基因功能研究常用方法讲稿.ppt

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1、关于基因功能研究常用方法第一页，讲稿共六十六页哦 弄清基因的生物学功能,才能明确基因在疾病发生中的具体作用、弄清疾病发生的分子机制。常用的基因功能研究技术包括：（1）DNA克隆技术克隆技术（2）转基因技术和核转移技术（动物克隆）转基因技术和核转移技术（动物克隆）（3）基因敲除技术）基因敲除技术（4）反义技术）反义技术（5）RNA干涉技术干涉技术第二页，讲稿共六十六页哦 第一节第一节 DNA克隆技术克隆技术第三页，讲稿共六十六页哦克隆克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为获取同一拷贝的过程称为克隆化克隆化(cloning)

2、，即即无性无性繁殖繁殖。（一）（一）DNA克隆克隆第四页，讲稿共六十六页哦技术水平：技术水平：分子克隆分子克隆 即即DNA 克隆克隆 细胞克隆细胞克隆个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）第五页，讲稿共六十六页哦DNA克隆克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的接合成一具有自我复制能力的DNA分子分子复制子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛复制子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的

3、转化子细胞，再进行扩增提取获选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一得大量同一DNA分子。分子。也称也称基因克隆或重组基因克隆或重组DNA。第六页，讲稿共六十六页哦生物技术工程生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等、细胞工程等目的目的 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程基因工程(genetic engineering)实现基因克隆实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组重组DNA工艺

4、学工艺学。第七页，讲稿共六十六页哦（二）工具酶（二）工具酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNA聚合酶聚合酶 逆转录酶逆转录酶 T4DNA连接酶连接酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 末端转移酶末端转移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶第八页，讲稿共六十六页哦重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶第九页，讲稿共六十六页哦（三）目的基因（三）目的基因 cDNA 基因组基因组DNA目的基因目的基因 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）第十页，讲稿共六十六页哦（四）基因载体（四）基因载体定义定义为携带目的基

5、因，实现其无性繁殖或表为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。分子。常用载体常用载体质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA第十一页，讲稿共六十六页哦克隆载体克隆载体(cloning vector)为使插入的外源为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。载体称为克隆载体。表达载体表达载体(expression vector)为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。链而特意设计的载体称为表达载体。第十二页，讲稿共六十六页哦载

6、体的选择标准载体的选择标准 能自主复制；能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；选和鉴定；有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNA。第十三页，讲稿共六十六页哦1.1.质粒质粒(plasmid)特点特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。第十四页，讲稿共六十六页哦噬菌体噬

7、菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）2.噬菌体噬菌体(phage)M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列pUC系列系列第十五页，讲稿共六十六页哦3.粘性质粒粘性质粒(cosmid)第十六页，讲稿共六十六页哦酵母人工染色体酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)细菌人工染色体细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)动物病毒动物病毒DNA改造的载

8、体改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他其他第十七页，讲稿共六十六页哦二、重组二、重组DNA技术基本原理技术基本原理克隆基本过程克隆基本过程目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体菌导入受体菌外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 第十八页，讲稿共六十六页哦 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程目目 录录第十九页，讲稿共六十六页哦（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取1.化学合成法化学合成法要求：已知目的基因

9、的核苷酸序列或其产物的要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列氨基酸序列。2.基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)3.cDNA文库文库(cDNA library)4.聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)（见第（见第22章）章）第二十页，讲稿共六十六页哦（二）克隆载体的选择和构建（二）克隆载体的选择和构建若将外源基因连接到复制子(基因载体)上,外源DNA就可以作为复制子的一部分在受体细胞内复制.在基因克隆中基因载体的选择与构建是一项技术性很强的工作,直接影响到基因克隆的成败.第二十一页，讲稿共六十六页哦（

