基因克隆的酶学基础lyw讲稿.ppt

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1、基因克隆的酶学基础lyw第一页，讲稿共五十九页哦1.1.简述简述核酸酶核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核苷酸键发生水解断裂的蛋白酶。分为两类：从核酸分子末端开始，一个核苷酸一个核苷酸地消化降解多核苷酸链的叫核酸外切酶（核酸外切酶（exonuclease）;从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫做核酸内切酶（核酸内切酶（endonuclease）核糖核酸酶（核糖核酸酶（RNase）：）：水解断裂RNA分子脱氧核糖核酸酶：脱氧核糖核酸酶：特异水解断裂DNA分子核酸限制性内切酶核酸限制性内切酶和和DNA连接酶连接酶是重组是重组DNA技术赖以创立技术

2、赖以创立的酶学基础的酶学基础第二页，讲稿共五十九页哦限制性内切酶限制性内切酶主主要用于要用于DNADNA分子的特异切割分子的特异切割 DNADNA连接酶连接酶用于连接两条用于连接两条DNADNA分子或片段分子或片段反转录酶反转录酶以以RNARNA分子为模板合成互补的分子为模板合成互补的cDNAcDNA链链DNADNA甲基化酶甲基化酶用于用于DNADNA分子的甲基化分子的甲基化 多核苷酸激酶多核苷酸激酶将一个磷酸分子加到多核苷酸链的将一个磷酸分子加到多核苷酸链的5-OH5-OH末端末端碱性磷酸酶碱性磷酸酶催化从催化从DNADNA分子的分子的55或或33端移去末端磷酸基团端移去末端磷酸基团核酸酶核

3、酸酶用用于于DNADNA和和RNARNA的非特异性切割的非特异性切割 核酸聚合酶核酸聚合酶用于用于DNADNA和和RNARNA的合成的合成 核酸末端修饰酶核酸末端修饰酶用用于于DNADNA和和RNARNA的末端修饰的末端修饰 其它酶类其它酶类-用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。2.重组重组DNA实验中的工具酶及其运用实验中的工具酶及其运用第三页，讲稿共五十九页哦第一节第一节 核酸限制性内切酶与核酸限制性内切酶与DNA分分子的体外切割子的体外切割1.1 寄主控制的限制与修饰现象寄主控制的限制与修饰现象在在K株或株或B株上生长繁殖的噬菌体株上生

4、长繁殖的噬菌体（K）或）或（B），再次感染原寄主菌株的成斑率为，再次感染原寄主菌株的成斑率为1，而感染新的，而感染新的寄主菌株的成斑率则分别为寄主菌株的成斑率则分别为10-4和和4 10-4（K）在感染）在感染B菌株后长出的稀有噬菌斑中菌株后长出的稀有噬菌斑中的噬菌体再次感染的噬菌体再次感染B菌株则可以有效地生菌株则可以有效地生长长两种酶的配合：修饰的甲基转移酶与核酸限制两种酶的配合：修饰的甲基转移酶与核酸限制性内切酶性内切酶 （EcoB and EcoK）第四页，讲稿共五十九页哦1.2 限制性内切酶的发现限制性内切酶的发现 1.细菌限制修饰系统的发现细菌限制修饰系统的发现 Werner Ar

5、ber于于1962-1968年发现，年发现，1968年分离到年分离到I型限制酶。型限制酶。2.限制酶限制酶HindII的发现的发现 HOSmith 和和Wilox 于于1970年首次从流感嗜血杆菌（年首次从流感嗜血杆菌（H.influenzae）中发现并分离到中发现并分离到HindII限制酶。限制酶。3.SV40 限制图谱和转录图谱的绘制限制图谱和转录图谱的绘制 D.Nathans（1971年）用年）用HindII绘制绘制SV40的限制酶谱。的限制酶谱。第五页，讲稿共五十九页哦国王和仆人的故事国王和仆人的故事分子剪刀分子剪刀 每当我走进父亲的办公室，总会看见他桌上放着的一些培养皿，里面装的是菌

6、群。它们每当我走进父亲的办公室，总会看见他桌上放着的一些培养皿，里面装的是菌群。它们就象一个住着许多居民的城市，在每一种细菌中都有一个国王，他长得瘦瘦的、高高的。就象一个住着许多居民的城市，在每一种细菌中都有一个国王，他长得瘦瘦的、高高的。国王有很多仆人，这些仆人长得矮矮胖胖的，跟皮球差不多。父亲把国王叫做国王有很多仆人，这些仆人长得矮矮胖胖的，跟皮球差不多。父亲把国王叫做“DNA”，仆，仆人叫做人叫做“酶酶”。国王就像一本书，仆人们做的每一件事情在这本书中都有记载。对于我们人类来说，。国王就像一本书，仆人们做的每一件事情在这本书中都有记载。对于我们人类来说，国王记载的这些细目是个谜。国王记载

