基因工程工具酶讲稿.ppt

《基因工程工具酶讲稿.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因工程工具酶讲稿.ppt（76页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、关于基因工程工具酶第一页，讲稿共七十六页哦DNADNA重组技重组技术的基本工术的基本工具具“分子手分子手术刀术刀”“分子运分子运输车输车”“分子分子缝合针缝合针”基因工程基因工程的工具酶的工具酶 限制性内切酶限制性内切酶I型限制性内切酶型限制性内切酶II型限制性内切酶型限制性内切酶III型限制性内切酶型限制性内切酶 DNA连接酶连接酶E.coli DNA连接酶连接酶T4 DNA连接酶连接酶 载体载体克隆载体克隆载体表达载体表达载体第二页，讲稿共七十六页哦一、基因工程的工具酶1 1、工具酶的概念与种类、工具酶的概念与种类工具酶：工具酶：凡是基因工程中应用的酶类通称为基因工程工具酶。凡是基因工程中

2、应用的酶类通称为基因工程工具酶。修修饰饰切切连连按按用用途途为为三三类类限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶DNADNA连接酶连接酶DNADNA修饰酶修饰酶第三页，讲稿共七十六页哦2 2、限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶(restriction enzyme)（1 1）限制性核酸内切酶的）限制性核酸内切酶的概念概念核酸酶：核酸酶：切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，导致核切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的酶叫做核酸酶。酸分子多核苷酸链发生水解断裂的酶叫做核酸酶。限制性核酸内切酶：限制性核酸内切酶：一类能识别双链一类能识别双链DNA分子中分子中特异

3、特异的核苷的核苷酸序列（酸序列（48bp），并由此处），并由此处切割切割DNA双链的核酸内切酶。双链的核酸内切酶。第四页，讲稿共七十六页哦（2 2）限制性核酸内切酶的）限制性核酸内切酶的发现发现for the discovery of restriction enzymes and their application to problems of molecular geneticsThe Nobel Prize in Physiology or Medicine 1978Werner Arber Switzerland 1929Daniel Nathans USA 19281999Hamil

4、ton O.Smith USA1931第五页，讲稿共七十六页哦 20世纪世纪60年代在研究细菌的年代在研究细菌的限制限制和和修饰修饰现象时被现象时被Linn和和Arber发发现。现。寄主限制与修饰现象寄主限制与修饰现象(Restriction and modification)在在E.coli K上生长的上生长的噬体则噬体则表示为表示为（K）。）。实验表明，用这种实验表明，用这种（K）噬）噬菌体感染菌体感染E.coli B，形成噬菌，形成噬菌斑的效率就很低斑的效率就很低因此因此（K）噬菌体受到了）噬菌体受到了B菌菌体的限制。体的限制。11第六页，讲稿共七十六页哦限制性内切酶将侵入细菌体内的外源

5、限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片段切成小片段。限制（限制（Restriction）第七页，讲稿共七十六页哦细菌自身的细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。被自身的限制性内切酶识别切割。修饰（Modification）Dam甲基化酶甲基化酶GATC 腺嘌呤腺嘌呤N6位位置引入甲基置引入甲基 Dcm甲基化酶甲基化酶CCAGG或或CCTGG序列在第二个序列在第二个C上上C5位置上引入甲基位置上引入甲基第八页，讲稿共七十六页哦生物体内普遍存在的限制修饰现象。限制是生物体内普遍存在的限制修饰现象。限制是rest

6、riction,修饰修饰modification,所以把这一系统叫做：所以把这一系统叫做：R/M体系。体系。限制与修饰是由两种酶引起的限制与修饰是由两种酶引起的，一种是甲基转移酶，一种是核酸内切酶，一种是甲基转移酶，一种是核酸内切酶。限制与修饰存在两方面限制与修饰存在两方面的作用的作用：一是保护自身：一是保护自身的的DNA不受限制，即不受限制，即不被切割；二是破坏不被切割；二是破坏外源外源DNA使之迅速降使之迅速降解。解。第九页，讲稿共七十六页哦（3 3）限制性核酸内切酶的）限制性核酸内切酶的种类种类第十页，讲稿共七十六页哦（4 4）限制性核酸内切酶的）限制性核酸内切酶的命名命名属名属名 种名

