固相膜免疫技术讲稿.ppt

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1、第一页，讲稿共六十三页哦一、固相免疫测定一、固相免疫测定B与与F分离分离 Ab*Ab*Ag+Ag +Ab*Ab Ab第一节第一节 概述概述第二页，讲稿共六十三页哦二、固相膜的特点二、固相膜的特点多孔性多孔性 毛细管作用毛细管作用非共价键高度吸附抗体或抗原非共价键高度吸附抗体或抗原 高度敏感性高度敏感性易于漂洗易于漂洗 操作简便操作简便第三页，讲稿共六十三页哦三、常用的固相膜三、常用的固相膜玻璃纤维素玻璃纤维素(fiberglass)膜膜尼龙尼龙(nylon)膜膜聚偏氟乙稀聚偏氟乙稀(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜膜硝酸纤维素硝酸纤维素（nitrocellulose

2、，NC）膜膜第四页，讲稿共六十三页哦四、固相膜的技术要求四、固相膜的技术要求 孔径：孔径：0.20.20.6m0.6m或或5 510m10m 流速：以流速：以ml/cmml/cm2 2/min/min表示表示 蛋白质结合力：吸附力很强，以蛋白质结合力：吸附力很强，以g/cmg/cm2 2表示表示 均一性均一性第五页，讲稿共六十三页哦固相固相NC膜膜第六页，讲稿共六十三页哦第七页，讲稿共六十三页哦第八页，讲稿共六十三页哦五、固相微孔膜测定种类五、固相微孔膜测定种类1.1.斑点金免疫渗滤斑点金免疫渗滤试验试验(dot immunogold filtration assay,DIGFA)2.免疫层析

3、试验免疫层析试验（immunochromatography assay,ICA）3.斑点斑点ELISA(dot enzyme linked immunosorbent assay,Dot-ELISA)4.酶联免疫斑点试验酶联免疫斑点试验(enzyme linked immunospot assay,ELISPOT)5.免疫印迹法免疫印迹法(Immunoblotting Test,IBT)6.放射免疫沉淀试验放射免疫沉淀试验(radioimmunoprecipitation assay,RIPA)第九页，讲稿共六十三页哦六、膜固相免疫测定的特点六、膜固相免疫测定的特点优点优点不足之处不足之处简便

4、，快速简便，快速敏感度略低，价格略高（与敏感度略低，价格略高（与ELISAELISA比）比）单份测定单份测定精密度较差，质控困难精密度较差，质控困难保存期长（优质试剂）保存期长（优质试剂）稳定性较差（普通试剂）稳定性较差（普通试剂）可测定物范围广（主要为定性试验）可测定物范围广（主要为定性试验）不易制备定量、半定量试剂不易制备定量、半定量试剂感染性疾病的诊断感染性疾病的诊断妊娠、排卵的诊断妊娠、排卵的诊断肿瘤标志肿瘤标志心肌标志心肌标志滥用药物滥用药物第十页，讲稿共六十三页哦 第二节 免免 疫疫 金金 标标 记记 技技 术术 (Immunogold Labelling Techique)临床免

5、疫学和检验临床免疫学和检验第十一页，讲稿共六十三页哦一、概述一、概述1.概念概念 以胶体金作为标记物的免疫检测技术以胶体金作为标记物的免疫检测技术2.类型类型 免疫金组织化学技术免疫金组织化学技术 金免疫技术金免疫技术 金免疫测定技术金免疫测定技术第十二页，讲稿共六十三页哦二、胶体金基本知识二、胶体金基本知识1.1.胶体金的制备胶体金的制备(1)(1)在一定浓度在一定浓度的金溶液内加入定量的还原剂使金离子变成金原的金溶液内加入定量的还原剂使金离子变成金原子，形成金颗粒悬液，即胶体金子，形成金颗粒悬液，即胶体金（colloidalgold）,也称金溶也称金溶胶（胶（goldsol）。(2)HAu