7、的这些细目是个谜。我爸爸已经发现了其中的一个仆人，他的工作就像一把剪刀，如果有外国国王来侵犯我爸爸已经发现了其中的一个仆人，他的工作就像一把剪刀，如果有外国国王来侵犯一个细菌，这个仆人就会把他剪成小碎片，但他不会对自己的国王造成任何伤害。一个细菌，这个仆人就会把他剪成小碎片，但他不会对自己的国王造成任何伤害。聪明的人类用这个带着剪刀的仆人来探究国王的秘密，他们搜集了很多带剪刀的聪明的人类用这个带着剪刀的仆人来探究国王的秘密，他们搜集了很多带剪刀的仆人，并把他们放进一个国王里，这个国王就被剪成了碎片。用这种方法得到的小碎仆人，并把他们放进一个国王里，这个国王就被剪成了碎片。用这种方法得到的小碎片

8、使人类探究国王的秘密变得容易了。爸爸就是因为发现了带着剪刀的仆人而获得了片使人类探究国王的秘密变得容易了。爸爸就是因为发现了带着剪刀的仆人而获得了诺贝尔奖。诺贝尔奖。瑞士微生物遗传学家瑞士微生物遗传学家W阿尔伯（阿尔伯（1929）的女儿西尔维娅）的女儿西尔维娅 第六页，讲稿共五十九页哦1.3 核酸内切酶的类型核酸内切酶的类型第七页，讲稿共五十九页哦1.4 I型和型和III型核酸限制性内切酶的基本特性型核酸限制性内切酶的基本特性I型和型和III型核酸限制性内切酶一般是大型的多亚基蛋白复合物，既具有内切酶的活性型核酸限制性内切酶一般是大型的多亚基蛋白复合物，既具有内切酶的活性又具有甲基化酶的活性。

9、又具有甲基化酶的活性。I型核酸限制性内切酶的特性型核酸限制性内切酶的特性 辅助因子辅助因子：Mg2+、ATP和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）三种不同的亚基：三种不同的亚基：特异性亚基：特异识别DNA序列 修饰亚基：具有甲基化酶的活性 限制亚基：具有核酸内切酶活性 切割方式：切割方式：结合在识别位点以滚环形式沿着结合在识别位点以滚环形式沿着DNA分子转位，而后从距识别分子转位，而后从距识别位点位点5一侧数千碱基处一侧数千碱基处随机随机切割切割DNA分子。分子。第八页，讲稿共五十九页哦III型核酸限制性内切酶的特性型核酸限制性内切酶的特性 辅助因子辅助因子：Mg2+、ATP和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）

10、两种不同的亚基：两种不同的亚基：M亚基：位点的识别与修饰 R亚基：核酸酶的活性 切割方式：切割方式：反应过程中会沿着反应过程中会沿着DNA分子移动，并从距识别位点一侧约分子移动，并从距识别位点一侧约25bp处单链切割处单链切割DNA分分子。子。其识别序列是其识别序列是特异而非对称特异而非对称的。的。第九页，讲稿共五十九页哦1.4 II型核酸限制性内切酶的基本特性型核酸限制性内切酶的基本特性II型只有一种多肽，通常以同源二聚体形式存在型只有一种多肽，通常以同源二聚体形式存在。1.在在DNA分子双链的特异性识别序列部位切割分子双链的特异性识别序列部位切割DNA分子产生链的断裂；分子产生链的断裂；2

11、.两个单链断裂部位在两个单链断裂部位在DNA分子上的分布通常不是彼此直接相对的；分子上的分布通常不是彼此直接相对的；3.断裂形成的断裂形成的DNA片段往往具有互补的单链延伸末端。片段往往具有互补的单链延伸末端。识别序列：双重旋转对称（回文结构）识别序列：双重旋转对称（回文结构）第十页，讲稿共五十九页哦 1.识别顺序和酶切位点识别顺序和酶切位点 ）识别、）识别、6、8个相连的核苷酸个相连的核苷酸 BamHI：HhaI：NotI：Fok I：5-()9-3 3-()13-5 外侧，产生外侧，产生-端突起端突起IIs型型第十一页，讲稿共五十九页哦 2）对称性对称性双双对称对称 EcoRI 5-G A

12、 A T T C-3 3-C T T A A G-5 3）切点大多数在识别顺序之内，也有例外）切点大多数在识别顺序之内，也有例外 4）限制酶切后产生两个末端，末端结构是）限制酶切后产生两个末端，末端结构是-和和-2.末端种类末端种类 ）-端突起端突起，个数为或个核苷酸，个数为或个核苷酸 Pst I 5-CTGCAG-3 5-CTGCAOH PG-3 3-GACGTC-5 3-GP HOACGTC-5 ）-端突起端突起，个数为或个核苷酸，个数为或个核苷酸 EcoRI 5-GAATTC-3 5-GOH PAATTC-3 3-CTTAAG-5 3-CTTAAP HOG-5第十二页，讲稿共五十九页哦

