微生物的诱变育种.ppt

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1、微生物的诱变育种现在学习的是第1页，共23页一、诱变育种中的几个原则一、诱变育种中的几个原则 指利用物理或化学诱变剂处理微生物群体细胞，促进其突变率显著提高指利用物理或化学诱变剂处理微生物群体细胞，促进其突变率显著提高，然后设法从中选取少数符合育种目的的突变株。，然后设法从中选取少数符合育种目的的突变株。2个主要环节：个主要环节：诱变（随机）诱变（随机）选用合适的诱变剂和诱变剂量处理大量均匀、分散选用合适的诱变剂和诱变剂量处理大量均匀、分散的微生物细胞，以引起绝大多数细胞致死的同时，的微生物细胞，以引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中的突变频率大大提高。使存活个体中的突变频率大大提高。筛选

2、（定向）筛选（定向）设计有效的筛选方法，将少量正变株中的优设计有效的筛选方法，将少量正变株中的优良菌株挑选出来。良菌株挑选出来。现在学习的是第2页，共23页（一）（一）出发菌株（出发菌株（original strain）出发菌株出发菌株指用于诱变育种的起始菌株。指用于诱变育种的起始菌株。具有有利性状（如高产、生长速度快、营养要求粗放、具有有利性状（如高产、生长速度快、营养要求粗放、标记明显等）；标记明显等）；对诱变剂敏感对诱变剂敏感野生型菌株；野生型菌株；从生产中选育的自发突变菌株；从生产中选育的自发突变菌株；诱变获得的高产菌株诱变获得的高产菌株出发菌株的选择标准：出发菌株的选择标准：出发菌株

3、的来源：出发菌株的来源：现在学习的是第3页，共23页（二）（二）菌悬液的制备菌悬液的制备1.选用单细胞或单孢子悬液选用单细胞或单孢子悬液（均匀、分散）（均匀、分散）目的：目的：使每个细胞能均匀接触诱变剂；使每个细胞能均匀接触诱变剂；减少表型延迟现象（诱变后性状的分离及退化现象）减少表型延迟现象（诱变后性状的分离及退化现象）2.同步培养同步培养（生理状态一致）（生理状态一致）3.菌龄：对诱变剂最敏感时期菌龄：对诱变剂最敏感时期 营养细胞：对数期营养细胞：对数期 孢子或芽孢：萌发前期孢子或芽孢：萌发前期4.4.菌悬液的制备方法菌悬液的制备方法 物理诱变：生理盐水配制物理诱变：生理盐水配制 化学诱变

4、：缓冲液配制化学诱变：缓冲液配制5.菌悬液的浓度菌悬液的浓度 酵母菌，霉菌的孢子：酵母菌，霉菌的孢子：10106 6个个/mLmL 细菌，放线菌孢子：细菌，放线菌孢子：10108 8个个/mLmL 现在学习的是第4页，共23页（三）诱变剂的选择及处理方法（三）诱变剂的选择及处理方法1.诱变剂的选择（诱变剂的选择（高效，简便高效，简便）物理诱变剂：物理诱变剂：频度低、大损伤，难修复，且操作简便；频度低、大损伤，难修复，且操作简便；化学诱变剂：化学诱变剂：频度高，点突变，易回复突变，操作麻烦。频度高，点突变，易回复突变，操作麻烦。(NTG超诱变剂）超诱变剂）UV是最常用的一种诱变剂是最常用的一种诱

5、变剂现在学习的是第5页，共23页2.剂量的选择剂量的选择 突变率随剂量的增加而提高，但到达一定程度后，再提高剂量突变率随剂量的增加而提高，但到达一定程度后，再提高剂量,反而会使突变率下降。反而会使突变率下降。正变较多出现在偏低剂量中，而负变较多出现在偏高剂量中。正变较多出现在偏低剂量中，而负变较多出现在偏高剂量中。在产量变异工作中，常采用相对杀菌率为在产量变异工作中，常采用相对杀菌率为7075%,甚至甚至3070%的剂量的剂量。UV的剂量:固定UV功率和照射距离,以照射时间长短来确定剂量多少。最适剂量：最适剂量：在提高突变率的基础上，既能扩大变异幅度，在提高突变率的基础上，既能扩大变异幅度，又

