(简称解毒组,Jiedu Recipe,J)：解毒中药灌胃每天约0.5mL/只(含生药量0.6g/mL)。平肝熄风方治疗组(简称平肝组,Pinggan Recipe,P):平肝熄风中药灌胃每天约0.5mL/只(含生药量0.6g/mL)。化瘀通络方治疗组（简称化瘀组,Huayu Recipe,H）:化瘀通络中药灌胃每天约0.5mL/只(含生药量0.6g/mL)。第各组从造模第1天起先灌胃，每次腹腔注射MPTP前40min给小鼠灌胃，各治疗组赐予相应中药灌胃，模型组赐予生理盐水灌胃。MPTP用生理盐

8、水配制，每日30mg/kg腹腔注射，1日1次，各组连续用药5天。以上各组每日进行2次爬杆试验并进行评分，结果进行统计学处理。动物的存活期分别是造模起先14天和28天。 1.2.4小鼠行为学测试爬杆试验：所用工具为始终径13mm、高760mm的光滑不锈钢杆，垂直直立，将小鼠头向下放置在金属杆的顶部，使其沿杆自然爬下，视察动物在下行过程中的行为，并按标准计分，评分标准见表1。试验前每只小鼠爬杆2次，选用爬杆行为计分为0分的动物用于试验，称重并随机分组。全部动物于注射MPTP前及末次注射后第1至第3周每日口服药物前后，均进行爬杆试验，每只鼠爬杆2次，积分并计算平均分，评分结果进行统计学分析。 1.2

9、.5组织形态学视察取材及材料处理：动物用10%的水合氯醛腹腔麻醉后，打开胸腔，先经左心室升主动脉快速推注生理盐水20mL，后缓缓推注10%福尔马林灌流固定，取脑、置于10%福尔马林固定1周。脑组织常常规步骤处理：脱水、透亮、浸蜡、石蜡包埋，切片、片厚6m，常温保存备用。 HE染色法：石蜡切片烤干，脱蜡，脱苯，Ehrlich氏苏木精染，盐酸酒精分化，蓝化，伊红染色，脱水，透亮、中性树脂封片。 光镜下视察并摄片：依据小鼠脑立体定位图谱，每组每只动物选一张脚间核平面切片，取材部位见图1。 2结果 2.1小鼠行为学变更 2.1.1注射MPTP后 各组小鼠行为表现各组给药（MPTP）后10min小鼠都出

10、现不同程度的肢体震颤，起先前肢抬举伴震颤，后肢僵硬，竖尾、竖毛及跳、蹿等动作，持续约30min后，又出现运动障碍，动作迟缓，短暂性活动削减，对外界刺激易产生尖叫，躲避反应慢；注射MPTP后1h，小鼠表现明显的运动削减，对外界刺激反应低下，之后渐渐复原。但各组动物症状都于24h后完全消逝。随着用药时间延长，动物运动障碍程度增加，症状持续时间和复原时间延长。中药全方组和拆方各组均可不同程度改善PD小鼠出现的爬杆实力下降、时间延长和自发活动次数削减等上述小鼠行为学异样与模型组比较有显著性差异（P均-1•d-1腹腔注射后当日及以后几天，协调实力明显降低，表现为快速下滑，甚至不能抱杆、坠落，

11、持续4日后，于第5日末次注射MPTP后小鼠协调实力渐渐复原，模型比照组14周评分结果与正常比照组相比上升且均有显著性差异（P0.05）。笔者取给药前1天和当天及第1周至第4周每周综合计分进行比较，结果见表2、图2。 2.2病理学变更 2.2.1肉眼视察全部小鼠脑标本外观均未见明显异样，切面检查亦未见出血、坏死和软化灶。 2.2.2HE染色光镜视察正常组14天、28天脑黑质神经细胞形态正常，体积正常，结构清楚，密集成群。模型组14天、28天小鼠脑黑质神经细胞数量明显削减，部分神经元丢失，残留神经元呈大多角形或锥体形态，有的胞体变小，胞核固缩，胞核结构不清，有的胞核变大，核染色质疏松，有颗粒出现，