13、）平齐末端平齐末端 SmaI 5-CCCGGG-3 5-CCC GGG-3 3-GGGCCC-5 3-GGG CCC-5 ）非互补的粘性末端）非互补的粘性末端 i）切点在识别顺序之外的，如：）切点在识别顺序之外的，如：FokI Fok I 5-GGATG()9-3 5-GGATG(N)9 3-CCTAC()13-5 3-CCTAC(N)13 ii）能识别简并顺序的，如：）能识别简并顺序的，如：AvaI AvaI 5-CPyCGPuG-3 CCCGGG;C TCGGG;CCCGAG;CTCGAG 第十三页，讲稿共五十九页哦）相容性末端）相容性末端如：如：BamHI G GATCC BglII A

14、 GATCT MboI,Sau3AI N GATCN 上述几种限制酶产生的上述几种限制酶产生的DNA片段仍可相连，由此形成的重组分子能被片段仍可相连，由此形成的重组分子能被MboI和和Sau3AI识别和酶切。识别和酶切。BamHI+MboI A/C/G/T GATCT/C/G/A BamHI和和BglII(AGATCT)两种酶产生的相容性末端，相连后不能为两种两种酶产生的相容性末端，相连后不能为两种酶所识别和酶切。酶所识别和酶切。BamHI+BglII A/G GATCT/C。第十四页，讲稿共五十九页哦3 同裂酶（同裂酶（isoschizomers）定义定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多

15、种限制酶：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶 （产生同样的切割，形成同样的末端）（产生同样的切割，形成同样的末端）用以研究用以研究DNA甲基化作用甲基化作用：一对同裂酶：一对同裂酶：HpaII和和MspI，识别序列同为，识别序列同为CCGG，当靶序列中含一个，当靶序列中含一个5-甲基胞嘧啶（甲基胞嘧啶（CC GG）时，）时，HpaII不能切割它而不能切割它而MspI则同样能切开，因此可通过比较则同样能切开，因此可通过比较HpaII和和MspI的的DNA消化产物来检测消化产物来检测胞嘧啶的甲基化。胞嘧啶的甲基化。第十五页，讲稿共五十九页哦4.同尾酶（同尾酶（isocaudamer）定义定

16、义：来源不同：来源不同,识别不同序列但产生相同粘性末端的限制酶识别不同序列但产生相同粘性末端的限制酶 5.限制片段末端的连接作用限制片段末端的连接作用许多种限制酶切割许多种限制酶切割DNA分子形成的短片段能够自发地重新环化起来，用分子形成的短片段能够自发地重新环化起来，用DNA连接酶连接酶处理能使它们的处理能使它们的3-OH和和5-P基团封闭起来形成永久的环形基团封闭起来形成永久的环形DNA分子。分子。两种类型：两种类型：DNA分子间和分子内分子间和分子内第十六页，讲稿共五十九页哦 1.5 限制性内切酶的命名限制性内切酶的命名命名原则命名原则：（1）用属名的头一个字母和种名的头两个字母组成）用

17、属名的头一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表个字母的略语表示寄主菌的物种名称；（示寄主菌的物种名称；（2）用一个写在右下方的标注字母代表菌株或型；（）用一个写在右下方的标注字母代表菌株或型；（3）几个不同的限制与修饰体系以罗马数字表示。几个不同的限制与修饰体系以罗马数字表示。例如：例如：Hind前三个字母来自于菌种名称前三个字母来自于菌种名称H.influenzae，“”表示菌系为型血清型；表示菌系为型血清型；“”表示分离到的第三个限制酶表示分离到的第三个限制酶。EcoRIEscherichia coli RI HindHaemophilus influensae d SacI(II

18、)Streptomyces achromagenes I()第十七页，讲稿共五十九页哦1.6 影响限制性内切酶活性的因素影响限制性内切酶活性的因素1.DNA的纯度的纯度DNA中的污染组分如蛋白质、酚、氯仿、酒精、中的污染组分如蛋白质、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS以及高浓度的盐以及高浓度的盐离子都有可能抑制核酸限制性内切酶的活性。离子都有可能抑制核酸限制性内切酶的活性。克服手段：克服手段：u 增加酶的用量增加酶的用量u 扩大酶催化反应的体积，使得潜在抑制因素被稀释扩大酶催化反应的体积，使得潜在抑制因素被稀释u 延长酶催化反应的时间延长酶催化反应的时间对于对于DNase的污染，可加入二价金属离