7、种名 株名株名Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌d株株Hind III同一菌株中所含的多个不同的同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶EcoR IEscherichia属名属名Coli种名种名Ry13株系株系编号编号 若种名头若种名头2 2个个字母相同则其中字母相同则其中一个可用种名的一个可用种名的第一和第三个字第一和第三个字母。母。第十一页，讲稿共七十六页哦（5 5）限制性核酸内切酶的）限制性核酸内切酶的特征特征l特异的识别序列、严格切割位点特异的识别序列、严格切割位点EcoR I的切割位点的切割位点EcoR I的识别序列的识别序列

8、5 G C T G A A T T C G A G 33 C G A C T T A A G C T C 5Cleavage sites识别识别-8个相连的核苷酸个相连的核苷酸 4 个碱基识别位点：个碱基识别位点：Sau3A GATC 5 个碱基识别位点：个碱基识别位点：EcoR CCWGG Nci CCSGG 6 个碱基识别位点：个碱基识别位点：EcoR GAATTC识别序列识别序列与与DNA的的来源无关来源无关识别序列越长识别序列越长切割频率越小切割频率越小识别序列越短识别序列越短切割频率越大切割频率越大第十二页，讲稿共七十六页哦l识别序列特点识别序列特点 回文结构回文结构(palindr

9、ome)EcoR I5 G C T G A A T T C G A G 33 C G A C T T A A G C T C 5 5 GG-A-T-C-C 3 3 C-C-T-A-GG 5 BamHI居居 然然 天天 上上 客客 客客上上天天然然居居l切点大多数在识别序列之内，也有的在序列两侧切点大多数在识别序列之内，也有的在序列两侧Sau3A 5 GATC 3EcoR 5 CCWGG 3 Nci 5 CCSGG 3 EcoR 5 GAATTC 3 第十三页，讲稿共七十六页哦l切点大多数在识别序列之内，也有的在序列两侧切点大多数在识别序列之内，也有的在序列两侧Sau3A 5 GATC 3Eco

10、R 5 CCWGG 3 Nci 5 CCSGG 3 EcoR 5 GAATTC 3 l限制酶切后产生两个末端限制酶切后产生两个末端末端结构：末端结构：-和和-末端种类：末端种类：平头末端和黏性末端平头末端和黏性末端 -端突起和端突起和-端突起端突起第十四页，讲稿共七十六页哦PstI等产生的等产生的3粘性末端粘性末端5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5PstI 37 5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 33 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5第十五页，讲稿共七十六页哦-端突

11、起端突起 Pst I 5-CTGCAG-3 5-CTGCA G-3 3-GACGTC-5 3-G ACGTC-5-端突起端突起 EcoRI 5-GAATTC-3 5-G AATTC-3 3-CTTAAG-5 3-CTTAA G-5平头末端（平头末端（Blunt ends）SmaI 5-CCCGGG-3 5-CCC GGG-3 3-GGGCCC-5 3-GGG CCC-5第十六页，讲稿共七十六页哦粘性末端的意义粘性末端的意义ii）同一个）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。以连接成环形分子。i）不同的）不同的DNA双链：只要粘性末

12、端碱基互补就可以连接双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平齐末端容易的多。这比连接两个平齐末端容易的多。连接便利连接便利粘性末端标记粘性末端标记凸出的凸出的5 末端可用末端可用DNA多核苷酸激酶进行多核苷酸激酶进行32P标记。凸出的标记。凸出的3端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或或TTT等）造成人工粘性末端。等）造成人工粘性末端。补平成平齐末端补平成平齐末端粘性末端可以用粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。聚合酶补平成平齐末端。第十七页，讲稿共七十六页哦（6）同位酶、同尾酶与同裂酶同位酶、同尾酶与同裂酶同

13、位酶：同位酶：具有相同的识别序列，但是酶切位点不同。具有相同的识别序列，但是酶切位点不同。SmaI CCCGGG XmaI CCCGGG同尾酶：同尾酶：来源各异，识别序列不同，但切割后产生相同的黏性末端。来源各异，识别序列不同，但切割后产生相同的黏性末端。Sal I G TCGAC Xho I C TCGAG同裂酶：同裂酶：能识别相同序列，且识别位点与切割位点均相同，但来能识别相同序列，且识别位点与切割位点均相同，但来源不同的两种或多种限制酶。源不同的两种或多种限制酶。SstI CCGC GG SacI CCGC GG第十八页，讲稿共七十六页哦（7）大部分）大部分II 型核酸内切酶需要的反应条

