外源目的基因表达与调控讲稿.ppt

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1、外源目的基因表达与调控第一页，讲稿共五十三页哦 生物体的遗传信息都是以核苷酸序列编生物体的遗传信息都是以核苷酸序列编码的形式储存在遗传物质码的形式储存在遗传物质DNA上上,基因表达基因表达是目的基因是目的基因DNA在导入的细胞内转录成在导入的细胞内转录成mRNA,再以再以mRNA指导翻译成蛋白质。基指导翻译成蛋白质。基因的表达依赖于有效的转录和因的表达依赖于有效的转录和mRNA的正的正确翻译以及翻译后的加工处理等各个环节确翻译以及翻译后的加工处理等各个环节的调节作用，其中转录最为关键，原核的的调节作用，其中转录最为关键，原核的基因表达过程和方式与真核细胞有显著不基因表达过程和方式与真核细胞有显

2、著不同。同。第二页，讲稿共五十三页哦 外源基因在受体细胞中的表达包括转录和翻译两个外源基因在受体细胞中的表达包括转录和翻译两个重要环节。重要环节。基因的转录是在基因的转录是在RNA聚合酶的作用下合成聚合酶的作用下合成mRNA，原核，原核生物生物mRNA一般不需要转录后加工。一般不需要转录后加工。真核生物真核生物mRNA在细胞内合成，且需要经过一繁殖加在细胞内合成，且需要经过一繁殖加工过程：工过程：RNA剪接、剪接、5端加帽、端加帽、3端加上端加上poly(A)尾巴。尾巴。原核生物一般没有翻译后加工，真核生物有较复杂的翻译原核生物一般没有翻译后加工，真核生物有较复杂的翻译后加工。后加工。第三页，

3、讲稿共五十三页哦第一节第一节 外源基因表达机制外源基因表达机制一、外源基因的起始转录一、外源基因的起始转录 外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤。选择可调外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤。选择可调控的启动子和相关的调控序列，是构建一个表达系统首先要控的启动子和相关的调控序列，是构建一个表达系统首先要考虑的问题。考虑的问题。理想的可调控的启动子在细胞生长的初期不表达或低理想的可调控的启动子在细胞生长的初期不表达或低水平表达，当细胞增殖达到一定的密度后，在某种特定诱水平表达，当细胞增殖达到一定的密度后，在某种特定诱导导因子的诱导下，因子的诱导下，RNA聚合酶开始启动转录，合成聚合酶开始启动

4、转录，合成mRNA。第四页，讲稿共五十三页哦二、二、mRNA的延伸与稳定性的延伸与稳定性 外源基因起始转录后，保持外源基因起始转录后，保持mRNA的有效延伸、终的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键。止及稳定存在是外源基因有效表达的关键。为了防止为了防止mRNA在转录过程中的非特异性终止，可在转录过程中的非特异性终止，可以在构建表达载体时加入抗终止的序列元件。以在构建表达载体时加入抗终止的序列元件。在表达载体中加入正常转录终止序列，可以防止产生在表达载体中加入正常转录终止序列，可以防止产生不必要的转录产物，使不必要的转录产物，使mRNA的长度限制在一定的范围内的长度限制在一定的范围

5、内，增加外源基因表达的稳定性。，增加外源基因表达的稳定性。第五页，讲稿共五十三页哦三、外源基因三、外源基因mRNA的有效翻译的有效翻译 外源基因在原核生物中的有效翻译需要考虑：外源基因在原核生物中的有效翻译需要考虑：1.AUG(ATG)是首选的密码子；是首选的密码子；2.SD序列为与核糖体序列为与核糖体16S rRNA互补结合的位点，该互补结合的位点，该序列至少含有序列至少含有AGGAGG序列中的序列中的4个碱基；个碱基；3.SD序列与翻译起始密码子之间的距离为序列与翻译起始密码子之间的距离为39个碱基个碱基；4.在翻译起始区的周围的序列不易形成明显的二级结在翻译起始区的周围的序列不易形成明显