19、子螯合剂的污染，可加入二价金属离子螯合剂EDTA结合结合Mg2+。加入适量聚阳离子亚精胺有利于限制性内切酶对基因组加入适量聚阳离子亚精胺有利于限制性内切酶对基因组DNA的消化作用。的消化作用。第十八页，讲稿共五十九页哦2.DNA的甲基化程度的甲基化程度u 采用失去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒采用失去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒u 使用对甲基化不敏感的酶使用对甲基化不敏感的酶3.酶切温度酶切温度大部分酶的最适反应温度为大部分酶的最适反应温度为37，但也有一些低于或高于此，但也有一些低于或高于此温度，严格参照说明。温度，严格参照说明。4.DNA的分子结构的分子结构DNA分子的螺旋结构、切割靶序

20、列所处的位置对酶切速率有影响，一些酶对不分子的螺旋结构、切割靶序列所处的位置对酶切速率有影响，一些酶对不同部位的限制位点的切割活性也有差异同部位的限制位点的切割活性也有差异。第十九页，讲稿共五十九页哦5.酶反应的缓冲液酶反应的缓冲液缓冲液成分包括：缓冲液成分包括：MgCl2、NaCl或或KCl、Tris-HCl、-巯基乙醇或二硫苏糖醇巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTTDTT）以及牛血清白蛋白（）以及牛血清白蛋白（BSABSA）等。）等。各种酶对以上成分的浓度要求都有所差异，若某些酶的敏感因子浓度各种酶对以上成分的浓度要求都有所差异，若某些酶的敏感因子浓度改变较大可能造成酶的非特异切割。改变较大可能造

21、成酶的非特异切割。酶的星号活性酶的星号活性：在非最适条件下，限制性内切酶会在与其识别序列类似但并不相在非最适条件下，限制性内切酶会在与其识别序列类似但并不相同的同的DNA序列上切割。序列上切割。第二十页，讲稿共五十九页哦表表1 1 具有星反应的限制性内切酶与条件具有星反应的限制性内切酶与条件限制酶诱发星活性的条件限制酶诱发星活性的条件a a识别序列识别序列AvaAvaI 1,2,4I 1,2,4BamBamHI HI 1-5,8 G GATCN,G PuATCC 1-5,8 G GATCN,G PuATCCBstBstI 2,4I 2,4BsuBsuI 2,4,6I 2,4,6EcoEcoRI

22、RI 1,2,4-6 N AATTN 1,2,4-6 N AATTNHaeHae 2,4 2,4HhaHhaI 2,4,7I 2,4,7HinHindd 6 6HpaHpaI 1,2,4I 1,2,4PstPstI 1,2,4,7I 1,2,4,7PvuPvu 2,4 2,4SalSalI 1,2,4,7I 1,2,4,7ScaScaI 4-6,8 I 4-6,8 SstSst 2,4 2,4XbaXbaI 2,4,7I 2,4,7a.1a.1：亚乙二醇：亚乙二醇(45%)(45%)；2:2:甘油甘油(12%)(12%)；3 3：乙醇：乙醇(12%)(12%)；4 4：高酶：高酶/DNA/DN

23、A比比(25U/g)(25U/g)；5：Mn+代替代替Mg+；6:pH8.5;7:二甲基亚砜二甲基亚砜(8%);8:无无NaCl。第二十一页，讲稿共五十九页哦1.7 限制性内切酶在实验中的使用限制性内切酶在实验中的使用当建立内切酶酶切反应体系时有几个关键因素需要考虑。比如如何在正确的反应体系中，当建立内切酶酶切反应体系时有几个关键因素需要考虑。比如如何在正确的反应体系中，加入适量的加入适量的DNA、内切酶和缓冲液，就可以获得最佳酶切效果、内切酶和缓冲液，就可以获得最佳酶切效果。在在 50 l体系中，最适反应条件下，体系中，最适反应条件下，1 单位（单位（U）的限制性内切酶可以在的限制性内切酶可

24、以在60 分钟分钟内完全切割内完全切割 1 g 的底物的底物 DNA。大多数科研人员会遵循右表中所列的标大多数科研人员会遵循右表中所列的标准反应条件，使用准反应条件，使用 510 倍的过量酶切倍的过量酶切割割DNA，这样有利于克服由于，这样有利于克服由于 DNA 来源不同、质量和纯度不同而造成来源不同、质量和纯度不同而造成的实验失败的实验失败“标准标准”反应体系反应体系 第二十二页，讲稿共五十九页哦 酶从冰箱取出后请一直置于冰上。酶从冰箱取出后请一直置于冰上。酶最后加入到反应体系中。酶最后加入到反应体系中。加入酶之前将反应混合物混匀，可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁，然后在离心机中加入酶之前将反

