基因工程质粒介导细胞转基因系列实验讲稿.pptx

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1、第一页，讲稿共二十三页哦 little protein:238 amino acids,26.9 kDa structure:“-can“-helix-11 strand-barrel internal fluorophore:Ser-Tyr-Gly:green fluorescence,use in fusion protein(cell marker)第二页，讲稿共二十三页哦pIRES-EGFP contains the internal ribosome entry site(IRES)of the encephalomyocarditis virus(ECMV)between the

2、MCS and the EGFP(enhanced green fluorescent protein)coding region.This permits both the gene of interest(cloned into the MCS)and the EGFP gene to be translated from a single bicistronic mRNA.第三页，讲稿共二十三页哦Culture medium:DMEM+10%FBS+100U/ml Penicillin+0.1mg/ml StreptomycinAtmosphere:air,95%;carbon diox

3、ide(CO2),5%Temperature:37C 第四页，讲稿共二十三页哦Proliferation of pIRES-GFP1.Transformation of E.Coli.(DH5)with pIRES-GFP(Heat Shock)2.Proliferation of pIRES-GFP in fernmented E.Coli.Transfection of 293 cells with pIRES-GFP1.Transfection of 293 with pIRES-GFP(PEI)2.Detection of transfected 293 cells(fluoresce

4、nce microscope)第五页，讲稿共二十三页哦大肠杆菌大肠杆菌(E.coli)细胞处于容易吸收外源细胞处于容易吸收外源DNA的状态的状态第六页，讲稿共二十三页哦是存在于细菌染色体以外的是存在于细菌染色体以外的，能，能和表达其携带的遗传信息和表达其携带的遗传信息第七页，讲稿共二十三页哦 将对数生长期的细菌置于0、CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，细胞膜通透性改变(感受态细胞)；外源DNA分子在此条件下与Ca2+结合形成抗DNA酶的羟基钙磷酸复合物粘附在细菌表面；经42短暂热激处理，使细胞膜通透性增大，促进细胞吸收DNA复合物。第八页，讲稿共二十三页哦 的细菌的细菌()能在含能在含培

5、养皿培养皿第九页，讲稿共二十三页哦第十页，讲稿共二十三页哦 第十一页，讲稿共二十三页哦 3.第十二页，讲稿共二十三页哦 第十三页，讲稿共二十三页哦 第十四页，讲稿共二十三页哦第十五页，讲稿共二十三页哦 LB培养基的配方液体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L酵母提取物(Yeast extract)5g/L氯化钠(NaCl)10g/LPH 7.0-7.4固体培养基：液体培养基+10-15g/L的琼脂粉在15psi高压下蒸汽灭菌21min 温度和转速第十六页，讲稿共二十三页哦质粒小量抽提试剂盒细菌转移到2 ml离心管里，13000 rpm离心2 min。倒上清液，留下沉淀的细菌。加入25

6、0 l Buffer P1，使用移液器充分混匀沉淀细菌。加入250 l Buffer P2，上下颠倒4-6次温和混匀，液体变清稠。加入350 l Buffer N3，上下颠倒4-6次温和混匀，出现白色絮状，13000 rpm离心10 min。将上清液转移到吸附柱，13000 rpm离心1 min，倒收集管中废液。加入750 l Buffer PW，13000 rpm离心1 min，弃废液，重复离心一次。将吸附柱置新的离心管里，加入50 l Buffer EB，室温静置5 min，13000rpm离心1 min。用分光光度计（Nanodrop）检测提取的质粒浓度。结果：1质粒浓度不同组间相互比较

7、浓度高主观原因：操作规范；客观原因：所挑克隆的细菌里面质粒的拷贝数高。浓度低，原因相反。2 R260/280:DNA与蛋白质浓度比值。R高说明DNA纯度高，R1.8.R1.8说明蛋白质污染DNA，操作不够规范。第十七页，讲稿共二十三页哦聚乙烯亚胺聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI），是阳离子聚合物，将DNA缩合成带正电荷的微粒，这些微粒可以黏合到带有负电荷的细胞表面残基，并通过胞吞作用进入细胞。一旦进入细胞，胺的质子化导致反离子大量涌入以及渗透势降低。上述变化导致的渗透膨胀使囊泡释放聚合物与DNA形成的复合物（polyplex）进入细胞质。复合物拆解后，DNA就能自由的融合到