10、三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接1.1.粘性末端连接粘性末端连接方式：方式：(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接配伍末端连接配伍末端连接非配伍末端连接非配伍末端连接第二十二页，讲稿共六十六页哦受体菌条件受体菌条件安全宿主菌安全宿主菌（从大肠杆菌（从大肠杆菌K-12改造）改造）限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态导入方式导入方式转化转化 转染转染 感染感染（四）重组（四）重组DNA导入受体菌导入受体菌第二十三页，讲稿共六十六页哦（五）重组体的筛选（五）重组体的筛选 1.直接选择法直接选择法(1)抗药性标

11、记选择抗药性标记选择(2)标志补救标志补救(marker rescue)(3)分子杂交法分子杂交法原位杂交原位杂交Southern印迹印迹 2.免疫学方法免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等第二十四页，讲稿共六十六页哦重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表

12、型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交目目 录录第二十五页，讲稿共六十六页哦 第二节第二节 转基因技术与核转移技术转基因技术与核转移技术第二十六页，讲稿共六十六页哦转基因技术转基因技术采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。发育成个体。转基因转基因被导入的目的基因被导入的目的基因转基因动物转基因动物(transgenic animal)目的基因的受体动物目的基因的受体动物一、转基因技术一、转基因技术第二十七页，讲稿共六十六页哦第二十八页，讲

13、稿共六十六页哦第二十九页，讲稿共六十六页哦 转基因动物是动物整体水平研究目的基因转基因动物是动物整体水平研究目的基因的生物技术，特点是的生物技术，特点是“分子及其细胞水平分子及其细胞水平的操作，组织及动物整体水平表达的操作，组织及动物整体水平表达”第三十页，讲稿共六十六页哦 转基因动物构建过程转基因动物构建过程 转基因载体的构建 将转基因载体导入受精卵细胞或者胚胎干细胞 将转基因受精卵或胚胎干细胞植入假孕小鼠子宫中 对转基因动物进行鉴定第三十一页，讲稿共六十六页哦 转基因的技术方法转基因的技术方法 DNA显微注射法 克隆法 胚胎干细胞技术 逆转录病毒介导的基因转移 精子载体法等各有优点和缺点，

14、常用的是显微注射和克隆法第三十二页，讲稿共六十六页哦 转基因动物的鉴定转基因动物的鉴定 Southern杂交 确定外源基因的整合以及整合的拷贝数 RT-PCR 确定外源基因的转录和转录水平 Western杂交 确定外源基因蛋白质的表达情况 实时PCR（荧光定量PCR）第三十三页，讲稿共六十六页哦 转基因技术的应用转基因技术的应用（1）建立致病基因表达、调控的动物模型（2）动植物新品种的培育（3）各种基因工程产品的制备（4）探讨生殖细胞的基因治疗方法第三十四页，讲稿共六十六页哦 第三十五页，讲稿共六十六页哦核转移技术核转移技术 即即动物整体克隆技术动物整体克隆技术，将动物体细胞核全，将动物体细胞

15、核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之部导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之发育成个体，即克隆发育成个体，即克隆(clone)。这样的个体所携带的性状仅来自一个父亲或这样的个体所携带的性状仅来自一个父亲或母亲个体母亲个体,为无性繁殖为无性繁殖.19961996年年,克隆羊克隆羊”多莉多莉”的产生成为当年的产生成为当年分子生物学发展最重要的事件分子生物学发展最重要的事件二、核转移技术二、核转移技术第三十六页，讲稿共六十六页哦 克隆羊克隆羊“第三十七页，讲稿共六十六页哦第三十八页，讲稿共六十六页哦基因剔除技术基因剔除技术也称也称基因靶向基因靶向(gene targeting)灭活，有目灭活，有

16、目的去除动物体内某种基因的技术。的去除动物体内某种基因的技术。第三节、基因剔除技术第三节、基因剔除技术第三十九页，讲稿共六十六页哦 基因剔除程序基因剔除程序 将灭活的基因放入胚胎干细胞(ES细胞),使这一灭活的基因通过同源重组取代原有目的基因,筛选到基因定点灭活的细胞后,通过显微注射到小鼠囊胚.细胞在小鼠囊胚参与胚胎的发育,最终形成嵌合体小鼠,由于一部分生殖细胞来源于ES细胞,通过小鼠培养可获得纯合子基因剔除小鼠.第四十页，讲稿共六十六页哦 基因转移和基因剔除技术在基因转移和基因剔除技术在医学中的应用医学中的应用建立动物疾病可遗传的模型建立动物疾病可遗传的模型,探讨疾病发生机制探讨疾病发生机制