25、应混合物混匀，可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁，然后在离心机中快速离心。快速离心。当切割超螺旋质粒和琼脂糖包埋当切割超螺旋质粒和琼脂糖包埋 DNA 时，通常需要超过时，通常需要超过 1 unit/g 的酶量以达到完全酶切的酶量以达到完全酶切。实验操作注意事项实验操作注意事项 建议在建议在 50 l 反应体系中消化反应体系中消化 1 g 底物底物 DNA。为避免星号活性，甘油浓度应为避免星号活性，甘油浓度应 5%。加入内切酶（贮存于加入内切酶（贮存于 50%甘油中）的量应不超过总体积的甘油中）的量应不超过总体积的 10%。大多数内切酶建议保存在大多数内切酶建议保存在-2 0。只有少数内切酶若贮存时

26、间超过。只有少数内切酶若贮存时间超过 30 天建议保天建议保存在存在-70。第二十三页，讲稿共五十九页哦双酶切双酶切同步双酶切同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液并避免星号活性是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液并避免星号活性是非常重要的一步。是非常重要的一步。分步酶切分步酶切应从推荐缓冲液盐浓度低的酶开始，温育至酶切完毕。调整缓冲液中盐浓度（用小应从推荐缓冲液盐浓度低的酶开始，温育至酶切完毕。调整缓冲液中盐浓度（用小体积浓缩盐溶液）直至满足第二种酶的要求。加入第二种酶完成双酶切反应。也可在第二步酶体积浓缩盐溶液）直至满足第二种酶的要求

27、。加入第二种酶完成双酶切反应。也可在第二步酶切反应前过柱纯化切反应前过柱纯化 DNA。第二十四页，讲稿共五十九页哦第二节第二节 DNA连接酶连接酶体外连接体外连接DNA片段的方法片段的方法：用用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片段片段用用T4 DNA连接酶直接将平末端连接酶直接将平末端DNA片段连接起来，或用末端片段连接起来，或用末端脱氧核苷酸转移酶给平末端脱氧核苷酸转移酶给平末端DNA加上加上poly(dA)-poly(dT)尾巴尾巴后再用后再用DNA连接酶连接连接酶连接1.先在先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性片段末端加上化学合成

28、的衔接物或接头，使之形成粘性末端后，在用末端后，在用DNA连接酶连接连接酶连接第二十五页，讲稿共五十九页哦1.DNA连接酶连接酶催化在两条催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键链之间形成磷酸二酯键需要：需要：3-OH、5-P以及以及NAD+或或ATP做能源做能源不能连接两条单链不能连接两条单链DNA分子或环化的单链分子或环化的单链DNA分子，被连接的分子，被连接的DNA必须是双螺旋必须是双螺旋DNA分子的一部分分子的一部分nickgap第二十六页，讲稿共五十九页哦DNA连接的分子机理连接的分子机理第二十七页，讲稿共五十九页哦连接反应的影响因素连接反应的影响因素 1.连接缓冲液的影响：合适酸碱度，

29、连接缓冲液的影响：合适酸碱度，pH的范围在的范围在7.4-7.8，较多用，较多用7.8；10mmol/L的的MgCl2，作用是激活酶反应；，作用是激活酶反应；1-20mmol/L的的DTT，较多用，较多用10mmol/L，作用是维，作用是维持还原性环境，稳定酶活性，持还原性环境，稳定酶活性，25-50ug/ml的的BSA，作用是增加蛋白质的浓度，作用是增加蛋白质的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。2.ATP浓度的影响：连接缓冲液中浓度的影响：连接缓冲液中ATP的浓度在的浓度在0.5-4mmol/L之间，过浓会抑制反应。之间，过浓会抑制反应。由于由于ATP

30、极易分解，含有极易分解，含有ATP的缓冲液应于的缓冲液应于-20保存，溶化取用后立即放回。最好小管分保存，溶化取用后立即放回。最好小管分装贮存，防止反复冻融引起装贮存，防止反复冻融引起ATP分解。与限制酶缓冲液不同的是，含分解。与限制酶缓冲液不同的是，含ATP的连接缓冲液长期的连接缓冲液长期放置后往往失效，所以也可自行配制不含放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的缓冲液（可长期保存），临用时加入新的缓冲液（可长期保存），临用时加入新配制的配制的ATP母液。母液。第二十八页，讲稿共五十九页哦4、连接温度与时间的影响：因为黏性末端的、连接温度与时间的影响：因为黏性末端的DNA双链间有氢键的作

31、用，所以温度过高双链间有氢键的作用，所以温度过高会使氢键不稳定，但连接酶的最适温度又恰为会使氢键不稳定，但连接酶的最适温度又恰为37。为了解决这一矛盾，在经过综合。为了解决这一矛盾，在经过综合考虑后，传统上将连接温度定为考虑后，传统上将连接温度定为16，时间为，时间为4-16h。对于平末端是不用考虑氢键问。对于平末端是不用考虑氢键问题的，可使用较高的温度，使酶活力得到更好的发挥。题的，可使用较高的温度，使酶活力得到更好的发挥。5、载体与插入片段的量、载体与插入片段的量适当的载体与片段的摩尔比能提高连接效率，并减少多拷贝插入片段的的形成，一般：适当的载体与片段的摩尔比能提高连接效率，并减少多拷贝