8、细胞核中。PEI有细胞毒性，不同细胞对PEI的耐受程度不同，PEI量越多转染效果越好，所以实验前需摸索最佳PEI的量。第十八页，讲稿共二十三页哦实验前一天，293细胞铺板：6孔板（直径35mm），5105个细胞/孔（50%覆盖率），2 ml细胞培养基/空；实验前准备转染液A:20 l PEI(1mg/ml)+5 l DMEM，轻轻混匀，室温放置五分钟B:1g质粒+DMEM(总体积25 l)A+B，轻轻混匀，室温放置30 min，质粒与PEI组装A+B混合液滴入细胞培养板中，一边滴，一边轻轻摇匀，使转染液在细胞培养液中均匀分布；将细胞放回培养箱内培养24-72小时，用荧光显微镜检查细胞内GFP的

9、表达情况。第十九页，讲稿共二十三页哦将受体细胞悬浮于含有待转化DNA的溶液中，在盛有上述悬浮液的电击池两端施加短暂的脉冲电场，使细胞膜产生细小的空洞并增加其通透性，此时外源DNA片段便能直接进入细胞核。电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大。第二十页，讲稿共二十三页哦转染前按照实验设计取出欲转染的转染前按照实验设计取出欲转染的 DNA(1 20g用于稳定转染，瞬用于稳定转染，瞬时转架可观用到时转架可观用到10-40g)，用乙醇沉淀法进行浓缩并灭菌，临转染，用乙醇沉淀法进行浓缩并灭菌，临转染前在洁净工作台内将前在洁净工作台内将 DNA溶解在溶解在10

10、l TE中中培养细胞至培养细胞至 5075汇合，汇合，4下下 640g离心离心5 min，收获细胞，若，收获细胞，若为贴壁细胞，可用胰蛋白酶消化并用血清将胰蛋白酶灭活为贴壁细胞，可用胰蛋白酶消化并用血清将胰蛋白酶灭活用电转液（用电转液（Solution I+II）冰浴预冷电穿孔缓冲液重悬细胞，）冰浴预冷电穿孔缓冲液重悬细胞，4 640g离心离心 5min，弃上清，弃上清用冰浴预冷电穿孔液重悬细胞用冰浴预冷电穿孔液重悬细胞,1107个细胞个细胞ml，用于稳定转，用于稳定转染，染，8107个细胞个细胞ml用于瞬时转染用于瞬时转染第二十一页，讲稿共二十三页哦电穿孔杯置于冰上电穿孔杯置于冰上10min

11、用用20倍体积的非选择性完全培养基稀释转染细胞并淋洗电穿孔杯以移倍体积的非选择性完全培养基稀释转染细胞并淋洗电穿孔杯以移去所有转染细胞去所有转染细胞稳定转染实验在非选择性培养基中培养稳定转染实验在非选择性培养基中培养48h（约两代）后更换选择培养基，（约两代）后更换选择培养基，瞬时转染则在转染瞬时转染则在转染 48 72 h后收获细胞，进行表达水平检测。后收获细胞，进行表达水平检测。在每个电穿孔专用细胞小室（在每个电穿孔专用细胞小室（Cuvette）中加人）中加人 0.5ml细胞悬浮细胞悬浮 液液并置于冰上并置于冰上加入欲转染加入欲转染 DNA，手指轻弹混匀，冰上放置，手指轻弹混匀，冰上放置 5 min将电穿孔杯置于电穿孔仪内，在优选的条件下电击一次或多次。电将电穿孔杯置于电穿孔仪内，在优选的条件下电击一次或多次。电压、电容及电击次数因细胞不同而异，应进行优选。一般电压为压、电容及电击次数因细胞不同而异，应进行优选。一般电压为250-750Vcm，电容为，电容为25F，脉冲时间为，脉冲时间为20-100 ms第二十二页，讲稿共二十三页哦第二十三页，讲稿共二十三页哦