14、件型核酸内切酶需要的反应条件不同的酶使用不同的类型反应体系不同的酶使用不同的类型反应体系Tris-HCl50 mM pH 7.4MgCl210 mMDTT/BSA1 mMVolume20-100 lTep.and Time37,1-1.5 hr1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小时，完小时，完全水解全水解 1 g 标准标准DNA所需的酶量所需的酶量第十九页，讲稿共七十六页哦（8 8）影响核酸内切限制酶活性的因素）影响核酸内切限制酶活性的因素 DNA的纯度的纯度蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaC

15、l等等加大酶的用量，加大酶的用量，1 mg DNA 用用 10U 酶酶加大反应总体积加大反应总体积延长反应时间延长反应时间第二十页，讲稿共七十六页哦DNA样品的甲基化程度样品的甲基化程度大肠杆菌中的大肠杆菌中的dam甲基化酶在甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤序列中的腺嘌呤N6位引入甲位引入甲基，受其影响的酶有基，受其影响的酶有Bcl I、MboI等，但等，但BamH I、Bgl II、Sau3A I不不受影响受影响 大肠杆菌中的大肠杆菌中的dcm甲基化酶在甲基化酶在5CCAGG3或或5CCTGG3序列中的胞嘧序列中的胞嘧啶啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有位上引入甲基，受其影响的酶有Eco

16、R II等哺乳动物中的甲基化酶等哺乳动物中的甲基化酶在在5CG3序列中的序列中的C5位上引入甲基位上引入甲基第二十一页，讲稿共七十六页哦酶切消化反应温度酶切消化反应温度不同酶之间所需最适反应温度不同，且彼此间有不同酶之间所需最适反应温度不同，且彼此间有相当大的变动范围。相当大的变动范围。大多数酶标准反应温度都是大多数酶标准反应温度都是37。例外：例外：Sma 25Apa 30Mae 45Taq 65第二十二页，讲稿共七十六页哦DNA的分子结构的分子结构DNA分子的不同构型对核酸内切限制酶的活性也有很大分子的不同构型对核酸内切限制酶的活性也有很大的影响。的影响。某些核酸内切限制酶切割超盘旋的质粒

17、某些核酸内切限制酶切割超盘旋的质粒DNA或病毒或病毒DNA所所需要的酶量，要比消化线性需要的酶量，要比消化线性DNA的高出许多倍，的高出许多倍，最高的可达最高的可达20倍倍。此外，还有一些核酸内切限制酶，切割它们自己的处于不此外，还有一些核酸内切限制酶，切割它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率亦有明显的差别。同部位的限制位点，其效率亦有明显的差别。第二十三页，讲稿共七十六页哦核酸内切限制酶的缓冲液核酸内切限制酶的缓冲液核酸内切酶的标准缓冲液的组份包括：氯化镁、氯化纳或氯核酸内切酶的标准缓冲液的组份包括：氯化镁、氯化纳或氯化钾、化钾、Tris-HCl，-巯基乙醇或二硫苏糖醇巯基乙醇或二硫苏糖

18、醇(DTT)以及牛血清白以及牛血清白蛋白（蛋白（BSA）等。）等。酶活性的正常发挥，是绝对地需要二价的阳离子，通常是酶活性的正常发挥，是绝对地需要二价的阳离子，通常是Mg2+。不正确的。不正确的NaCl或或Mg2+浓度，不仅会降低限制酶的活性浓度，不仅会降低限制酶的活性，而且还可能导致识别序列特异性的改变。，而且还可能导致识别序列特异性的改变。酶切时间酶切时间 通常酶切时间通常酶切时间12小时，但大多数酶的活性可维持很长时间，小时，但大多数酶的活性可维持很长时间，我们可以酶切过夜。我们可以酶切过夜。第二十四页，讲稿共七十六页哦 高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端高浓度的酶、高浓度的甘油

19、、低离子强度、极端pH值等，会使一值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的星号活性星号活性（Star activity）现象，即限制酶在非标准反应条件下，能切割一些现象，即限制酶在非标准反应条件下，能切割一些与之特异型识别顺序类似的序列，降低酶切的特异性，这种现象称与之特异型识别顺序类似的序列，降低酶切的特异性，这种现象称为为星号活性星号活性。非适宜环境非适宜环境EcoR I在正常条件下识别并切割在正常条件下识别并切割5GAATTC3序列，但在甘油浓度超序列，但在甘油浓度超过过5%（v/v）时，也可切割）时，也可切割5Pu