32、插入片段的的形成，一般：载体载体插入片段插入片段=13-10第二十九页，讲稿共五十九页哦2.粘性末端粘性末端DNA的连接的连接DNA片段与载体用同一种内切酶酶切后，利用片段与载体用同一种内切酶酶切后，利用DNA连接酶将酶切形连接酶将酶切形成的粘性末端连接起来成的粘性末端连接起来单酶切时如何阻止载体的自我环化？单酶切时如何阻止载体的自我环化？实验中普遍采用片段和载体用不同的酶双酶切形成不实验中普遍采用片段和载体用不同的酶双酶切形成不同的粘性末端，这种操作具有方向性同的粘性末端，这种操作具有方向性第三十页，讲稿共五十九页哦第三十一页，讲稿共五十九页哦3.平末端平末端DNA的连接的连接直接用直接用T

33、4 DNA连接酶（需要连接酶（需要ATP及高浓度酶）及高浓度酶）（1）同聚物加尾法）同聚物加尾法第三十二页，讲稿共五十九页哦（2）衔接物连接法）衔接物连接法第三十三页，讲稿共五十九页哦双衔接物连接法双衔接物连接法第三十四页，讲稿共五十九页哦（3）DNA接头连接法接头连接法第三十五页，讲稿共五十九页哦练习题练习题第三十六页，讲稿共五十九页哦第三十七页，讲稿共五十九页哦TMTC：too many to count第三十八页，讲稿共五十九页哦答案：答案：第三十九页，讲稿共五十九页哦第三节第三节 DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶能够把脱氧核糖核苷酸连续地加到双链聚合酶能够把脱氧核糖核苷酸连续地加到双链D

34、NA分子引物链的分子引物链的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不发生从引物模板上解离的情况。末端，催化核苷酸的聚合作用，而不发生从引物模板上解离的情况。第四十页，讲稿共五十九页哦1.DNA聚合酶聚合酶I在在50年代的中期，年代的中期，A.Kornberg发现了发现了DNA聚合酶聚合酶（DNA polymerase，DNA pol）原来）原来称为称为Kornberg酶。以后又相续发现了酶。以后又相续发现了DNA pol 和和DNA pol。DNA聚合酶的共同特点是：聚合酶的共同特点是：（1）需要提供合成模板；）需要提供合成模板；（2）不能起始新的）不能起始新的DNA链，必须要有引物提供链，必

35、须要有引物提供3 OH；（3）合成的方向都是）合成的方向都是53；（4）除聚合）除聚合DNA外还有其它功能。外还有其它功能。冈崎片段第四十一页，讲稿共五十九页哦1.DNA聚合酶聚合酶I（polI）三种酶催活性：三种酶催活性：5-3 聚合酶活性聚合酶活性5-3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性3-5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性polI催化合成催化合成DNA的三种条件：的三种条件：（1 1）存在四种）存在四种dNTPsdNTPs和和MgMg2+2+（2 2）带有）带有3-OH3-OH游离基团的引物链游离基团的引物链（3 3）DNADNA模板（双链或单链）模板（双链或单链）链合成方向：链合成方向：5

36、3第四十二页，讲稿共五十九页哦polI的的5 3聚合作用聚合作用第四十三页，讲稿共五十九页哦polI的的5 3核酸外切酶活性（切除修复）核酸外切酶活性（切除修复）必须是位于双螺旋的区段上；切割部位既可以是末端也可以是距末端数个核苷酸远的必须是位于双螺旋的区段上；切割部位既可以是末端也可以是距末端数个核苷酸远的磷酸二酯键；伴随发生的磷酸二酯键；伴随发生的DNA合成可以增强合成可以增强5-3外切酶的活性；对双链外切酶的活性；对双链DNA的单链的单链缺口有活性但要存在缺口有活性但要存在5-P基团。基团。用枯草杆菌蛋白酶切割成两个片段，一个片段用枯草杆菌蛋白酶切割成两个片段，一个片段36kDa具有具有

37、5-3外外切酶的活性切酶的活性;另一片段另一片段76kDa具有聚合酶活性及具有聚合酶活性及3-5外切酶活性，外切酶活性，此即为此即为Klenow片段。片段。第四十四页，讲稿共五十九页哦polI的的3 5 核酸外切酶活性（校正）核酸外切酶活性（校正）从从DNA链链3-OH末端开始水解末端开始水解DNA并释放单核苷酸分子，底物可以是双链的并释放单核苷酸分子，底物可以是双链的DNA也可以也可以是单链的是单链的DNA。当反应物中缺乏。当反应物中缺乏dNTPs时，时，3-5外切酶活性将从外切酶活性将从3-OH开始降解开始降解DNA。但在具有。但在具有dNTPs的条件下，这种降解活性会被的条件下，这种降解