6、能使变异向正突变范围移动的剂量。又能使变异向正突变范围移动的剂量。常以杀菌率来表示相对剂量（剂量-存活率曲线）现在学习的是第6页，共23页3.诱变处理方法诱变处理方法单因素处理或多因素的复合处理：单因素处理或多因素的复合处理：同一诱变剂的重复使用；同一诱变剂的重复使用；两种或多种诱变剂的先后使用；两种或多种诱变剂的先后使用；两种或多种诱变剂的同时使用两种或多种诱变剂的同时使用.现在学习的是第7页，共23页（四）（四）中间培养（中间培养（CM，培养过夜），培养过夜）目的：目的：克服表型延迟克服表型延迟表型延迟表型延迟（phenotypic lag）：表型的改变落后于基因型改变的表型的改变落后于基

7、因型改变的 现象现象.分离性延迟：分离性延迟：突变的基因经突变的基因经DNA复制和细胞分裂后变成纯复制和细胞分裂后变成纯 合状态，表型才能表现出来合状态，表型才能表现出来。生理性延迟：生理性延迟：由杂合状态变为纯合状态，突变表型仍不能由杂合状态变为纯合状态，突变表型仍不能 表现出来。表现出来。分离性延迟的原因分离性延迟的原因:对数生长期中，单核细胞常出现双核现象，多核细对数生长期中，单核细胞常出现双核现象，多核细胞的核也成倍增加，诱变对数期的细胞时，突变通常发生在一个核上，胞的核也成倍增加，诱变对数期的细胞时，突变通常发生在一个核上，故其变异或非变异的细胞必须经过一代或几代繁殖才能分离，这种纯

8、种故其变异或非变异的细胞必须经过一代或几代繁殖才能分离，这种纯种变异细胞出现的推迟现象称为分离延迟现象。变异细胞出现的推迟现象称为分离延迟现象。生理性延迟的原因生理性延迟的原因:当变异细胞由杂合状态变为纯合状态时当变异细胞由杂合状态变为纯合状态时,由于由于杂合期所合成的非变异的蛋白或酶仍然发挥作用杂合期所合成的非变异的蛋白或酶仍然发挥作用,必须经过细胞多必须经过细胞多代分离后代分离后,才能将这些非变异的酶稀释掉才能将这些非变异的酶稀释掉,最终达到变异后应该表现的形最终达到变异后应该表现的形态态,如营养缺陷型突变株的筛选过程。如营养缺陷型突变株的筛选过程。生理性延迟生理性延迟:现在学习的是第8页

9、，共23页（五）突变株的筛选（五）突变株的筛选 初筛初筛 复筛复筛1.初筛（以量为主）初筛（以量为主）（1 1）利用形态变异：）利用形态变异：需预先测定形态与产量的相关性需预先测定形态与产量的相关性（2 2）根据平板颜色反应直接挑选）根据平板颜色反应直接挑选 透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）；透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）；抑菌圈法（抗生素）；抑菌圈法（抗生素）；变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）；变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）；沉淀圈法（外毒素）沉淀圈法（外毒素）透明圈直径（透明圈直径（H H）/菌落直径（菌落直径（C C）：产量高低（初筛指标）：产量高低（初筛指标）2.复

10、筛（以质为主，定量测定）复筛（以质为主，定量测定）摇瓶培养，直接检测所需产物摇瓶培养，直接检测所需产物方法需简便、快速2步步现在学习的是第9页，共23页诱变育种的基本原则：诱变育种的基本原则：选择简便有效的诱变剂；选择简便有效的诱变剂；挑选优良的出发菌株；挑选优良的出发菌株；处理单细胞或单孢子悬液；处理单细胞或单孢子悬液；选用最适的诱变剂量；选用最适的诱变剂量；充分利用复合处理的协同效应；充分利用复合处理的协同效应；利用和创造形态、生理与产量间的相关指标；利用和创造形态、生理与产量间的相关指标；设计高效筛选方案；设计高效筛选方案；创造新型筛选方法。创造新型筛选方法。现在学习的是第10页，共23

