核酸的理化性质研究方法.ppt

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1、关于核酸的理化性质研究方法现在学习的是第1页，共28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v第十四章核酸的物理化学性质第十四章核酸的物理化学性质v一、核酸的水解一、核酸的水解v二、核酸的酸碱性质二、核酸的酸碱性质v三、核酸的紫外吸收三、核酸的紫外吸收v四、核酸的变性、复性及杂交四、核酸的变性、复性及杂交v第十五章核酸的研究方法第十五章核酸的研究方法v一、核酸的分离、纯化和定量测定一、核酸的分离、纯化和定量测定v二、核酸的超速离心二、核酸的超速离心v三、核酸的凝胶电泳三、核酸的凝胶电泳v四、核酸的核苷酸序列测定四、核酸的核苷酸序列测定v五、五、DNA聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）现在学习的

2、是第2页，共28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论核酸的化学结构和作为高聚物决定其理化性质：v核酸的糖苷键和磷酸二酯键：可被水解；v磷酸基和碱基：酸碱性质；v碱基：紫外吸收特性；v双螺旋结构：变性和复性。现在学习的是第3页，共28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论一、核酸的水解v（一）酸水解v糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解，产生嘌呤和嘧啶碱v（二）碱水解vRNA的磷酸酯键更易被碱水解（RNA的核糖上有2-OH，在碱作用下形成磷酸三酯，极不稳定易水解，产生核苷2，3-环磷酸酯，继续水解产生2-核苷酸和3-核苷酸）现在学习的是第4页，共28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论（三）酶水解v

3、专一水解核酸的磷酸二酯键的酶称为专一水解核酸的磷酸二酯键的酶称为核酸酶核酸酶(nuclease)(nuclease)。v能识别特定的核苷酸顺序，并从特定位点水解核酸的内切酶称为能识别特定的核苷酸顺序，并从特定位点水解核酸的内切酶称为限限制性核酸内切酶（限制酶）制性核酸内切酶（限制酶）。现在学习的是第5页，共28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论1、核酸酶的分类v（1）按底物专一性分类：v核糖核酸酶（核糖核酸酶（ribonuclease,RNaseribonuclease,RNase）：作用于核糖核酸；）：作用于核糖核酸；v脱氧核糖核酸酶（脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease,

4、DNasedeoxyribonuclease,DNase）：作用于脱氧核糖核）：作用于脱氧核糖核酸；酸；v（2）按底物作用的方式分类：v核酸外切酶（核酸外切酶（endonucleaseendonuclease）：）：从多核苷酸链的末端开始从多核苷酸链的末端开始,逐个将核苷逐个将核苷酸切下的酶酸切下的酶；v核酸内切酶核酸内切酶(exonuclease)(exonuclease)：从多核苷酸链的内部开始水解核酸的酶。从多核苷酸链的内部开始水解核酸的酶。现在学习的是第6页，共28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v（3）按磷酸二酯键断裂的方式分类：v一种是在3-OH与磷酸基之间断裂，其产物是5-

5、磷酸核苷酸或寡核苷酸,如（1）；v另一种是在5-OH与磷酸基之间断裂，其产物是3-磷酸核苷酸或寡核苷酸,如（2）。P P PN N N(1)(2)(1)(2)53现在学习的是第7页，共28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v2、核糖核酸酶类v牛胰核糖核酸酶、核糖核酸酶T1、核糖核酸酶T2等；v3、脱氧核糖核酸酶类v牛胰脱氧核糖核酸酶、牛脾脱氧核糖核酸酶、限制性内切酶等。v4、N糖苷酶现在学习的是第8页，共28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论核酸酶核酸酶底物底物切点切点产物产物胰核糖核酸酶胰核糖核酸酶RNA内切核酸酶嘧啶内切核酸酶嘧啶3端，留下端，留下3P3嘧啶单核苷酸或嘧啶单核苷酸或