6、Cl4是主要原料，常用的还原剂有柠檬酸钠等。良好的胶是主要原料，常用的还原剂有柠檬酸钠等。良好的胶体金应清亮透明，在洁净的玻璃器皿中可较长时间保存，加入体金应清亮透明，在洁净的玻璃器皿中可较长时间保存，加入NaNNaN3 3防腐防腐。第十三页，讲稿共六十三页哦2.2.四种粒径胶体金的制备及特性四种粒径胶体金的制备及特性胶体金粒径 胶体金特性（nm）呈色 max 16 橙色 518nm 24.5 橙红 522nm 41 红色 525nm 71.5 紫色 535nm 通过改变柠檬酸钠的用量可制得不同大小的胶体金颗粒通过改变柠檬酸钠的用量可制得不同大小的胶体金颗粒第十四页，讲稿共六十三页哦方方 法法

7、 金颗粒直径金颗粒直径白白 磷磷 法法 512nm抗坏血酸法抗坏血酸法 813nm枸橼酸钠法枸橼酸钠法 1695nm柠檬酸钠法柠檬酸钠法 16147nm乙醇乙醇-超声波法超声波法 610nm硼酸钠法硼酸钠法 25nm鞣酸鞣酸-枸橼酸钠法枸橼酸钠法 15nm还原剂不同，胶体金颗粒大小及特性不同还原剂不同，胶体金颗粒大小及特性不同第十五页，讲稿共六十三页哦胶体金（胶体金（Colloidal Gold）1560 nm优质优质 劣质劣质第十六页，讲稿共六十三页哦三、免疫金的特性和制备三、免疫金的特性和制备 胶体金可以和蛋白质等各种大分子物质胶体金可以和蛋白质等各种大分子物质结合，在免疫组化技术中，习惯

8、上将胶结合，在免疫组化技术中，习惯上将胶体金结合蛋白质的复合物称为体金结合蛋白质的复合物称为金探针金探针。用于免疫测定时，胶体金多与免疫活性用于免疫测定时，胶体金多与免疫活性物质（物质（AgAg或或AbAb）结合，这类结合物常称结合，这类结合物常称为为免疫金免疫金。第十七页，讲稿共六十三页哦胶体金结合物（胶体金结合物（Conjugate）第十八页，讲稿共六十三页哦四、免疫金（银）染色四、免疫金（银）染色（Immunogoldsilver Staining，IGSS）金标抗体金标抗体 待测抗原待测抗原+金标抗体金标抗体-抗原抗原银染液银染液 银（金标抗体银（金标抗体-抗原）抗原）第十九页，讲稿共

9、六十三页哦银离子的还原剂：对苯二酚胶体金及银原子起催化作用第二十页，讲稿共六十三页哦免疫金（银）染色应用免疫金（银）染色应用 多用于组织化学检测多用于组织化学检测 敏感度低于其它标记免疫技术，但经银加强染色敏感度低于其它标记免疫技术，但经银加强染色后敏感度与荧光免疫技术和酶免疫技术相当后敏感度与荧光免疫技术和酶免疫技术相当 近年来发展了不少近年来发展了不少IGSSIGSS方法以替代荧光免疫技术，方法以替代荧光免疫技术，可以在普通显微镜下进行检测可以在普通显微镜下进行检测第二十一页，讲稿共六十三页哦五、五、金免疫测定金免疫测定 斑点金免疫渗滤试验斑点金免疫渗滤试验（Dot Immunogold

10、Filtration Assay,DIGFA）金免疫层析试验金免疫层析试验（gold immunochromatography assay，GICA）第二十二页，讲稿共六十三页哦1.1.斑点金免疫渗滤试验（斑点金免疫渗滤试验（DIGFADIGFA）原理原理 硝酸纤维素膜为载体，利用微孔滤膜的硝酸纤维素膜为载体，利用微孔滤膜的吸附性及可滤过性，使抗原抗体反应和吸附性及可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上以液体渗滤洗涤在一特殊的渗滤装置上以液体渗滤过膜的方式迅速完成过膜的方式迅速完成 第二十三页，讲稿共六十三页哦DIGFADIGFA原理图原理图操作示意图操作示意图装置分解图装置分解图