12、核四周胞浆有溶解样变更；胞浆染色加深，胞浆内可见大小不等的嗜酸性颗粒并出现小空泡。大部分小鼠黑质区域内尚可见广泛的淋巴细胞浸润，部分淋巴细胞围绕在血管四周形成血管套。残存的神经元体积瘦小，结构不清楚，色素变浅，同时伴轻度胶质细胞增生；与模型组14天和28天比较，银杏平颤方全方及拆方各组14天和28天小鼠脑黑质神经细胞数量明显增多，神经元体积较饱满，结构较清楚；各中药治疗组14天黑质区神经元形态与28天各组相比基本相像，黑质区神经元数量未见明显削减，但有少数神经元变性，细胞呈圆形或卵圆形，胞浆内未见嗜酸性颗粒出现。但总的看来中药各治疗组与正常比照组比较神经细胞未见明显削减，无特异性变更；有的可见

13、星形细胞轻度增多，胞核变大，偶见核分裂现象。解毒组28天2例黑质区有散在软化灶形成，病灶较小，灶内大多数神经元消逝，残留的神经元胞体变小，胞核固缩。部分小鼠黑质区可见充满性淋巴细胞浸润，偶见淋巴细胞围绕在小血管四周但并未形成血管套。 3探讨 3.1模型的建立和银杏平颤方对PD模型小鼠行为学改善的作用 帕金森病又称震颤麻痹，临床以肢体震颤、木僵为典型症状，是一种好发于老年人的多巴胺能神经元功能降低引起的锥体外系慢性病，同老年痴呆一样是与苍老相关的神经退行性病。目前认为其脑内黑质纹状体的多巴胺能和胆碱能神经功能平和失调是运动障碍的主要缘由，凡引起前者功能降低或后者功能亢进的因素均可以导致震颤。帕金

14、森病人的行为改变为运动协调实力降低，在本试验中，用爬杆试验作为测定动物协调运动实力的指标。模型组小鼠协调运动实力明显降低，并且这种行为异样可持续数日，与正常组有显著性差异，这一结果与文献报道一样。 现在世界公认的两种帕金森病模型药物是6羟基多巴（6-Hydrooxydopamine, 6-OHDA）和MPTP，6-OHDA是一种神经毒素，大鼠单侧纹状体注射微量的6OHDA，能够造成多巴胺能神经元坏死，经阿朴吗啡诱导，动物可出现向健侧旋转的现象910，6-OHDA模型存在造模周期长、胜利率低、症状不典型等问题，限制了它的应用。 MPTP是哌替啶的衍生物，可由脑中单胺氧化酶B催化生成MPP+，后者

15、是一种选择性的神经毒素，可以损害人类和灵长类动物脑中黑质中的多巴胺能神经元，MPTP最初发觉于吸毒患者的脑内，经分别获得该化合物，注射到猴体内可引起酷似临床震颤麻痹患者的几乎全部症状，并且严峻程度与所用剂量和动物年龄成正比。最初认为啮齿类动物对MPTP的毒性不敏感，后来发觉接受MPTP注射可能导致该动物出现震颤，但是种属差异很大，大鼠由于脑内MAO-B的活性或水平较低，MPTP不能被代谢成活性产物，因而大鼠对MPTP的毒性不敏感。MPTP注射给药可引起小鼠震颤，特殊是C57BL、BABC等，对注射MPTP产生的毒性极敏感， MPTP引起的小鼠行为学异样虽不像在灵长类动物上的症状典型，但造模周期

16、短、重复性好，试验动物费用低，可引起脑内黑质纹状体的多巴胺含量降低，因此，MPTP小鼠模型被国外很多试验室广泛采纳，这种模型为探讨帕金森病的发病机理和药物治疗供应了条件11-12。 MPTP确可引起小鼠的行为异样，但其引起的小鼠行为改变，因采纳的注射剂量、注射次数、注射途径的不同以及所采纳的行为视察方法的不同而有所不同13-16。本试验采纳的是最大剂量和最常用的注射途径，为缩短试验周期采纳5次注射，得到比较明显的运动实力降低的效用。为了检查PD小鼠的协调运动实力，本试验选用爬杆试验，即让小鼠头向下倒竖于垂直的金属杆顶部，待其四肢握紧杆后，松手任其自由下行，此试验中，动物被动地下行，当协调实力降