38、活性会被5-3的聚合酶活性所抑制。的聚合酶活性所抑制。第四十五页，讲稿共五十九页哦DNA缺口转移，制备放射性标记的缺口转移，制备放射性标记的DNA探针探针PolI、DNaseI、32P-dNTPs、未标记的、未标记的dNTPs第四十六页，讲稿共五十九页哦2.DNA聚合酶聚合酶I的的Klenow片段片段具有具有5-3聚合酶活性、聚合酶活性、3-5外切酶活性外切酶活性用途：用途：（1）修补经限制酶消化的）修补经限制酶消化的DNA所形成的所形成的3隐蔽末端；隐蔽末端；（2）标记）标记DNA片段的末端；片段的末端；（3）cDNA克隆中的第二链克隆中的第二链cDNA的合成；的合成；（4）DNA序列测定序

39、列测定第四十七页，讲稿共五十九页哦3.T4 DNA聚合酶聚合酶两种酶催活性：两种酶催活性：5-3聚合酶及聚合酶及3-5外切酶外切酶用来标记用来标记DNA平末端或隐蔽的平末端或隐蔽的3-末端末端第四十八页，讲稿共五十九页哦4.Taq DNA聚合酶聚合酶Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌（聚合酶是从一种水生栖热菌（Thermus aquaticus）yT1株分离提取的。株分离提取的。yT是一种嗜热真菌，能在是一种嗜热真菌，能在7075生长。生长。Taq酶的特点：酶的特点：耐高温，在耐高温，在70下反应下反应2h后其残留活性大于原来的后其残留活性大于原来的90%，在，在93下反应下反应2h后其残

40、后其残留活性是原来的留活性是原来的60%，在，在95下反应下反应2h后其残留活性是原来的后其残留活性是原来的40%。在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。70延伸率大于延伸率大于60个核苷酸个核苷酸/秒秒 第四十九页，讲稿共五十九页哦Taq DNA聚合酶具有聚合酶具有53聚合酶活性和聚合酶活性和53外切酶活

41、性，而无外切酶活性，而无35外切活性，因而，在外切活性，因而，在pCR反应中如发生某些碱基的错配，该反应中如发生某些碱基的错配，该酶没有校正功能的，酶没有校正功能的，30次循环次循环Taq酶的错配率约为酶的错配率约为0.25 应用低浓度的应用低浓度的dNTP(各各20molL)、1.5mmol/L的的Mg2+浓度、高于浓度、高于55的复性温度，可提高的复性温度，可提高Taq酶的忠实性，此时的平均错配率仅为酶的忠实性，此时的平均错配率仅为5x10-6次次/（核苷酸（核苷酸*循环）。循环）。Taq 酶的性质酶的性质第五十页，讲稿共五十九页哦Taq 酶的性质酶的性质Taq酶具有类似于酶具有类似于末端

42、转移酶末端转移酶的的TdT的活性，可在新生成的双链产物的的活性，可在新生成的双链产物的3端加上端加上个碱基，尤其是个碱基，尤其是dATP最容易加上。最容易加上。用于用于TA克隆克隆Taq酶还具有酶还具有反转录活性反转录活性。在。在2-3mmol/L Mg2+浓度下浓度下68时出现类似时出现类似反转录酶的活性。若有反转录酶的活性。若有Mg2+存在，则反转录活性更佳，利用这一活性，存在，则反转录活性更佳，利用这一活性，可直接用于可直接用于RNA-PCR，尤其是短片段的扩增。，尤其是短片段的扩增。第五十一页，讲稿共五十九页哦Taq 酶的选择酶的选择高特异性高特异性Taq酶酶 最典型的代表是热启动最典

43、型的代表是热启动Taq酶酶 如何减少引物和模板的非特异性配对？如何减少引物和模板的非特异性配对？第一代热启动第一代热启动Taq酶往往直接在酶往往直接在Taq酶上做一些修饰，比如用抗体抑制，蜡封等，酶上做一些修饰，比如用抗体抑制，蜡封等，如如Clontech、Stratagen、Gibcol-LTI的一些产品。的一些产品。新一代的热启动新一代的热启动Taq酶是通过内部改造的重组酶，真正实现便利的热启动，代表产品如酶是通过内部改造的重组酶，真正实现便利的热启动，代表产品如QIAGEN公司的公司的HotStar系列系列 热启动的热启动的Taq酶也是实现一步法酶也是实现一步法RT-PCR的基础的基础