11、盖盖微孔膜微孔膜吸水垫料吸水垫料底底第二十四页，讲稿共六十三页哦第二十五页，讲稿共六十三页哦技术类型技术类型 双抗体夹心法双抗体夹心法 包被抗体包被抗体 待检抗原待检抗原 金标抗体金标抗体 间接法间接法 包被抗原包被抗原 待检抗体待检抗体 金标抗抗体金标抗抗体 竞争法竞争法 包被抗原包被抗原 待检抗原待检抗原 金标抗体金标抗体斑点金免疫渗滤试验（斑点金免疫渗滤试验（DIGFA)第二十六页，讲稿共六十三页哦技术要点技术要点 试剂盒组成试剂盒组成免疫金标记物免疫金标记物渗滤装置（充满吸水垫料的塑料小盒渗滤装置（充满吸水垫料的塑料小盒,盒盖盒盖中央的小孔下面放置一片中央的小孔下面放置一片NCNC膜膜

12、,膜上预包被膜上预包被AgAg或或AbAb斑点）斑点）洗涤液洗涤液斑点金免疫渗滤试验（斑点金免疫渗滤试验（DIGFA)第二十七页，讲稿共六十三页哦2.2.胶体金免疫层析试验胶体金免疫层析试验 原理原理 以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔膜的毛细管作用，以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端横向渗移，犹滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端横向渗移，犹如横向层析一般，层析过程中在适当部位进行抗原如横向层析一般，层析过程中在适当部位进行抗原抗体反应抗体反应第二十八页，讲稿共六十三页哦LATERAL FLOW TEST STRIP OF VEDALAB30第二十九页，讲

13、稿共六十三页哦胶体金免疫层析试验胶体金免疫层析试验 技术类型技术类型 双双抗体夹心法抗体夹心法竞争法竞争法间接法间接法 第三十页，讲稿共六十三页哦双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原胶体金免疫层析试验胶体金免疫层析试验第三十一页，讲稿共六十三页哦ICA间接法测抗体间接法测抗体胶体金免疫层析试验胶体金免疫层析试验第三十二页，讲稿共六十三页哦第三十三页，讲稿共六十三页哦IFA与与ICA的比较的比较IFAIFAICAICA试剂形式试剂形式渗滤装置及附加试渗滤装置及附加试剂剂试剂条试剂条试剂保存试剂保存4 48 68 6个月个月室温一年室温一年操作步骤操作步骤3 35 51 1观察时间观察时间3 mi

14、n3 min3 320 min20 min阳性反应颜色浓度阳性反应颜色浓度操作结束颜色不变操作结束颜色不变颜色逐渐加深颜色逐渐加深第三十四页，讲稿共六十三页哦第三十五页，讲稿共六十三页哦GIFA技术的发展（间接法测抗体）技术的发展（间接法测抗体）阳性阴性固相膜固相膜固相固相抗原抗原待测待测抗体抗体金标记抗人金标记抗人IgGIgG抗体抗体人人IgGIgG固相抗人固相抗人IgGIgG抗体抗体快速检测（渗滤法）原理图快速检测（渗滤法）原理图第三十六页，讲稿共六十三页哦 ICA技术的发展技术的发展19901990年年 ABBOTTABBOTT公司公司 胶体硒标记胶体硒标记ICAICA Unipath

15、Unipath公司公司 CLEARVIEW CLEARVIEW 立明衣原体立明衣原体 彩色胶乳标记彩色胶乳标记ICAICA ROCHE Cardiac Reader ROCHE Cardiac Reader TnT TnT 定量定量 0.10.13 ng/ml3 ng/ml 合成合成TnTTnT质控点质控点第三十七页，讲稿共六十三页哦IFAIFA肌红蛋白肌红蛋白双孔法双孔法 S S：测定孔：测定孔 C C：定量质控：定量质控 100g/L100g/LIFAIFA微量白蛋白微量白蛋白单孔法单孔法 T T：测定孔：测定孔 C1C1：定量质控：定量质控 30 30 mg/Lmg/L C2 C2：定量

