western-blot-全过程-详细步骤(2页).doc

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1、-western-blot-全过程-详细步骤-第 2 页一：提蛋白：1. PBS洗2遍，加RIPA 80-100ul（含10xcooktail）。2. 在冰上刮到离心管中，在冰上裂解20-30min。3. 4度离心，13000rpm、10-15min（准备新的离心管、配BCA 200ul/每孔(A:B=50：1)、96孔板加PBS(2个对照组20ul，实验组18ul)）。4. 取上清转移到新离心管中，记住转移的体积。5. 96孔板中每孔加2ul蛋白液。6. 每孔加200ulA/B混合液。7. 37度半小时。8. 测浓度以及标化用一起 在libo文件夹找模板，最后得到每组需要加的RIPA以及lo

2、ding buffer，还有标化后的浓度。562波长 0.046斜率 （实验组值-对照组值）/斜率=浓度 浓度最好在4-8ug/ul最好，跑胶时就可以只加10ul蛋白液（蛋白含量40-80ug）9. 加好对应的RIPA以及loding buffer后，煮蛋白5-15min，-20度保存。二：跑胶1. 1.0玻板，洗干净2. 配制10%或者12%分离胶 一块胶需要5ml3. 灌分离胶，在分离胶上层灌无水乙醇4. 配制5%浓缩胶 2块胶需要4ml5. 待分离胶干后，灌浓缩胶，插梳子6. 待胶干后，将胶及玻板一起放入电泳槽，拔梳子，倒入1*running buffer（上腔灌满，下腔过电线丝）7.

3、预电泳，100v，10-15min8. 加样（蛋白样品及marker）10ul，marker 5ul9. 60v 10-20min，之后100-110v三：转膜1. 配transfer buffer ，用10*transfer buffer 稀释10倍，并加20%甲醇2. transfer buffer浸泡海绵、滤纸3. pvdf膜，甲醇泡1分钟，清水洗2次，泡在transfer buffer里20min4. 胶取出，在transfer buffer里泡10min5. 黑胶白膜（一层海绵，2层滤纸）6. 转膜100v，11.5h（黑对黑，冰板，在冰里跑）四：封闭、一抗、二抗15%脱脂奶粉（pb

4、st溶）1h 37度2.一抗4度12h3.pbst洗膜，3次，每次10min4.二抗（1:5000）1h 37度5. pbst洗膜，3次，每次10min6.显影剂A和B各300ulPBST：1000mlPBS+1mltween5%脱脂奶粉：100mlPBST+5g脱脂奶粉10*running buffer：tris 30.3g 甘氨酸 144.1g sds 10g 加水至1000ml10*transfer buffer：tris 30.3g 甘氨酸 144.1g 加水至1000ml1* transfer buffer：100ml10*transfer buffer 200ml甲醇 加水至1000ml