6、3-嘧啶核苷酸结尾的寡嘧啶核苷酸结尾的寡聚核苷酸聚核苷酸蛇毒磷酸二酯蛇毒磷酸二酯酶酶RNA，DNA外切核酸酶外切核酸酶3端，端，留下留下3OH5单核苷酸单核苷酸牛脾磷酸二酯牛脾磷酸二酯酶酶RNA，DNA外切核酸酶外切核酸酶5端，端，留下留下5OH3单核苷酸单核苷酸大肠杆菌核酸大肠杆菌核酸外切酶外切酶单链单链DNA外切核酸酶外切核酸酶5端，端，留下留下5OH3单核苷酸及一个末单核苷酸及一个末尾二核苷酸尾二核苷酸大肠杆菌核酸大肠杆菌核酸外切酶外切酶双链双链DNA外切核酸酶外切核酸酶3端，端，留下留下3OH5单核苷酸单核苷酸现在学习的是第9页，共28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论现在学习的是

7、第10页，共28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论二、核酸的酸碱性质v1、碱基的解离C的的N3有一对未共用电子，可与质子结合；有一对未共用电子，可与质子结合；C的烯醇式羟基具有释放质子的能力；的烯醇式羟基具有释放质子的能力；U的的N3酸性解离的酸性解离的pK1=9.5;T的的N3酸性解离的酸性解离的pK1=9.9;A的的N1pK1=4.15G的的N7 pK1=3.2 N1pK2=9.6；N9 pK3=12.4现在学习的是第11页，共28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v2、核苷的解离戊糖的存在增强了碱基的酸性解离：戊糖的存在增强了碱基的酸性解离：A的的N1pK1由由4.15降为降为3

8、.63；C的的pK1由由4.6降为降为4.15；现在学习的是第12页，共28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论3、核苷酸的解离HpK11.5现在学习的是第13页，共28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v核苷酸有磷酸与碱基，为两性电介质；vU的碱基碱性极弱，不能形成兼性离子；的碱基碱性极弱，不能形成兼性离子；vA,G,C中，pK1：第一磷酸基：第一磷酸基-PO3H2的解离；的解离；pK2：含氮环：含氮环N+H-的解离；的解离；pK3：第二磷酸基：第二磷酸基-PO3H-的解离；的解离；故其故其pI（pK1+pK2）2vDNA变性双链打开后，碱基即参与酸碱滴定。变性双链打开后，碱基即参与酸

9、碱滴定。现在学习的是第14页，共28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论三、核酸的紫外吸收vPy和Pu有共轭双键，使 碱基、核苷、核苷酸和核酸能吸收紫外光，最大吸收峰为能吸收紫外光，最大吸收峰为260nm260nm。不同核苷酸不同核苷酸现在学习的是第15页，共28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论A260CL公式中，公式中，A A260为光密度为光密度，为，为260260nmnm处的碱苦摩尔消光系数处的碱苦摩尔消光系数C C，为每升溶液中碱基的摩尔数，为每升溶液中碱基的摩尔数L L，为比色杯内径的厚度，为比色杯内径的厚度如：已知鸟嘌呤溶液的如：已知鸟嘌呤溶液的A A2602600.325

10、0.325，7.2X107.2X103 3，L L1 1cmcm，则：则：C C0.325/(7.2X100.325/(7.2X103 3X1)X1)4.5X104.5X10-5-5（mol/lmol/l）紫外光区最大吸收：紫外光区最大吸收：260nm，定性定量分析，定性定量分析现在学习的是第16页，共28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论一、核酸的一般理化性质一、核酸的一般理化性质 v核酸具有酸性；核酸具有酸性；v粘度大；粘度大；现在学习的是第17页，共28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v 在理化因素作用下，在理化因素作用下，DNADNA双螺旋的两条互补链松散而双螺旋的两条互补链

11、松散而分开成为单链，从而导致分开成为单链，从而导致DNADNA的理化性质及生物学性质的理化性质及生物学性质发生改变，这种现象称为发生改变，这种现象称为DNADNA的变性的变性(denaturation)。v变性时维持双螺旋稳定性的变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂氢键断裂，碱基间的堆积力遭，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。现在学习的是第18页，共28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v增色效应：指增色效应：指DNA变性后对变性后对260nm紫外光的紫外光的光吸收度增加的现象；光吸收度增加的现象；v旋光性下降；旋光性下降；v粘度降低；粘度