16、质控：定量质控 200 200 mg/Lmg/L 结果判定：结果判定：（-）30200 mg/L200 mg/LICAICA甲胎蛋白（甲胎蛋白（AFPAFP）参考值：参考值：30 g/L30 g/L肝癌诊断值：肝癌诊断值：400 400 g/Lg/L结果判定：结果判定：（-）30 400 g/L400 g/LSCTC2 C1测测定定线线对对照照线线 半定量测定半定量测定第三十八页，讲稿共六十三页哦 金免疫测定金免疫测定方法特点方法特点 试验所用试剂全部为干试剂，多个试剂被组合在一试验所用试剂全部为干试剂，多个试剂被组合在一个约个约6 6mmmm70mm70mm的塑料板条上，成为一单一试剂条。的

17、塑料板条上，成为一单一试剂条。1.1.吸水材料吸水材料 2.2.免疫金复合物干片（下），硝酸纤维素膜免疫金复合物干片（下），硝酸纤维素膜 （上）（上）T T：硝酸纤维素膜条包被特异抗体，硝酸纤维素膜条包被特异抗体，R R：参照区，包被有抗小鼠参照区，包被有抗小鼠IgGIgG。第三十九页，讲稿共六十三页哦 金免疫测定金免疫测定方法评价方法评价 简便、快速、单份测定，立等结果，除简便、快速、单份测定，立等结果，除试剂外无需任何仪器，且试剂稳定，适试剂外无需任何仪器，且试剂稳定，适合于急诊检验，但不能定量。合于急诊检验，但不能定量。(point of care test,POCT)”第四十页，讲稿共

18、六十三页哦 金免疫测定金免疫测定应用应用1.临床应用临床应用：定性分析，主要检测正常体液中不存定性分析，主要检测正常体液中不存在的生物活性物质，以及正常情况下体液中含量在的生物活性物质，以及正常情况下体液中含量很低而在某些疾病中升高的生物活性物质很低而在某些疾病中升高的生物活性物质。（1 1）传染病传染病：病毒相应抗原、抗体；性病病原体；细病毒相应抗原、抗体；性病病原体；细菌；寄生虫。菌；寄生虫。（2 2）激素激素：生殖标志物，如诊断早早孕生殖标志物，如诊断早早孕HCGHCG、检测排、检测排卵的促黄体生成素、促卵泡激素（卵的促黄体生成素、促卵泡激素（FSHFSH）等。等。第四十一页，讲稿共六十

19、三页哦 金免疫测定金免疫测定应用应用 （3 3）心血管病心血管病：急性心肌梗死的标志物：肌酸激酶的同工急性心肌梗死的标志物：肌酸激酶的同工酶酶CK-MB，肌红蛋白，肌钙蛋白肌红蛋白，肌钙蛋白-T及脂肪酸结合蛋白质及脂肪酸结合蛋白质（PABP）等；与心血管疾病有重要关系的等；与心血管疾病有重要关系的D-二聚体（二聚体（D-dimer）（4 4）肿瘤肿瘤：肿瘤标志物如前列腺特异抗原（肿瘤标志物如前列腺特异抗原（PSAPSA），），AFPAFP，CEACEA，CA125CA125及及CA15-3CA15-3，以及对肠道肿瘤筛查有重要意义的大便潜以及对肠道肿瘤筛查有重要意义的大便潜血免疫检测（血免疫检