6、的二级结构。构。第六页，讲稿共五十三页哦 真核细胞真核细胞mRNA的的5非翻译区不存在非翻译区不存在SD序列，但绝大序列，但绝大多数多数mRNA的起始序列含有共同序列。的起始序列含有共同序列。不同生物使用密码子具有不同的偏好性。如果外源基不同生物使用密码子具有不同的偏好性。如果外源基因的因的mRNA密码子使用受体的偏好密码子，则表达效率高密码子使用受体的偏好密码子，则表达效率高。mRNA上的终止密码对正确翻译的效率有很大影上的终止密码对正确翻译的效率有很大影响。在原核细胞中，响。在原核细胞中，UAA为最常用的终止密码子。为最常用的终止密码子。第七页，讲稿共五十三页哦四、表达蛋白质在细胞中的稳定

7、性四、表达蛋白质在细胞中的稳定性 外源基因的表达产物在宿主细胞中的稳定积累，不被宿外源基因的表达产物在宿主细胞中的稳定积累，不被宿主蛋白酶所降解，可有效提高表达量。主蛋白酶所降解，可有效提高表达量。避免外源蛋白被宿主蛋白酶降解的措施避免外源蛋白被宿主蛋白酶降解的措施:1.构建融合蛋白表达系统。构建融合蛋白表达系统。2.构建分泌蛋白表达系统。构建分泌蛋白表达系统。3.构建包涵体表达系统。构建包涵体表达系统。4.选择蛋白酶缺陷型的受体系统。选择蛋白酶缺陷型的受体系统。第八页，讲稿共五十三页哦五、基因沉默五、基因沉默 基因沉默是导致外源基因不能正常表达的重要因素，基因沉默是导致外源基因不能正常表达的

8、重要因素，主要出现在转基因动物和转基因植物中。主要出现在转基因动物和转基因植物中。目的基因沉默是在核酸水平上目的基因沉默是在核酸水平上DNA与与DNA、DNA与与RNA、RNA与与RNA相互作用的结果。重复序列或同源相互作用的结果。重复序列或同源序列是基因沉默的普遍原因之一，在构建表达载体时，序列是基因沉默的普遍原因之一，在构建表达载体时，应尽可能避免与内源序列有较高的同源性。应尽可能避免与内源序列有较高的同源性。第九页，讲稿共五十三页哦第二节第二节 基因表达的调控元件基因表达的调控元件一、启动子一、启动子 启动子是一段提供启动子是一段提供RNA聚合酶识别和结合的聚合酶识别和结合的DNA序列序

9、列，一般位于表达基因的上游。，一般位于表达基因的上游。1.序列特异性。在启动子的序列特异性。在启动子的DNA序列中，通常含有几个序列中，通常含有几个保守的序列框。保守的序列框。2.方向性。启动子是一种有方向性的顺式调控元件。方向性。启动子是一种有方向性的顺式调控元件。3.位置特性。一般启动子只能启动其下游基因的转录。位置特性。一般启动子只能启动其下游基因的转录。4.种属特异性。种属特异性。第十页，讲稿共五十三页哦二、增强子二、增强子 增强子是能够增强启动子转录活性的增强子是能够增强启动子转录活性的DNA顺式作顺式作用序列。用序列。1.双向性。正反两个方向调节活性。双向性。正反两个方向调节活性。

10、2.重复序列。增强子一般含有能独立行使功能的重复重复序列。增强子一般含有能独立行使功能的重复序列。序列。3.功能与位置无关。功能与位置无关。4.特异性。组织特异性，或在特定细胞阶段。特异性。组织特异性，或在特定细胞阶段。5.对异源基因也有调节功能。对异源基因也有调节功能。第十一页，讲稿共五十三页哦三、终止子三、终止子 终止子是提供终止信号使终止子是提供终止信号使RNA聚合酶停止转录的聚合酶停止转录的DNA序列。序列。本征终止子指不需要其他蛋白辅助因子便可在特本征终止子指不需要其他蛋白辅助因子便可在特殊的殊的RNA结构区内实现终止作用。属于强终止子。结构区内实现终止作用。属于强终止子。依赖型终止