17、 单基因决定疾病模型单基因决定疾病模型 进行基因剔除以模拟基因失活进行基因剔除以模拟基因失活.单基因疾病模型单基因疾病模型:地中海贫血地中海贫血,动脉硬化动脉硬化,老年痴呆等老年痴呆等 多基因决定疾病模型多基因决定疾病模型 多基因疾病模型多基因疾病模型:肿瘤肿瘤,高血压高血压,糖尿病糖尿病第四十一页，讲稿共六十六页哦 第四节第四节 基因沉默技术基因沉默技术第四十二页，讲稿共六十六页哦基因沉默技术基因沉默技术 反义(antisen)技术 RNA干涉(RNA Interference,RNAi)第四十三页，讲稿共六十六页哦反义技术反义技术 反义RNA是根据RNA序列合成的互补RNA,可分为三类:作

18、用于核蛋白体结合位点或与靶mRNA形成双链;作用于非编码区;作用于启动子 反义DNA在DNA或RNA水平上以至转录与翻译,其稳定性好,有广泛药用价值 核酶是具有酶活性的RNA,参与RNA加工与成熟,人工合成的核酶能抑制特定基因的表达第四十四页，讲稿共六十六页哦RNA干涉干涉(RNAi)RNA干涉技术是利用体外合成的短双链RNA(21-23nt)抑制细胞内特定基因表达的技术,是转录后基因失活的一种研究基因功能的有力工具 机制:第四十五页，讲稿共六十六页哦Dicer第四十六页，讲稿共六十六页哦siRNA第四十七页，讲稿共六十六页哦Initiation StepATPATPADP+ppiADP+pp

19、iDICERKINASERdRP第四十八页，讲稿共六十六页哦Effector Step siRNA binding siRNA unwinding RISC activation第四十九页，讲稿共六十六页哦第五十页，讲稿共六十六页哦 医学分子生物学课程作业根据自身专业和研究方向，以RNAi技术在XXX领域的研究进展为题目，写一篇小综述。写作要求：1.按照一般发表文献的格式书写。2.可查阅CNKI（中国知网）或Pubmed上相关文献，不得抄袭！3.字数：3000字左右。4.不得抄袭！不得抄袭！第五十一页，讲稿共六十六页哦论文格式 题目 摘要（Abstract)200字以内 正文前言正文问题与展望

20、参考文献 10-15篇第五十二页，讲稿共六十六页哦 完成方式：手写稿或电子打印稿 完成日期：2012年12月15日前交到医学实验楼B-312或者下周上课课堂上交。第五十三页，讲稿共六十六页哦疾病相关基因的克隆与鉴定疾病相关基因的克隆与鉴定Cloning and Identification of Disease Relative Genes第第 五五 节节第五十四页，讲稿共六十六页哦克隆疾病相关基因的策略克隆疾病相关基因的策略（一）功能性克隆（一）功能性克隆(functional cloning)（二）定位克隆（二）定位克隆(positional cloning)（三）非定位候选基因克隆策略（

21、三）非定位候选基因克隆策略(position-independent candidate gene approaches)（四）定位候选基因克隆策略（四）定位候选基因克隆策略(positional candidate gene approaches)第五十五页，讲稿共六十六页哦定义定义 从对一种致病基因的功能的了解从对一种致病基因的功能的了解出发，克隆该致病基因。出发，克隆该致病基因。（一）功能性克隆（一）功能性克隆应用应用 生化机制已明确、基因表达产物生化机制已明确、基因表达产物较易得到部分纯化的遗传性疾病。较易得到部分纯化的遗传性疾病。第五十六页，讲稿共六十六页哦克隆方式克隆方式 利用特异