11、页二、几种重要突变株的筛选方法二、几种重要突变株的筛选方法 1.抗性突变株的筛选抗性突变株的筛选 (1)抗终代谢物结构类似物突变株的筛选抗终代谢物结构类似物突变株的筛选(2)抗药性突变株筛选抗药性突变株筛选 2.营养缺陷型的筛选营养缺陷型的筛选 现在学习的是第11页，共23页 1.抗性突变株的筛选抗性突变株的筛选 （1）抗终代谢物结构类似物的突变株）抗终代谢物结构类似物的突变株 用途：筛选相应代谢物的高产菌株用途：筛选相应代谢物的高产菌株 （2）抗药性突变株）抗药性突变株 用途：筛选相应药物用途：筛选相应药物(抗生素抗生素)的高产菌株或遗传标记制作的高产菌株或遗传标记制作 筛选的方法筛选的方法

12、:a.高于临界浓度的平板进行分离；b.梯度平板法 敏感菌敏感菌苔苔 抗 性抗 性菌落菌落加入含异烟肼的上层加入含异烟肼的上层 加入不含异烟肼的底层加入不含异烟肼的底层 所谓结构类似物（又称代谢拮抗物）是指那些在结构上和代谢终产物（氨基酸、嘌呤、维生素等）相似的物质。如：异烟肼（“雷米封”）是吡哆醇的结构类似物，利用含异烟肼梯度平板筛选异烟肼抗性突变株，可达到定向培育吡哆醇高产突变株的目的。为什么在筛选突变株时,不能直接用代谢产物,而必须用其结构类似物?现在学习的是第12页，共23页2.营养缺陷型突变株的筛选营养缺陷型突变株的筛选（1）几个概念：）几个概念：三类培养基：三类培养基：基本培养基（基

13、本培养基（MM,minimal mediumMM,minimal medium）-：某野生型能生长的最低成分的组合培养基。某野生型能生长的最低成分的组合培养基。完全培养基（完全培养基（CM,complete mediumCM,complete medium）+：各种营养缺陷型能生长的天然或半组合培养基各种营养缺陷型能生长的天然或半组合培养基补充培养基（补充培养基（SM,supplemental mediumSM,supplemental medium）A:-+AA:-+A B:-+B B:-+B相应营养缺陷型能生长的组合或半组合培养基相应营养缺陷型能生长的组合或半组合培养基现在学习的是第13页

14、，共23页三种遗传型：三种遗传型：野生型（野生型（wild typewild type）从自然界分离到的、发生营养缺陷型突变前的原始菌株。从自然界分离到的、发生营养缺陷型突变前的原始菌株。A A+B B+,可在可在-生长。生长。营养缺陷型（营养缺陷型（auxotrophauxotroph）野生型菌株经诱变剂处理后，由于发生了丧失某种酶合成能力的突变野生型菌株经诱变剂处理后，由于发生了丧失某种酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变菌株，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变菌株（主要指（主要指合成维生素、氨基酸及嘌呤、嘧啶的能力）合成维生素、氨基酸及嘌呤

15、、嘧啶的能力）。A A+B B-：能在：能在+、BB生长生长 AA-B B+：能在：能在+、AA生长生长 AA-B B-：能在：能在+生长生长原养型（原养型（prototrophprototroph）营养缺陷型经回复突变或重组，回到原来野生型的营养要求营养缺陷型经回复突变或重组，回到原来野生型的营养要求 A A+B B+,可在可在-生长生长现在学习的是第14页，共23页（2）筛选步骤（）筛选步骤（5步）步）诱变处理诱变处理中间培养中间培养淘汰野生型淘汰野生型检出缺陷型检出缺陷型鉴定缺陷型鉴定缺陷型现在学习的是第15页，共23页中间培养中间培养CMCM或或SMSM培养基，培养过夜培养基，培养过夜