11、子需要依赖型终止子需要因子的辅助，属于弱终止子。因子的辅助，属于弱终止子。第十二页，讲稿共五十三页哦四、衰减子四、衰减子 衰减子是基因表达调控的精细调节装置，利用原核生物衰减子是基因表达调控的精细调节装置，利用原核生物转录与翻译相偶联的特性，依赖自身巧妙的特征序列和相转录与翻译相偶联的特性，依赖自身巧妙的特征序列和相应的应的RNA二级结构，对基因转录进行地开关式的微调作用二级结构，对基因转录进行地开关式的微调作用，从而保证原核生物在相关操纵子处于阻遏的状态下仍能以，从而保证原核生物在相关操纵子处于阻遏的状态下仍能以一个本底水平合成氨基酸、核苷酸和抗生素等。一个本底水平合成氨基酸、核苷酸和抗生素

12、等。第十三页，讲稿共五十三页哦五、绝缘子五、绝缘子 绝缘子长约几百个核苷酸，是通常位于启动子同正调控绝缘子长约几百个核苷酸，是通常位于启动子同正调控元件元件(增强子增强子)或负调控因子之间的一种调控序列。绝缘子或负调控因子之间的一种调控序列。绝缘子本身对基因的表达既没有正效应，也没有负效应，其作用本身对基因的表达既没有正效应，也没有负效应，其作用只是不让其他调控元件对基因的活化效应或失活效应发生只是不让其他调控元件对基因的活化效应或失活效应发生作用。作用。第十四页，讲稿共五十三页哦六、反义子六、反义子 反义反义RNA是一类与特定是一类与特定DNA序列互补的小分子序列互补的小分子RNA。编码反义

13、编码反义RNA的的DNA称为反义子。反义称为反义子。反义RNA广泛存在于广泛存在于原核生物和真核生物中，在原核生物和真核生物中，在DNA的复制、转录和翻译三的复制、转录和翻译三个水平对基因的表达起着调节作用，其中以对蛋白质合成的个水平对基因的表达起着调节作用，其中以对蛋白质合成的抑制最普遍。抑制最普遍。第十五页，讲稿共五十三页哦第三节第三节 外源基因表达与调控外源基因表达与调控 外源基因表达包括目的基因与表达载体重组后，导入合外源基因表达包括目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物(目的蛋白目的蛋白)。

14、外源基因表达系统由基因表达载体和相应的受体外源基因表达系统由基因表达载体和相应的受体细胞两部分组成。细胞两部分组成。第十六页，讲稿共五十三页哦外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数转录翻译一、大肠杆菌表达系统一、大肠杆菌表达系统第十七页，讲稿共五十三页哦 R3510SD编码序列编码序列OriTcrTT启动子启动子起始密码子起始密码子AUG、GUG、UUG终止密码子终止密码子UAAU、UGA、UAG 大肠杆菌基因表达系统的表达载体一般是质粒表达载体，含有大肠杆菌内大肠杆菌基因表达系统的表达载体一般是质粒表达载体，含有大肠杆菌内源质粒复制起始位点和有

15、关序列组成的能在大肠杆菌中有效复制的复制子。源质粒复制起始位点和有关序列组成的能在大肠杆菌中有效复制的复制子。(一一)大肠杆菌基因表达载体大肠杆菌基因表达载体第十八页，讲稿共五十三页哦核糖体结合位点核糖体结合位点启动子启动子转录终止子转录终止子复制复制起点起点第十九页，讲稿共五十三页哦1.复制子是一段包含复制子起始位点和反式因子靶序列复制子是一段包含复制子起始位点和反式因子靶序列在内的在内的DNA片段。片段。大肠杆菌基因表达系统的表达载体一般是质粒表达大肠杆菌基因表达系统的表达载体一般是质粒表达载体，含有大肠杆菌内源质粒复制起始位点和有关序载体，含有大肠杆菌内源质粒复制起始位点和有关序列组成的

16、能在大肠杆菌中有效复制的复制子。列组成的能在大肠杆菌中有效复制的复制子。第二十页，讲稿共五十三页哦2.启动子和终止子启动子和终止子 启动子是调控外源基因转录的重要顺式元件。理想的启启动子是调控外源基因转录的重要顺式元件。理想的启动子应该具备以下性质：动子应该具备以下性质：第一第一,必须是强启动子，能够克隆基因的蛋白质产物的表必须是强启动子，能够克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的达量占细胞总蛋白的10%-30%以上以上 第二第二,这个启动子应能呈现出一种低限的基础转录水平，这个启动子应能呈现出一种低限的基础转录水平，因为在表达毒性蛋白质或是有损于寄主细胞生长的蛋白质的因为在表达毒性蛋白质