12、降低；v生物学功能丧失或改变。生物学功能丧失或改变。v引起引起DNADNA变性的因素主要有：变性的因素主要有：高温，高温，强强酸、强碱，酸、强碱，有机溶剂等。有机溶剂等。vDNADNA变性后的性质改变：变性后的性质改变：现在学习的是第19页，共28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v DNADNA的变性温度的变性温度：加热：加热DNADNA溶液，使其对溶液，使其对260nm260nm紫紫外光的吸收度突然增加外光的吸收度突然增加，达到其最大值一半时，达到其最大值一半时的温度，就是的温度，就是DNADNA的的变性变性温度（融解温度，温度（融解温度，TmTm）。现在学习的是第20页，共28页第十

13、二章、核酸第十二章、核酸通论通论v TmTm的高低与的高低与DNADNA分子中分子中G+CG+C的含量的含量有关，有关，G+CG+C的含量的含量越高，则越高，则TmTm越高越高。Tm69.3+0.41(GC)12nd现在学习的是第21页，共28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v将热变性后的将热变性后的DNADNA溶液溶液缓慢冷却缓慢冷却，在低于变性温度约在低于变性温度约25253030的条件下保温一段时间的条件下保温一段时间（退火退火），则变性的两条单链），则变性的两条单链DNADNA可以重新互补而形成原来可以重新互补而形成原来的双螺旋结构并恢复原有的的双螺旋结构并恢复原有的性质。性质。

14、现在学习的是第22页，共28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v将变性将变性DNADNA经退火处理，使其重新形成双螺旋经退火处理，使其重新形成双螺旋结构的过程，称为结构的过程，称为DNADNA的复性的复性。现在学习的是第23页，共28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v 两条来源不同的单链两条来源不同的单链核酸（核酸（DNA或或RNA），只要它们有大致相同，只要它们有大致相同的互补碱基顺序，经退的互补碱基顺序，经退火处理即可复性，形成火处理即可复性，形成新的杂合双螺旋，这一新的杂合双螺旋，这一现象称为现象称为核酸的分子杂核酸的分子杂交交。现在学习的是第24页，共28页第十二章、核酸第十

15、二章、核酸通论通论v 核酸杂交可以是核酸杂交可以是DNA-DNA，也可以是，也可以是DNA-RNA杂交。杂交。v 不同来源的，具有大致相不同来源的，具有大致相同互补碱基顺序的核酸片段同互补碱基顺序的核酸片段称为称为同源顺序同源顺序。现在学习的是第25页，共28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v 利用核酸的分子杂交，可以确定或寻找不同物种中具利用核酸的分子杂交，可以确定或寻找不同物种中具有同源顺序的有同源顺序的DNA或或RNA片段。片段。v 常用的核酸分子杂交技术有：常用的核酸分子杂交技术有：Southern杂交杂交（鉴别（鉴别DNA）及）及Northern杂交杂交（鉴别（鉴别RNA）、原

16、位杂交、斑、原位杂交、斑点杂交等。点杂交等。v在核酸杂交分析过程中，常将已知顺序的核酸片段用放射性在核酸杂交分析过程中，常将已知顺序的核酸片段用放射性同位素或生物素进行标记。这种带有一定标记的已知顺序的同位素或生物素进行标记。这种带有一定标记的已知顺序的核酸片段称为核酸片段称为探针探针。现在学习的是第26页，共28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论问问 题：题：1 1、DNADNA热变性有何特点？热变性有何特点？T Tm m值表示什么？值表示什么？2 2、在、在pH7.0pH7.0，0.165mol/L NaCl0.165mol/L NaCl条件下，测得某一条件下，测得某一DNADNA样品的样品的TmTm为为89.3 89.3。求出四种碱基百分组成。求出四种碱基百分组成。3 3、DNADNA和和RNARNA的一级结构有何异同？的一级结构有何异同？4 4、简述、简述tRNAtRNA二级结构的组成特点及每一部分的功能。二级结构的组成特点及每一部分的功能。现在学习的是第27页，共28页第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论感谢大家观看感谢大家观看现在学习的是第28页，共28页