17、低时，行为发生明显变更。 试验结果显示， MPTP注射后，小鼠爬杆实力降低，并且这种行为异样可持续几日，以后渐渐复原，这一结果与文献运用自主活动法视察的结果一样，采纳此方法视察得到的银杏平颤方及其拆方对MPTP所致小鼠运动实力降低的改善作用这一结论是牢靠的。 3.2银杏平颤方对PD小鼠DA神经元形态的影响 许多试验证明，MPTP对黑质DA能神经元具有选择性神经毒作用，其致病的过程是MPTP进入体内首先穿过血脑屏障，被星形胶质细胞、5羟色胺能神经元摄取并在单胺氧化酶 B快速催化下生成吡啶类代谢产物甲基苯基吡啶离子（MPP+），MPP+与 DA的化学结构极为相像，故可以被DA转运体（DAT）识别并

18、载入DA能神经元内，然后通过线粒体外膜上能量依靠性转运机制进入线粒体集中起来，之后阻断线粒体NADH氧化呼吸链，最终造成ATP衰竭和细胞死亡17，故干脆损害DA能神经元的是MPP+。因MPP+和铁离子一样与神经黑色素有很高的亲合性，而黑质DA能神经元含有较高浓度的神经黑色素，所以 MPP+选择性地损伤了SNpc的 DA能神经元，中枢神经系统内其它部位的DA能神经元，如腹侧被盖区DA能神经元损伤则很小18。笔者在HE染色和TH免疫组化染色试验中也得到同样结果。DA合成限速酶TH与PD的关系很早就受到了普遍关注。TH已经成为DA神经元的标记酶。大量探讨证明，PD动物模型及PD病人体内TH从基因表达

19、、酶蛋白含量及分布到酶活性都存在广泛的异样变更，笔者的另一试验视察了各组小鼠中脑TH阳性黑质神经元，结果显示：模型组小鼠中脑SNpc内TH免疫组化视察到大量DA能神经元脱失，因而经黑质纹状体通路投射到纹状体的DA神经递质削减，从而引起小鼠多巴胺和乙酰胆碱系统平衡失调而产生行为学障碍；HE染色结果与银杏平颤方全方及拆方各组小鼠行为变更成正比，而且黑质区神经元的变性、退化及坏死程度较模型组均明显改善，仅个别小鼠有稍微的软化灶形成。HE染色和TH免疫组化染色结果相吻合，这表明中药可削减多巴胺神经元的丢失、增加多巴胺神经元内TH的表达，各组中药在不同的时间疗效各不相同，就削减多巴胺神经元丢失的数量而言

20、，在14天以解毒组最明显，28天以全方组最明显；就增加TH的表达而言，14天全方组和解毒组较明显，28天化瘀组较明显。这些改变说明中药银杏平颤方全方及拆方能使黑质神经元的损伤程度减轻，结构和功能接近正常，进一步从形态学方面证明了银杏平颤方全方及拆方可爱护神经组织免受MPTP引起的自由基增多及氧化损伤所造成的损害，从而为PD的防治供应形态学依据。 以上结果从行为学和神经病理角度分别证明白模型胜利。停药后小鼠行为复原较快与脑内的表现不太相符，这与其他学者的报道一样19，详细机制尚不清晰。中药各给药组（14天，28天）小鼠行为障碍有明显复原、TH免疫组化显示SNpc内DA能神经元数目较模型组明显增多

21、，且全方组和化瘀组更为明显一些。这些结果提示银杏平颤方及其拆方能改善PD小鼠的行为障碍、对DA能神经元的正常形态及功能有爱护作用。银杏平颤方及其拆方28天组治疗效果稍好一些，但与14天各组相比两者之间的差别并不很大，一方面提示银杏平颤方及其拆方对PD的治疗可能存在肯定的量效和时效关系，同时也说明在短时间内银杏平颤方及其拆方即可达到满足的治疗效果。 参考文献 1Graham DG. Catecholamine toxicity: a proposal for the molecular pathogenesis of manganese neurotoxicity and Parkinsons

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