17、或是有损于寄主细胞生长的蛋白质的情况下，使用高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件情况下，使用高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件 第三第三,这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以使用廉价的诱导物而得以诱导诱导。第二十一页，讲稿共五十三页哦外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即 RNA 聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的 DNA 序列，形成长短不一的 mRNA 混合物过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下：转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子 mRNA 所需的时间就相应增加，外源基因

18、本身的转录效率下降；如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或 DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则 RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；过长的 mRNA 往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率。终止子第二十二页，讲稿共五十三页哦强终止子的选择与使用 目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌 rRNA 操纵子上 的 rrnT1T2 以及 T7 噬菌体 DNA 上的 Tf。对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二

19、聚体终止子串联的特 殊结构，以增强其转录终止作用第二十三页，讲稿共五十三页哦3.核糖体结合位点核糖体结合位点 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频 率，而且在很大程度上还与 mRNA 的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的 mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。mRNA 翻译的起始效率主要由其 5 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）。第二十四页，讲稿共五十三页哦 大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：位于翻译起始密码子上游的 68 个核苷酸序列 5 UAAGGAGG 3 即Shine-Dalgarno（SD）序列，

20、它通过识别大肠杆菌核糖体小亚 基中的 16S rRNA 3 端区域 3 AUUCCUCC 5 并与之专一性结合 将mRNA 定位于核糖体上，从而启动翻译；翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以 AUG作为阅读框架的 起始位点，有些基因也使用 GUG 或 UUG 作为翻译起始密码子 SD 序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成 基因编码区 5 端若干密码子的碱基序列第二十五页，讲稿共五十三页哦4.密码子密码子 不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性。相同，具有一定的偏爱性

21、。外源基因在大外源基因在大肠杆菌中的表达需考虑密码子的偏好性。肠杆菌中的表达需考虑密码子的偏好性。5.选择标记选择标记 大肠杆菌的选择标记一般采用抗生素抗大肠杆菌的选择标记一般采用抗生素抗性基因。性基因。第二十六页，讲稿共五十三页哦(二二)宿主菌宿主菌 外源基因表达产物在大肠杆菌细胞内容易被降解，为外源基因表达产物在大肠杆菌细胞内容易被降解，为了避免降解，需要构建与表达载体相适应的大肠杆菌宿主了避免降解，需要构建与表达载体相适应的大肠杆菌宿主菌。如菌。如BL21。第二十七页，讲稿共五十三页哦（三）常见的大肠杆菌表达系统（三）常见的大肠杆菌表达系统 目前应用广泛的目前应用广泛的大肠杆菌表达系统主

22、要有大肠杆菌表达系统主要有Lac和和Tac表达系统，表达系统，PL和和PR表达系统，表达系统，T7表达系统。表达系统。Lac和和Tac表达系统是以表达系统是以lac操纵子调控机制为基础构建操纵子调控机制为基础构建的表达系统。的表达系统。第二十八页，讲稿共五十三页哦P tac=3 P trp=11 P lac启动子-35 区序列-10 区序列 P lacT T T A C A T A T A A T P trp T T G A C AT T A A C T P tacT T G A C AT A T A A T P traA T A G A C A T A A T G T P lLT T G A

23、 C A G A T A C T P recAT T G A T A T A T A A T 启动子第二十九页，讲稿共五十三页哦 转录调控机理 具有多顺反子结构，基因排列次序为：启动子（lacP）-操纵基因（lacO）-结构基因（lacZ-lacY-lacA）正调节因子 CAP 负调节因子 lac I Lac 表达系统 以大肠杆菌 lac 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统 第三十页，讲稿共五十三页哦 lacI Plac lacO lacZ lacY lacA高效转录cAMPCAP lacI Plac lacO lacZ lacY lacARNA聚合酶本底水平转录Lac 表达系统 正调节