16、。克服表型延迟。克服表型延迟。淘汰野生型淘汰野生型即浓缩缺陷型，以提高检出率即浓缩缺陷型，以提高检出率方法方法 抗生素法抗生素法（G G+细菌：细菌：青霉素；青霉素；酵母菌和霉菌：酵母菌和霉菌：制霉菌素）制霉菌素）菌丝过滤法菌丝过滤法（丝状真菌、放线菌）（丝状真菌、放线菌）饥饿培养（无饥饿培养（无N N）MM 6 612 h12 h 2N 2N培养培养(2(2N)MMN)MM 1 12 h2 h 加抗生素加抗生素(或菌丝过滤或菌丝过滤)，培养过夜，培养过夜现在学习的是第16页，共23页 营养缺陷型的检出营养缺陷型的检出方法逐个检出法夹层培养法限量补充培养法影印平板法现在学习的是第17页，共23

17、页 营养缺陷型的鉴定营养缺陷型的鉴定生长谱法：生长谱法：快速，直观快速，直观分两步：分两步：a.a.三大类营养要求（氨基酸、维生素、核苷酸）的鉴定三大类营养要求（氨基酸、维生素、核苷酸）的鉴定b.b.具体到某一种营养要求的鉴定具体到某一种营养要求的鉴定(哪一种氨基酸哪一种氨基酸,哪一种哪一种 维生素维生素,或哪一种碱基或哪一种碱基)具体操作具体操作:一般采用一般采用“滤纸片法滤纸片法”现在学习的是第18页，共23页 a.不含维生素的酪素水解液或氨基酸混合液 b.维生素混合液 c.0.1%碱水解酵母核酸液a b c三大类营养要求的鉴定：三大类营养要求的鉴定：现在学习的是第19页，共23页以氨基酸

18、缺陷为例进行说明以氨基酸缺陷为例进行说明将将1818种氨基酸按右表分为种氨基酸按右表分为6 6组组特点：特点：每每2 2组只有一种共同物质组只有一种共同物质单一营养物质要求的鉴定：单一营养物质要求的鉴定：组组别别化合物代号化合物代号1178910 1122712 13 14 1533812 16 17 1844913 16 19 205510 14 17 19 216611 15 18 20 211 3 52 4 6现在学习的是第20页，共23页（3）营养缺陷型的用途）营养缺陷型的用途 生产菌(氨基酸、核苷酸、维生素等高产菌需求)；研究代谢途径和杂交、转化等遗传规律的遗传标记。现在学习的是第2

19、1页，共23页 诱变育种的程序：实验讲义诱变育种的程序：实验讲义p175 出发菌株出发菌株（纯化）（纯化）前培养前培养（CM，培养至对数期），培养至对数期）菌悬液制备菌悬液制备 活菌计数活菌计数 诱变预备实验（剂量存活率曲线）诱变预备实验（剂量存活率曲线）诱变处理诱变处理（相对杀菌率为（相对杀菌率为70-75%，30-70%）活菌计数活菌计数 中间培养中间培养（CM，培养过夜，克服表型延迟），培养过夜，克服表型延迟）突变株分离突变株分离 初筛初筛 复筛复筛 生产性能试验生产性能试验 菌种（鉴定与）保藏菌种（鉴定与）保藏现在学习的是第22页，共23页 1.从生产中选育从生产中选育 2.定向培育优良品种定向培育优良品种 一般指用特定因素长期处理微生物群体，同时不断地对它们进行移种传代，以达到积累并选择相应的自发突变株的目的。例：卡介苗（牛型结核分枝杆菌的减毒活菌苗）三、自发突变与育种三、自发突变与育种现在学习的是第23页，共23页