20、测（FOBFOB）等等 （5 5）自身免疫病自身免疫病：抗双链抗双链DNADNA抗体和诊断甲状腺自身免疫病抗体和诊断甲状腺自身免疫病的甲状腺过氧化物酶（的甲状腺过氧化物酶（TPOTPO）抗体抗体 第四十二页，讲稿共六十三页哦 金免疫测定金免疫测定应用应用（6）毒品毒品 检测检测：尿液中的可卡因、大麻、吗啡、海洛因、苯丙：尿液中的可卡因、大麻、吗啡、海洛因、苯丙胺等。国外报道有可同时测胺等。国外报道有可同时测7种毒品的种毒品的GICA。（7）其它其它 检测：检测：C-反应蛋白，半定量检测血清反应蛋白，半定量检测血清-脂蛋白。脂蛋白。2.非临床应用：非临床应用：可用于食品检测，环境污染，生物沾染，

21、还可用于生物战剂的可用于食品检测，环境污染，生物沾染，还可用于生物战剂的快速检测，兽医学及法医学等方面检测。快速检测，兽医学及法医学等方面检测。第四十三页，讲稿共六十三页哦 金免疫测定金免疫测定的重点和展望的重点和展望 临床应用的重点应放在临床应用的重点应放在（1 1）急需快速诊断以便进行治疗的急重症，如协助确诊急性心肌梗死的急性）急需快速诊断以便进行治疗的急重症，如协助确诊急性心肌梗死的急性心梗标志物。心梗标志物。（2 2）有普查意义的检查和流行病学调查：如各种传染病（病毒性肝炎，艾滋有普查意义的检查和流行病学调查：如各种传染病（病毒性肝炎，艾滋病，性病及其它各种流行病）流行病调查；病，性病

22、及其它各种流行病）流行病调查；（3 3）某些肿瘤（如前列腺癌，结肠癌，肝癌，乳腺癌）的普查及预防检查；）某些肿瘤（如前列腺癌，结肠癌，肝癌，乳腺癌）的普查及预防检查；（4 4）围产期的健康普查等。）围产期的健康普查等。（5 5）作为快速的初筛普查手段，对阳性和可疑的结果再进一步做更细的可）作为快速的初筛普查手段，对阳性和可疑的结果再进一步做更细的可靠的检查靠的检查。第四十四页，讲稿共六十三页哦 金免疫测定金免疫测定今后的发展今后的发展 (1)(1)全面提高质量。突出质量控制的保证。全面提高质量。突出质量控制的保证。(2)(2)提高检测的灵敏度。目前检测的灵敏度都低于相应的定量免疫提高检测的灵敏

23、度。目前检测的灵敏度都低于相应的定量免疫分析，应尽量缩小差距。除使用各种优质的原料，如膜条，高纯分析，应尽量缩小差距。除使用各种优质的原料，如膜条，高纯度高亲和力的配体（特别是配伍好的优质单抗），优质高比度的度高亲和力的配体（特别是配伍好的优质单抗），优质高比度的标记配体以及先进的工艺外，还应引进信号放大系统，例如生物标记配体以及先进的工艺外，还应引进信号放大系统，例如生物素素-链亲和素系统，应用链亲和素与生物素结合的四价性及极高的链亲和素系统，应用链亲和素与生物素结合的四价性及极高的亲和常数，可明显提高灵敏度。亲和常数，可明显提高灵敏度。第四十五页，讲稿共六十三页哦 金免疫测定金免疫测定今后

24、的发展今后的发展(3)(3)实现半定量和定量化。实现半定量和定量化。(4)(4)检测多种分析物。同一个膜上可同时测定几种有相关意义的分检测多种分析物。同一个膜上可同时测定几种有相关意义的分析物，如乙型肝炎不同的抗原及抗体。析物，如乙型肝炎不同的抗原及抗体。(5)(5)建立检测全血的方法。主要针对急重症快速诊断之用，建立检测全血的方法。主要针对急重症快速诊断之用，以减少分离血清的时间。德国宝灵曼生产的人肌钙蛋白以减少分离血清的时间。德国宝灵曼生产的人肌钙蛋白GICAGICA便采用全血检测方法。检测全血的方法对自检，患者床旁检查便采用全血检测方法。检测全血的方法对自检，患者床旁检查和边远地区的普查