20、PuATPyPy3或者或者5AATT3第二十五页，讲稿共七十六页哦抑制星号活性的方法抑制星号活性的方法 1)尽量用较少的酶进行完全消化反应。这样可以避免尽量用较少的酶进行完全消化反应。这样可以避免 过度消化以及过高的甘油浓度。过度消化以及过高的甘油浓度。2)尽量避免有机溶剂（如制备尽量避免有机溶剂（如制备DNA时引入的乙醇）的污染。时引入的乙醇）的污染。3)将离子浓度提高到将离子浓度提高到100-150 mM（若酶活性不受离子（若酶活性不受离子 强度影响）。强度影响）。4)将反应缓冲液的将反应缓冲液的pH值降到值降到7.0。5)二价离子用二价离子用Mg2+。第二十六页，讲稿共七十六页哦不同的酶

21、生产厂家适合各种不同反应的缓冲液不同的酶生产厂家适合各种不同反应的缓冲液TakaraNEBLTI (Gibcol-BRL)PromegaRocheMBI第二十七页，讲稿共七十六页哦3、DNA连接酶（连接酶（ligase）（1）DNA连接酶的概念连接酶的概念 是指利用是指利用ATP分子中的分子中的-磷酸基团为能量，通过催化磷酸基团为能量，通过催化两条并排两条并排DNA链的链的5-磷酸基团和磷酸基团和3-羟基之间，形成一个羟基之间，形成一个磷酸二酯键，而使两个磷酸二酯键，而使两个DNA片段共价连接起来的特异的片段共价连接起来的特异的核酸酶。核酸酶。ATP依赖的依赖的DNA连接酶连接酶NAD依赖的依

22、赖的DNA连接酶连接酶大多数原核生物大多数原核生物DNA连接酶连接酶真核生物和病毒真核生物和病毒DNA连接酶，连接酶，如如T4DNA连接酶连接酶、真核生物、真核生物DNA连接酶连接酶、类类 型型第二十八页，讲稿共七十六页哦（2）DNA连接酶的特性连接酶的特性lDNA连接酶不能连接两条单链连接酶不能连接两条单链DNA分子或环化的单链分子或环化的单链DNA分子分子，被连接的必须是双螺旋，被连接的必须是双螺旋DNA的一的一部分。部分。第二十九页，讲稿共七十六页哦lDNA连接酶只能连接连接酶只能连接DNA双螺旋骨架上的双螺旋骨架上的切口切口，而不能连接，而不能连接缺口缺口。第三十页，讲稿共七十六页哦T

23、4 DNA连接酶连接酶用途：用途：1）互补粘性末端的连接）互补粘性末端的连接;2）平头末端的相连；）平头末端的相连；3）一条带有切口的双链）一条带有切口的双链DNA分子；分子；4）DNA杂合体中链上的切口。杂合体中链上的切口。E.coli DNA连接酶连接酶用途：用途：1)互补粘性末端的连接互补粘性末端的连接;2)一条带有切口的双链一条带有切口的双链DNA分子。分子。第三十一页，讲稿共七十六页哦（1）由）由ATP（或（或NAD+）提供）提供AMP，形成酶，形成酶-AMP复合物，同时释复合物，同时释放出放出PPi或或NMN；（3）连接机理）连接机理（2）激活的）激活的AMP结合结合在在DNA链链

24、5端的磷酸基端的磷酸基团上，产生含高能磷酸团上，产生含高能磷酸键的焦磷酸酯键；键的焦磷酸酯键；（3）与相邻）与相邻DNA链链3羟基相连，形成磷酸二羟基相连，形成磷酸二酯键，并释放出酯键，并释放出AMP。第三十二页，讲稿共七十六页哦（4）不同末端连接策略）不同末端连接策略单酶切产生的相同黏性末端单酶切产生的相同黏性末端第三十三页，讲稿共七十六页哦双酶切产生的黏性末端双酶切产生的黏性末端第三十四页，讲稿共七十六页哦双酶切产生不同的双酶切产生不同的5 突出突出末端末端第三十五页，讲稿共七十六页哦双酶切产生不同的双酶切产生不同的3 突出突出末端末端第三十六页，讲稿共七十六页哦双酶切产生的双酶切产生的5