24、因子 CAP cAMP激活CAP，CAPcAMP复合物与 lac 操纵子上专一位点结合 后，能促进 RNA 聚合酶与 35、10 序列的结合，进而促进 Plac 介导的转录。RNA聚合酶RNA聚合酶基因工程中使用的 lac 启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即 Plac UV5 cAMP葡萄糖代谢cAMP浓度降低cAMPCAPCAP第三十一页，讲稿共五十三页哦Lac 表达系统 lac UV5 突变体 Plac UV5 突变体能够在没有 CAP 存在的情形下非常有效的起始 转录，受它控制的基因在转录水平上只受 lacI 的调控，因此用它 构建的表达载体在使用时比野生型 Plac 更易操作。第三

25、十二页，讲稿共五十三页哦Lac 表达系统 负调节因子 lac I 在无诱导物情形下，lacI 基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动 子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。lacI Plac lacO lacZ lacY lacARNA聚合酶本底水平转录 lacI Plac lacO lacZ lacY lacA高效转录RNA聚合酶IPTGmRNA第三十三页，讲稿共五十三页哦Tac 表达系统 tac 启动子是由 trp 的 35 序列和 lacUV5 的 10 序列拼接而成的杂 合启动子。调控模式与 lacUV5 相似，但 mRNA 转录水平高于 trp 和 lacUV5 启动子（P tac=

26、3 P trp=11 P lac），因此在要求有较高基因表达 水平的情况下，选用 tac 启动子比用 lacUV5 启动子更优越。启动子-35 区序列-10 区序列 P lacT T T A C A T A T A A T P trp T T G A C AT T A A C T P tacT T G A C AT A T A A T 第三十四页，讲稿共五十三页哦lac、tac 启动子对宿主菌的要求 在普通大肠杆菌中，LacI 阻遏蛋白仅能满足细胞染色体上 lac 操纵子 转录调控的需要。当多拷贝的 lacO 随着带有 lacUV5、tac 启动子的表达质粒转化进入 大肠杆菌后，LacI 阻遏

27、蛋白与 lacO 的比例显著下降，无法保证每一 个 lacO 都能获得足够的 LacI 阻遏蛋白参与转录调控。表现为在无诱 导物存在的情形下，lacUV5、tac 启动子有较高的本底转录。第三十五页，讲稿共五十三页哦lac、tac 启动子对宿主菌的要求 为了使以 Lac、Tac 表达系统具有严紧调控外源基因转录的能力，一 种能产生过量的 LacI 阻遏蛋白的 lacI 基因的突变体 lacIq 被应用于表 达系统。大肠杆菌 JM109 等菌株的基因型均为 lacIq，常被选用为 Lac、Tac 表达系统的宿主菌。但是这些菌株也只能对低拷贝的表达载体实现严紧调控，在使用高拷 贝复制子构建表达载体

28、时，仍能观察到较高水平的本底转录。需在表达载体中插入 lacIq 基因以保证有较多的 LacI 阻遏蛋白产生。第三十六页，讲稿共五十三页哦lac、tac 表达系统存在的问题 IPTG 用于诱导 lac、tac 启动子的转录，但由于 IPTG 本身具有一定的 毒性。从安全角度，对表达和制备用于医疗目的的重组蛋白并不适合。一些国家规定在生产人用重组蛋白质的生产工艺中不能使用 IPTG 解决方法 lac 和 tac 启动子的转录受温度严紧调控 乳糖替代 IPTG 诱导 lac 和 tac 启动子的转录第三十七页，讲稿共五十三页哦lac、tac 表达系统存在的问题 lac 和 tac 启动子的转录受温

29、度严紧调控 把阻遏蛋白 LacI 的温度敏感突变体lacI(ts)、lacIq(ts)插入表达载体或 整合到染色体后，均能使 lac 和 tac 启动子的转录受到温度严紧调控 在较低温度（30）时抑制，在较高温度（42）时开放。用乳糖替代 IPTG 诱导 lac 和 tac 启动子的转录 乳糖在 b-半乳糖苷酶作用下生成异乳糖，异乳糖具有诱导剂的作用 这一过程涉及乳糖的转运和转化，其效率受到多种因素的影响和制约 因此乳糖诱导的有效剂量大大高于IPTG。乳糖本身作为一种碳源可以被大肠杆菌代谢利用，较多的乳糖存在也 会导致菌体生理及生长特性变化。乳糖替代 lPTG 作为诱导剂的研究 要与发酵工艺结