25、都有实际应用意义。和边远地区的普查都有实际应用意义。第四十六页，讲稿共六十三页哦第四十七页，讲稿共六十三页哦 一、斑点酶免疫吸附试验一、斑点酶免疫吸附试验 Dot-ELISA第四十八页，讲稿共六十三页哦二、酶联免疫斑点试验二、酶联免疫斑点试验 ELISPOT 20世纪世纪80年代，国外的科研工作者根据年代，国外的科研工作者根据ELISA技术的基本原理，建立了体外检测技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌特异性抗体分泌B细胞和细胞因子分泌细胞和细胞因子分泌T细胞的酶联免疫斑点试验细胞的酶联免疫斑点试验(enzyme linked immunospot,ELISPOT)。第四十九页，讲稿共六

26、十三页哦 ELISPOT 检测原理检测原理 细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT 底物孵育后，底物孵育后，PVDF 孔板出现孔板出现“紫色紫色”的斑的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过点表明细胞产生了细胞因子，通过 ELISPOT 酶联斑点分酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。析系统对斑点的分析后得出结果。第五十

27、页，讲稿共六十三页哦第五十一页，讲稿共六十三页哦ELISAPOT第五十二页，讲稿共六十三页哦ELISPOT结果判断结果判断第五十三页，讲稿共六十三页哦 三、免疫印迹法三、免疫印迹法 Western blot将将凝胶电泳凝胶电泳与与固相免疫固相免疫测定结合起来，将经电泳分区的蛋白质精确测定结合起来，将经电泳分区的蛋白质精确且近似定量地转移到固相载体上如硝酸纤维素膜且近似定量地转移到固相载体上如硝酸纤维素膜(NCNC膜膜)，并保持，并保持其原有的生物活性，再经荧光免疫、酶免疫、放射免疫技术其原有的生物活性，再经荧光免疫、酶免疫、放射免疫技术等进行测定，可得以定位、定性和定量结果。实质上分等进行测定

28、，可得以定位、定性和定量结果。实质上分3 3步步骤，即：蛋白质组分分离、各组分转印及免疫检测。骤，即：蛋白质组分分离、各组分转印及免疫检测。第五十四页，讲稿共六十三页哦 免疫印迹法免疫印迹法第五十五页，讲稿共六十三页哦 操作步骤操作步骤 1.蛋 白 质 分 离蛋 白 质 分 离 采 用 聚 丙 稀 酰 胺 凝 胶 电 泳采 用 聚 丙 稀 酰 胺 凝 胶 电 泳(polyacryamide gel electrophoresis,PAGE)进行分离。进行分离。2.2.蛋白质转印蛋白质转印 从凝胶上将蛋白质转移至从凝胶上将蛋白质转移至NCNC膜膜 等固相载体的过程即为蛋白质转印。等固相载体的过程

29、即为蛋白质转印。3.3.蛋白质的免疫检测蛋白质的免疫检测 将已转印将已转印NCNC膜封闭，用酶免疫组膜封闭，用酶免疫组化技术、免疫金组化技术等检测化技术、免疫金组化技术等检测。第五十六页，讲稿共六十三页哦 应用举例应用举例用免疫印迹法检查患者血清中的用免疫印迹法检查患者血清中的HIVHIV病毒抗体病毒抗体第五十七页，讲稿共六十三页哦凝胶凝胶NCNC膜膜转移转移第五十八页，讲稿共六十三页哦第五十九页，讲稿共六十三页哦4.4.加入标记抗人加入标记抗人IgIg第六十页，讲稿共六十三页哦第六十一页，讲稿共六十三页哦Western Blot 检测检测HIV第六十二页，讲稿共六十三页哦感谢大家观看感谢大家观看第六十三页，讲稿共六十三页哦