25、 突出突出末端和末端和3 突出突出末端末端第三十七页，讲稿共七十六页哦平切产生的平末端平切产生的平末端第三十八页，讲稿共七十六页哦平末端平末端DNADNA片段的连接操作片段的连接操作从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平末端的连接则属于分子间的连接，因接属于分子内部的连接，而平末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多此后者反应速度要慢得多提高平末端连接效率的方法包括：提高平末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）倍大于粘性末端的连接）加

26、大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 加入加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用，促进大分子之间的有效作用加入单价阳离子（加入单价阳离子（NaCl），最终浓度），最终浓度150-200 mM第三十九页，讲稿共七十六页哦常用的平末端常用的平末端DNADNA片段连接法，主要有片段连接法，主要有同聚物加尾法同聚物加尾法、衔接物连接法衔接物连接法及及接头连接法接头连接法 同聚物加尾法同聚物加尾法 第四十页，讲稿共七十六页哦衔接物连接法衔接物连接法 衔接物（衔接物（linker），），是指用化是指用化学方法合成的一段由学方法合成的一段由1012个

27、个核苷酸组成、具有一个或核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片末端的双链寡核苷酸短片段。段。第四十一页，讲稿共七十六页哦DNA接头接头，是一类人工合成的一头具某种限制酶粘性末端另一头，是一类人工合成的一头具某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。第四十二页，讲稿共七十六页哦Tris-HCl50-100 mM pH 7.5MgCl210 mMATP0.5-1mMDTT5 mMVolume10-20lTep.and Time4-15,4-16 hr1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下

28、连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 反应反应 1 小时，完小时，完全连接全连接 1 g DNA（Hind III片段）所需的酶量片段）所需的酶量（5）DNA连接酶的反应条件连接酶的反应条件第四十三页，讲稿共七十六页哦增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。连接的现象。插入片段与载体的浓度比例插入片段与载体的浓度比例 反应温度反应温度插入片段浓度高，至少插入片段浓度高，至少21。一般一般1416（6）影响影响DNA连接反应的因素连接反应的因素 平末端平末端DNA分子的连接最适反应的酶量为分子的连接最适反应的酶量为12个单位，个单位，粘末端

29、的连接，酶量为粘末端的连接，酶量为0.1个单位较好。个单位较好。DNA连接酶用法与用量连接酶用法与用量第四十四页，讲稿共七十六页哦4、DNA聚合酶（聚合酶（ligase）（1）DNA聚合酶的概念和类型聚合酶的概念和类型DNA聚合酶：聚合酶：指在指在DNA(或或RNA)模板指导下，以模板指导下，以4种脱氧核种脱氧核糖核苷酸（糖核苷酸（dNTP）为底物，在引物）为底物，在引物3-OH末端聚合末端聚合DNA链的链的一类酶。一类酶。DNADNA聚合酶的类型聚合酶的类型 根据根据DNA聚合酶所使用的模板不同，将其分为两类：聚合酶所使用的模板不同，将其分为两类：（1）依赖于）依赖于DNA的的DNA聚合酶；

30、聚合酶；（2）依赖于）依赖于RNA的的DNA聚合酶。聚合酶。第四十五页，讲稿共七十六页哦l 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 l Klenow fragment(克列诺酶克列诺酶)l T7 DNA聚合酶聚合酶 l T4 DNA聚合酶聚合酶 l 修饰过的修饰过的T7 DNA聚合酶聚合酶 l 逆转录酶逆转录酶（2）常见）常见DNA聚合酶及共有特点聚合酶及共有特点第四十六页，讲稿共七十六页哦l以脱氧核苷酸三磷酸以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为前体催化合成为前体催化合成DNA;l需要模板和引物的存在需要模板和引物的存在;l不能起始合成新的不能起始合成新的DNA链链;l催化催化dNTP加到生长中的加到

31、生长中的DNA链的链的3-OH末端末端;l催化催化DNA合成的方向是合成的方向是53。共同特点共同特点主要区别主要区别持续合成能力和外切酶活性不同持续合成能力和外切酶活性不同。T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模而不从模板上掉下来。板上掉下来。其它几种其它几种DNA聚合酶只能连续添加聚合酶只能连续添加10多个多个dNTPs就会就会从模板上解离下来。从模板上解离下来。第四十七页，讲稿共七十六页哦DNA聚合酶聚合酶35外切外切酶活性酶活性53外外切酶活性切酶活性聚合聚合速率速率持续持续能力能力大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶低低有有中中低低Klenow