44、第五十二页，讲稿共五十九页哦高保真高保真Taq酶酶 经基因工程改造，具有经基因工程改造，具有3-5 外切酶活性（校验功能）外切酶活性（校验功能）扩增效率降低，不宜用于扩增效率降低，不宜用于TA克隆克隆如如Stratagene的的Pfu，NEB公司的公司的Vent DNA聚合酶，聚合酶，QIAGEN公司新推出公司新推出的的ProofStart DNA聚合酶，兼特异性与保真性于一体聚合酶，兼特异性与保真性于一体。高耐热性高耐热性Taq酶酶 NEB公司的公司的Vent和和Deep Vent DNA聚合酶系列，两者都是从海底火山口分离出来后克隆的聚合酶系列，两者都是从海底火山口分离出来后克隆的，是普通

45、，是普通Taq 酶耐热性的三倍以上，前者在酶耐热性的三倍以上，前者在95C半衰期近半衰期近7小时，小时，100C近近2小时；后者更小时；后者更甚，分别为甚，分别为23小时和小时和8小时。小时。第五十三页，讲稿共五十九页哦超长片段扩增超长片段扩增Taq酶酶 对于作基因组图谱、测序及分子遗传学研究的用户，可能会用到对于作基因组图谱、测序及分子遗传学研究的用户，可能会用到超长片段的扩增，超长片段的扩增，Clontech公司的公司的Advantage Genomic系列混有系列混有Tth DNA聚合酶，聚合酶，Proofreading酶和热启动抗体，对复杂模板可扩酶和热启动抗体，对复杂模板可扩增增10

46、kb片段，简单模板可达片段，简单模板可达40kb。第五十四页，讲稿共五十九页哦5.逆转录酶逆转录酶（1）AMV（鸟类骨髓母细胞瘤病毒）反转录酶（鸟类骨髓母细胞瘤病毒）反转录酶 肽链：具有反转录酶与肽链：具有反转录酶与RNaseH活性活性（RNaseH：核糖核酸外切酶，以：核糖核酸外切酶，以5-3 或或3-5 方向特异地降解方向特异地降解RNA-DNA杂交分子杂交分子中的中的RNA链）链）肽链：肽链：5-3脱氧核酸外切酶脱氧核酸外切酶 （以（以RNA-DNA杂交分子为底物）杂交分子为底物）依赖于依赖于RNA的的DNA聚合酶聚合酶第五十五页，讲稿共五十九页哦（2）M-MLV（莫洛尼鼠白血病病毒莫洛

47、尼鼠白血病病毒）反转录酶）反转录酶 1)特点：特点：不具内切酶活性不具内切酶活性;RNase H活性低活性低;稳定性差稳定性差 2)与与AMV反转录酶比较反转录酶比较 a合成短链合成短链cDNA(0.6 kb)时，两者相同，但时，两者相同，但M-MLV反转录酶需要量大反转录酶需要量大，可能与其稳定性差有关，可能与其稳定性差有关 b合成长链合成长链cDNA(4.5-7.5 kb)时，它比时，它比AMV反转录酶有效得多，这反转录酶有效得多，这与它无内切酶活性有关。与它无内切酶活性有关。3)用途用途 a.cDNA合成用于文库建立合成用于文库建立;b.制备制备cDNA探针探针;c.DNA序列分析序列分

48、析;第五十六页，讲稿共五十九页哦第四节第四节 DNA及及RNA修饰酶修饰酶1.末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶将脱氧核苷酸分子加到线性将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的分子的3-OH末端末端不需要模板，非特异性。不需要模板，非特异性。受体受体DNA可以是具有可以是具有3-OH末端的单链末端的单链DNA，也可以是具有，也可以是具有3-OH突出末突出末端的双链端的双链DNA。用途：用途：同聚物加尾同聚物加尾标记标记DNA片段的片段的3-末端末端按照模板合成多聚脱氧核苷酸的同聚物按照模板合成多聚脱氧核苷酸的同聚物第五十七页，讲稿共五十九页哦2.T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶催化催化-磷酸从磷

49、酸从ATP分子转移给分子转移给DNA或或RNA分子的分子的5-OH末端末端用于标记核酸分子的用于标记核酸分子的5-末端或是使寡核苷酸磷酸化末端或是使寡核苷酸磷酸化3.碱性磷酸酶碱性磷酸酶细菌碱性磷酸酶（细菌碱性磷酸酶（BAP）小牛肠碱性磷酸酶（小牛肠碱性磷酸酶（CIP）催化核酸分子脱掉催化核酸分子脱掉5-磷酸基团，克隆中防止单酶切产生的线性化载体分磷酸基团，克隆中防止单酶切产生的线性化载体分子自我连接。子自我连接。CIP容易热失活，且活性比容易热失活，且活性比BAP高高10-20倍，因此优先选用倍，因此优先选用。第五十八页，讲稿共五十九页哦第五节第五节 核酸外切酶核酸外切酶分为单链和双链核酸外切酶分为单链和双链核酸外切酶第五十九页，讲稿共五十九页哦