22、性抗体筛选表达型利用特异性抗体筛选表达型cDNA文库；文库；根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探针根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探针，筛选，筛选cDNA文库。文库。第五十七页，讲稿共六十六页哦（二）定位克隆（二）定位克隆定义定义从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因。围，最后克隆该基因。系统的定位克隆工作系统的定位克隆工作 遗传学分析遗传学分析(确定致病基因染色体定位确定致病基因染色体定位)交换分析、连锁不平衡分析交换分析、连锁不平衡分析 分子生物学分析分子生物学分析染色体异常染色体异常(缺失、易位等缺失、易位等)分析、基

23、因文库分析、基因文库的筛选与基因克隆的筛选与基因克隆第五十八页，讲稿共六十六页哦基因定位的基本方法 1.体细胞杂交法 p283 2.原位杂交和荧光原位杂交 3.连锁分析第五十九页，讲稿共六十六页哦体细胞杂交:细胞杂交又称细胞融合,是将来源不同的两种细胞融合成一个新细胞(杂种细胞).大多数细胞杂交是用人的细胞与小鼠的体细胞杂交,它的特点是在其繁殖传代过程中保留小鼠染色体而人染色体逐渐丢失 仅保留少数甚至一条人染色体的细胞正是进行基因连锁分析和基因定位的有用材料只需要集中精力于某一染色体上,就可找到某一基因座位第六十页，讲稿共六十六页哦原位杂交和荧光原位杂交(FISH):根据疾病基因所编码蛋白质的

24、信息,将其mRNA反转录成cDNA,再以cDNA为探针从基因组DNA中钓取该蛋白质量的编码基因 如:用及珠蛋白基因的cDNA作探针,与各种不同的人/鼠杂种细胞进行原位杂交,找出cDNA探针与人染色体DNA的同源互补关系,从而将及珠蛋白基因分别定位于第16号和第11号染色体上.第六十一页，讲稿共六十六页哦连锁分析 原理:基因在染色体上成直线排列,不同基因相互连锁成连锁群,即应用被定位的基因与同一染色体上另一基因或者遗传标记相连锁的特点进行定位 利用某个待定位的基因是否与某个遗传存在连锁关系,以及连锁的紧密程度就能将该基因定位到染色体的一定部位.第六十二页，讲稿共六十六页哦 定位克隆程序举例杜氏肌

25、营养不良(DMD)致病基因的克隆是一个定位克隆的过程,分为两阶段进行:首先,通过遗传学的家族分析确定了致病基因是位于Xp21,从而完成了该基因的染色体定位.接着,研究人员利用一个Xp21区带缺失的病例采用扣除杂交实验进行了基因克隆原理:将病人的DNA与正常人的DNA进行杂交,从而减掉了相同的基因序列,最后剩余的序列即为病人缺失的基因DMD,该基因的产物被命名为肌营养不良蛋白第六十三页，讲稿共六十六页哦（三）表型克隆（三）表型克隆 定义:建立在表型的基础上,对特定致病基因DNA片断的直接克隆.从疾病的表型出发,直接对产生变异的DNA片断进行克隆,而不依赖基因的染色体位置或基因产物的信息.如:代表

26、性差异分析(RDA技术)p285第六十四页，讲稿共六十六页哦人类基因组计划与疾病相关基因克隆人类基因组计划与疾病相关基因克隆当致病基因的染色体定位确认后，人们可以当致病基因的染色体定位确认后，人们可以利用因特网上的基因网站利用因特网上的基因网站(NCBI)(NCBI)所提供基因序列数所提供基因序列数据，鉴定出候选致病基因。据，鉴定出候选致病基因。利用基因组数据库利用基因组数据库,通过同源序列比较与分析通过同源序列比较与分析(BLAST),(BLAST),在计算机上就可以进行疾病相关基因或新基在计算机上就可以进行疾病相关基因或新基因的拼接克隆因的拼接克隆,甚至不需要传统意义的实验操作甚至不需要传统意义的实验操作第六十五页，讲稿共六十六页哦感谢大家观看感谢大家观看第六十六页，讲稿共六十六页哦