32、fragment低低无无中中低低T4DNA聚合酶聚合酶高高无无中中低低T7DNA聚合酶聚合酶高高无无快快高高化学修饰化学修饰T7DNA聚合酶聚合酶低低无无快快高高遗传修饰遗传修饰T7DNA聚合酶聚合酶无无无无快快高高逆转录酶逆转录酶无无无无低低中中Taq DNA聚合酶聚合酶无无有有快快高高常用常用DNA聚合酶的特性比较聚合酶的特性比较第四十八页，讲稿共七十六页哦（3）DNA聚合酶聚合酶I大肠杆菌的大肠杆菌的DNA聚合酶聚合酶I是一条约是一条约1000个个aa 的多肽链形成的单亚基蛋白的多肽链形成的单亚基蛋白，分子量，分子量109Da.三种活性：三种活性：聚合酶活性：聚合酶活性：将将4种脱氧核糖

33、核苷酸聚合为新的种脱氧核糖核苷酸聚合为新的DNA链。链。外切酶活性外切酶活性:外切酶活性外切酶活性:防止错配。防止错配。第四十九页，讲稿共七十六页哦 底物：底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）Mg2+带有带有3OH游离端的引物游离端的引物 DNA模板模板DNA聚合酶聚合酶I（Pol I）的聚合活性反应条件）的聚合活性反应条件-OH5 3 dNTPs第五十页，讲稿共七十六页哦标记标记 核酸探针（核酸探针（probe）能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分子。带有标记的寡聚核酸分子。用用DNA聚合酶聚合酶I 制备探

34、针制备探针已知序列的核酸片段已知序列的核酸片段显示位置显示位置与互补的待测序列杂交与互补的待测序列杂交第五十一页，讲稿共七十六页哦标记标记已知序列的核酸片段 探针的标记方式探针的标记方式标记标记已知序列的核酸片段5 3 带有放射性的已知序列的核酸片段带有放射性的已知序列的核酸片段第五十二页，讲稿共七十六页哦 DNA聚合酶聚合酶I 对探针序列的标记对探针序列的标记切口转移法切口转移法(nick translation)：放射性同位素标记：放射性同位素标记：DNA聚合酶聚合酶I 同时具备同时具备53外切酶外切酶活性和活性和53的聚合酶的聚合酶活性（以及活性（以及35外切酶活性）。外切酶活性）。第五

35、十三页，讲稿共七十六页哦53外切酶活性从外切酶活性从DNA切口的切口的下一段下一段DNA5端除去一个核苷酸后，聚端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的合酶活性就会在切口的上一段上一段DNA的的3一侧补上一个新的核苷酸。一侧补上一个新的核苷酸。切口切口切口切口5 5 3 3 5 3 5 3 第五十四页，讲稿共七十六页哦纯化的纯化的DNA片片段段DNase I 制造单链制造单链切口切口DNA Pol I 进行切口转进行切口转移移一种一种-32P-dNTP和和dNTPs 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 32P-dNTP32P-dNTP从头至尾都被标记从头至尾都被标

36、记第五十五页，讲稿共七十六页哦（4）用用枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶处理处理Pol I可以切掉可以切掉N端的端的部分。就成为部分。就成为Klenow fragment。323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 605个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol 第五十六页，讲稿共七十六页哦 DNA 3末端标记末端标记在在3隐蔽端隐蔽端加上放射性标记的加上放射性标记的dNTP。3端补平端补平5 5 klenow补平限制性内切酶切后形成的补平限制性内切酶切

37、后形成的3隐蔽端隐蔽端。klenow主要用途主要用途第五十七页，讲稿共七十六页哦3隐蔽末端的隐蔽末端的DNA片段片段Klenow fragment补平补平根据末端的顺序选择根据末端的顺序选择一种一种 -32P-dNTPs末端标记的末端标记的DNA 限制性内切酶切限制性内切酶切5-G3 3-CTTAA5 5-GAA3 3-CTTAA5 5-GAATT3 3-CTTAA5 5-G3 3-CCTAG5 5-GG3 3-CCTAG5 5-GGATC3 3-CCTAG5 EcoR IBamH I-32P-dATP-32P-dGTP25oC 1h第五十八页，讲稿共七十六页哦 cDNA第二链的合成第二链的合