30、合起来，才能显示其良好的前景。第三十八页，讲稿共五十三页哦 T7 表达系统 大肠杆菌 T7 噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一 体系中的元件为基础构建的表达系统称为 T7 表达系统。第三十九页，讲稿共五十三页哦 T7 表达系统 T7 噬菌体基因 1 编码的 T7 RNA 聚合酶选择性的激活 T7 噬菌体启 动子的转录。T7 RNA 聚合酶活性高，其合成 RNA 的速度比大肠杆菌 RNA 聚合 酶快 5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌 RNA聚合酶有效转 录的序列。在细胞中存在 T7 RNA聚合酶和 T7噬菌体启动子的情形下，大肠杆 菌宿主本身基因的转录竞争不过 T7 噬菌体转录

31、体系，最终受 T7噬 菌体启动子控制的基因的转录达到很高的水平。第四十页，讲稿共五十三页哦T7 表达系统 转录调控的机理 T7 噬菌体启动子的转录完全依赖于 T7 RNA 聚合酶，因此 T7 RNA 聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。化学诱导型 温度诱导型 双质粒系统T7 RNA 聚合酶T7 启动子 目的基因 T7 RNA 聚合酶基因？启动子第四十一页，讲稿共五十三页哦 T7 表达系统 转录调控的机理 化学诱导型 噬菌体 DE3 是 l 噬菌体的衍生 株，一段含有 lacI、lacUV5 启 动子和 T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被插入其 int 基因中 用噬菌体 DE

32、3 的溶源菌作为表 达载体的宿主菌，调控方式为 化学诱导型，类似于 Lac 表达 系统。T7 RNA 聚合酶基因 lac 启动子E.Coli（DE3）T7 启动子 目的基因T7 RNA 聚合酶IPTG诱导第四十二页，讲稿共五十三页哦T7 表达系统存在的问题 T7 表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达系统中最高的，但 也不可避免出现相对较高的本底转录，如果目的基因产物对大肠杆 菌宿主有毒性，会影响细胞的生长。解决办法之一 在表达系统中低水平表达 T7 溶菌酶基因。因为 T7 溶菌酶除了作用于大肠杆菌细胞壁上肽聚糖外，还能与 T7 RNA 聚合酶结合抑制其转录的活性。目前 T7 溶菌酶基因都通

33、过共转化质拉导入表达系统，它能明显 降低本底转录，但对诱导后目的基因的表达水平无明显影响。第四十三页，讲稿共五十三页哦1.包涵体蛋白包涵体蛋白 在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。富含蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。除

34、此之外，包涵体中还含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。（四）外源基因在大肠杆菌表达的形式（四）外源基因在大肠杆菌表达的形式第四十四页，讲稿共五十三页哦以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点 包涵体表达形式的优点 在一定程度上保持表达产物的结构稳定 能够避免细胞内蛋白水解酶的作用，有利于目标蛋白的富集 简化外源基因表达产物的分离操作 包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌 体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细 菌裂解物中分离出来 能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白。第四十五页，讲稿共五十三页哦以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点 包涵体表达形式

35、的缺点 以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过 有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具 有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标 产物的收率至关重要。经过复性处理的目标蛋白不一定能完全恢复原来的生物学活性，有时甚至完全得不到有活性的蛋白质，尤其当目标蛋白分子中的 Cys残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不 超过 30%复性处理工艺可使目标蛋白的制备成本上升。第四十六页，讲稿共五十三页哦2.融合蛋白融合蛋白 将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因的开放阅读

36、框，以这种方式表达的蛋白质称为改变两个基因的开放阅读框，以这种方式表达的蛋白质称为融合蛋白。融合蛋白。外源蛋白与菌体自身蛋白融合表达后稳定性大大增加，避外源蛋白与菌体自身蛋白融合表达后稳定性大大增加，避免受到菌体蛋白酶的降解。免受到菌体蛋白酶的降解。第四十七页，讲稿共五十三页哦 与纯化包涵体相比，细胞质中以可溶性形式表达蛋白质的分离与纯化包涵体相比，细胞质中以可溶性形式表达蛋白质的分离纯化过程比较复杂，一般要通过亲合层析才能达到比较高的纯度。纯化过程比较复杂，一般要通过亲合层析才能达到比较高的纯度。目标蛋白与有亲合配基的序列融合表达既可以提高分离纯化的目标蛋白与有亲合配基的序列融合表达既可以提