38、成mRNAcDNA第一链第一链逆转录逆转录cDNA第二链第二链klenow5 3 3 5 5 3 引物引物第五十九页，讲稿共七十六页哦（5）逆转录酶逆转录酶依赖依赖RNA的的DNA聚合酶（聚合酶（RNA指导的指导的DNA聚合酶）。聚合酶）。a、鸟类骨髓母细胞瘤病毒、鸟类骨髓母细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶逆转录酶b、莫洛尼氏鼠白血病病毒、莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶逆转录酶主要种类主要种类聚合酶活性聚合酶活性外切酶活性外切酶活性外切酶活性外切酶活性RNase H活性活性末端转移酶活性末端转移酶活性酶活性酶活性第六十页，讲稿共七十六页哦逆转录酶的用途逆转录酶的用途 合成合成cDNA以

39、以oligo dT为引物（与为引物（与mRNA的的polyA尾巴互补结合）。尾巴互补结合）。3AAAAAAAAAAAAAA5mRNA5TTTTTTTTTTTT oligo(dT)12-18反转录酶反转录酶Mg2+dNTP3AAAAAAAAAAAAAA5mRNA5TTTTTTTTTTTTTTTT3cDNA第六十一页，讲稿共七十六页哦 合成合成cDNA双向外切双向外切DNA-RNA杂合链中的杂合链中的RNA链链35mRNA RT-PCR用的模板用的模板克隆某个基因时，用其克隆某个基因时，用其mRNA反转录出反转录出cDNA第一链第一链。53cDNA35mRNA53cDNA反转录酶反转录酶53cDN

40、Aklenow35mRNA第六十二页，讲稿共七十六页哦（6）Taq DNA聚合酶聚合酶 1988年年Saiki 等从水生嗜热杆菌中提取到一种耐热等从水生嗜热杆菌中提取到一种耐热Taq DNA聚合聚合酶酶 Taq DNA聚合酶的应用使得聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，能高效率的进行，PE-Cetus公公司推出了第一台司推出了第一台PCR自动化热循环仪。自动化热循环仪。该酶基因全长该酶基因全长2.49kb，编码，编码832个氨基酸。该酶虽然在个氨基酸。该酶虽然在90以以上几乎无上几乎无DNA合成，合成，但但确有良好的热稳定性确有良好的热稳定性。（天然酶）。（天然酶）Taq DNA聚合酶的聚合

41、酶的热稳定性热稳定性是该酶用于是该酶用于PCR反应的前提条件反应的前提条件，也是，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因。反应能迅速发展和广泛应用的原因。第六十三页，讲稿共七十六页哦酶活性与热稳定性酶活性与热稳定性酶蛋白分子量酶蛋白分子量 94KDa，比活性，比活性200 000/mg，Taq酶的浓度通常为酶的浓度通常为12.5/l，太多太多浪费并易导致浪费并易导致非特异性扩增。非特异性扩增。热稳定性好：能耐受热稳定性好：能耐受DNA变性时的高温变性时的高温 在在92.5、95、97.5时，时，PCR混合物中的混合物中的Taq DNA聚合酶分别聚合酶分别经经130min、40min、5min

42、后，仍可保持后，仍可保持50%的活性。的活性。PCR反应时变性温度为反应时变性温度为9520sec，50个循环后，个循环后，Taq DNA聚合聚合酶仍有酶仍有65%的活性。的活性。第六十四页，讲稿共七十六页哦Taq DNA聚合酶是聚合酶是Mg2+依赖性酶，对依赖性酶，对Mg2+浓度非常敏感。浓度非常敏感。Mg2+浓度浓度2.0mmol/L时，能最大限度地激活时，能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性聚合酶的活性。Mg2+能与能与dNTP结合而降低结合而降低PCR反应液中游离的反应液中游离的Mg2+浓度，优化浓度，优化浓度一般反应浓度一般反应 中中Mg2+浓度至少应比浓度至少应比dNTP总浓度

43、高总浓度高0.51.0 mmol/L。适当浓度的适当浓度的KCl能使能使Taq DNA聚合聚合 酶的催化活性提高酶的催化活性提高5060%。离子依赖性离子依赖性第六十五页，讲稿共七十六页哦TaqDNA聚合酶具有聚合酶具有53 聚合酶活性聚合酶活性和和53外切酶活性外切酶活性，而而无无3 5外切活外切活 性，在性，在PCR反应中如发生某些碱基的错配，该酶是反应中如发生某些碱基的错配，该酶是没有校正没有校正功能。功能。Taq DNA聚合酶的碱基错配机率为聚合酶的碱基错配机率为2.110-4。Taq DNA聚合酶还具有逆转录酶活性聚合酶还具有逆转录酶活性.忠实性忠实性TaqTaq酶的最适温度酶的最适

44、温度最适温度：最适温度：72-78 oC 延伸速度：延伸速度：约约1000nt/min酶分子酶分子 最长延伸长度：最长延伸长度：6.7kb第六十六页，讲稿共七十六页哦5、DNA修饰酶修饰酶体内有些酶可在其他酶的作用下，将酶的结构进行共价修饰，使该酶活性发体内有些酶可在其他酶的作用下，将酶的结构进行共价修饰，使该酶活性发生改变，这种调节称为共价修饰调节生改变，这种调节称为共价修饰调节(covalent modification regulation)，这类酶称为修饰酶，这类酶称为修饰酶(prosessing enzyme)常见的修饰酶常见的修饰酶l碱性磷酸酶碱性磷酸酶l末端脱氧核苷酸转移酶（末端

45、脱氧核苷酸转移酶（TdT）lT4多核苷酸激酶多核苷酸激酶(T4-PNP)第六十七页，讲稿共七十六页哦（1）碱性磷酸酶种类碱性磷酸酶种类从大肠杆菌中分离出来。从大肠杆菌中分离出来。具有抗热性。具有抗热性。Bacterial alkaline phosphatase，BAPl细菌性碱性磷酸酶细菌性碱性磷酸酶l小牛肠碱性磷酸酶小牛肠碱性磷酸酶Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP从小牛肠中纯化出来。从小牛肠中纯化出来。SDSSDS中加热中加热6868可完全失活。可完全失活。第六十八页，讲稿共七十六页哦能够催化核酸分子脱掉能够催化核酸分子脱掉5磷酸基团，从而使

46、磷酸基团，从而使DNA（或（或RNA）片段的）片段的5-P末端转换成末端转换成5-OH末端，这就是所谓的末端，这就是所谓的核酸分子的脱磷酸作用核酸分子的脱磷酸作用 碱性磷酸酶的特性碱性磷酸酶的特性第六十九页，讲稿共七十六页哦 碱性磷酸酶的主要用途有：碱性磷酸酶的主要用途有：（1）5末端标记前的处理；末端标记前的处理；（2）去除）去除DNA片段的片段的5磷酸基团，防止自身连接磷酸基团，防止自身连接；第七十页，讲稿共七十六页哦Hind酶切酶切AAGCTT TTCGAA碱性磷酸酶碱性磷酸酶5 A-OH TTCGA-PP-AGCTT HO-A5 5 A-OH TTCGA-OHHO-AGCTT HO-A

47、第七十一页，讲稿共七十六页哦（2）末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶来源：来源：小牛胸腺小牛胸腺组成：组成：大小两个亚基。大小两个亚基。不需要模板！不需要模板！需要需要3OH、二甲胂酸缓冲液。、二甲胂酸缓冲液。底物可以是单链底物可以是单链DNA、是是3OH突出的双链突出的双链DNA 平末端平末端在在Co2+代替代替Mg2+下也下也 可以。可以。随机添加的随机添加的dNTPs。如果只有一种如果只有一种dNTP，就添加上，就添加上同聚物同聚物。特性：特性：53DNA聚合酶活性聚合酶活性DNA 5 3 TTTdTTP 末端转移酶末端转移酶第七十二页，讲稿共七十六页哦在冲液中，能够催化在冲液中，

48、能够催化5脱氧核苷三磷酸进行脱氧核苷三磷酸进行5 3方向的聚合作用方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的分子的3-OH末端末端 第七十三页，讲稿共七十六页哦末端转移酶的用途末端转移酶的用途（1）同聚物加尾）同聚物加尾给外源给外源DNA片段和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴片段和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。，以使它们有效地连接。外源外源DNA载体载体DNA5 3 5 3 CCCCCCGGGGGGdGTPdCTP末端转移酶末端转移酶第七十四页，讲稿共七十六页哦（2）再生酶切位点）再生酶切位点第七十五页，讲稿共七十六页哦感谢大家观看感谢大家观看第七十六页，讲稿共七十六页哦