37、高分离纯化的效率，又能在融合蛋白切离的过程中得到没有附加甲硫氨酸目标蛋效率，又能在融合蛋白切离的过程中得到没有附加甲硫氨酸目标蛋白。白。金黄色葡萄球菌蛋白金黄色葡萄球菌蛋白G、A和衍生物和衍生物Z，日本血吸虫谷胱甘肽，日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶，大肠杆菌麦芽糖结合蛋白，转移酶，大肠杆菌麦芽糖结合蛋白，His-tag 等是目前常用的与目标等是目前常用的与目标基因融合表达的序列。基因融合表达的序列。第四十八页，讲稿共五十三页哦3.寡聚型外源蛋白寡聚型外源蛋白 在构建表达载体时，将多个外源基因串联在一起，克隆在低在构建表达载体时，将多个外源基因串联在一起，克隆在低拷贝质粒上。拷贝质粒上。有三种方

38、式：有三种方式：多表达单元的重组，含有独立的启动子、多表达单元的重组，含有独立的启动子、SD序列、起始密码子和序列、起始密码子和终止密码子。终止密码子。多顺反子重组，有各自的多顺反子重组，有各自的SD序列、翻译起始和终止信号，共用启动序列、翻译起始和终止信号，共用启动子和终止子。子和终止子。多编码序列重组，多个外源基因串联在一起，利用同一套转录调控元多编码序列重组，多个外源基因串联在一起，利用同一套转录调控元件和翻译起始与终止密码子，在各编码序列的接口处引入蛋白酶切割位件和翻译起始与终止密码子，在各编码序列的接口处引入蛋白酶切割位点。点。第四十九页，讲稿共五十三页哦4.整合型外源蛋白的表达整合

39、型外源蛋白的表达 将要表达的外源基因整合到染色体的特定位置上，使之成将要表达的外源基因整合到染色体的特定位置上，使之成为染色体结构的一部分而稳定地遗传和表达。为染色体结构的一部分而稳定地遗传和表达。5.分泌型蛋白的表达分泌型蛋白的表达 将外源蛋白通过运输或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中将外源蛋白通过运输或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中表达。表达。大肠杆菌分泌能力较低，可将外源蛋白运输到周质空间，只大肠杆菌分泌能力较低，可将外源蛋白运输到周质空间，只有少数蛋白可穿过外膜。有少数蛋白可穿过外膜。第五十页，讲稿共五十三页哦目标蛋白在周质空间中表达目标蛋白在周质空间中表达目标蛋白在周质空间

40、中表达的优点 大肠杆菌周质空间中自身蛋白质的数量约为 100 种，只占菌体总蛋白数量的4%。蛋白水解酶的含最与细胞质中的相比也少得多，因此目标蛋白在周质空间中表达有利于分离纯化和减少蛋白水解酶的降解。目标蛋白从细胞质转运到周质空间过程中信号肽被加工切除，有效地避免了N 端附加的甲硫氨酸的产生。周质空间中呈氧化型的氧化还原态势使目标蛋白能够较好折叠，维持正确的构象。第五十一页，讲稿共五十三页哦目标蛋白外泌表达目标蛋白外泌表达 把所表达的目标蛋白外泌到细胞外的培养基中可以进一步减少蛋白水解酶的降解，也有利于分离纯化。目前成功的例子主要是采用以下方案:（1）与大肠杆菌本身的外泌蛋白基因融合表达 （2）与一些能提高细胞外膜通透性的因子融合或共表达 （3）改变培养基的成分 已有的研究结果显示这些方法仅对外泌分子量较小的蛋白有效，而且外泌效率一般都比较低。第五十二页，讲稿共五十三页哦1.优化表达载体的设计 启动子、终止子、SD序列2.提高稀有密码子tRNA的表达作用3.提高外源基因mRNA的稳定性4.提高外源基因表达产物的稳定性 分泌表达，选用蛋白酶缺陷型宿主，改造表达产物序列5.优化发酵过程 工艺方面的优化:发酵罐 生物学方面的优化：细菌生长条件（五）在大肠杆菌中高效表达目的基因的策略（五）在大肠杆菌中高效表达目的基因的策略第五十三页，讲稿共五十三页哦