植物组织培养的基本方法课件.ppt
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1、关于植物组织培养的基本方法第1页,此课件共37页哦目的要求目的要求1一般掌握灭菌和消毒的区别2掌握灭菌的方法和具体操作过程3掌握无菌接种的步骤 4掌握外植体的选择、培养方法和步骤5一般掌握外植体褐变和玻璃化的处理方法6掌握试管苗驯化的基本程序7一般掌握快速繁殖试管苗的计划安排及增殖倍数计算方法 第2页,此课件共37页哦灭菌 灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者首先要清楚有菌和无菌的范畴。这里所指的菌,包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其它微生物。第3页,此课件共37页哦灭菌是指用物理或化学的方法,杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体,即把所有生命的物质全部杀死。消毒,它指杀死、消除或充分抑制部
2、分微生物,使之不再发生危害作用,显然经过消毒,许多细菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死,即消毒后的环境里、物品上还有活着的微生物。而通过严格灭菌的操作空间(接种室、超净台、等)和使用的器皿,以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行操作,就叫做无菌操作。第4页,此课件共37页哦常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类。物理方法如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(超声波、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施。化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当
3、选用。第5页,此课件共37页哦1培养基用湿热灭菌 培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序按容器大小不同,保压时间有所不同(下表)。容器的体积(ml)在121灭菌所需最少时间(min)第6页,此课件共37页哦2.用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌在无菌操作时,把镊子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中,使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌。冷却后,立即使用。操作中可采用250或500ml的广口瓶,放入95%的酒精,以便插入工具。3.玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌干热灭菌是利用烘箱加热到160180的温度来杀死微生物。通常采用170 持续90分钟来灭菌。4.不耐热的物质采用过滤灭菌一些生长调节剂,如赤霉素
4、、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的,不能用高压灭菌处理,通常采用过滤灭菌方法-防细菌滤膜。第7页,此课件共37页哦5.空间采用紫外线和熏蒸灭菌(1)紫外线灭菌在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌。细菌吸收紫外线后,蛋白质和核酸发生结构变化,引起细菌的染色体变异,造成死亡。紫外线的波长为200300nm,其中以260nm的杀菌能力最强,但是紫外线的穿透物质的能力很弱,所以只适于空气和物体表面的灭菌,且要求距照射物以不超过1.2米为宜。(2)熏蒸灭菌 用加热焚烧、氧化等方法,使化学药剂变为气体状态扩散到空气中,以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便,只需要
5、把消毒的空间关闭紧密即可。升汞与高锰酸钾,常用熏蒸剂是甲醛。第8页,此课件共37页哦6.一些物体表面用药剂喷雾灭菌物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手表面、植物材料表面等。可用70的酒精反复涂擦灭菌,的来苏儿溶液以及0.25的新洁尔灭也可以。第9页,此课件共37页哦7.植物材料表面用消毒剂灭菌外植体的选择:外植体部位:不同植物以及同一植物的不同器官对诱导条件的反应不一样;取材季节:大多数植物应该在生长开始的时候采集;器官的生理状态和发育年龄:幼年组织比老年组织具有较高的形态发生能力;外植体大小:茎尖培养中,外植体越小成活率越低。第10页,此课件共37页哦外植体的灭菌方法:植物
6、材料必须经严格的表面灭菌处理,再经无菌操作手续接到培养基上,这一过程叫做接种。接种的植物材料叫做外植体。首先,将采来的植物材料除去不用的部分,将需要的部分仔细洗干净,如用适当的刷子等刷洗,硬的材料用刮刀刮。第二步是对材料的表面浸润灭菌。第三步是用灭菌剂处理。最后一步是用无菌水涮洗,涮洗要每次3分钟左右,视采用的消毒液种类,涮洗310次左右。第11页,此课件共37页哦常用的消毒剂:既要考虑具有良好的消毒、杀菌作用,同时又易被蒸馏水冲洗掉或分解掉;应当正确选择消毒液的浓度和处理时间,应尽量减少组织的死亡;一些表面消毒剂的消毒效果不相同。灭菌剂使用浓度持续时间(min)去除的难易 效果次氯酸钙90-
7、100g/l530易很好次氯酸钠5-20g/l530易很好漂白粉饱和溶液530易很好氯化汞0.1-10g/l2-10较难最好乙醇700-750ml/l0.2-2易好过氧化氢100-120ml/l5-15最易好溴水10-20ml/l2-10易很好抗菌素450mg/L3060中较好第12页,此课件共37页哦接 种接种是将已消毒好的根、茎、叶等离体器官,经切割或剪裁成小段或小块,放入培养基的过程。第13页,此课件共37页哦接种前后的程序:A:接种室消毒:用酒精擦拭台面,接种工具摆放好后用紫外灯照射表面灭菌15-20分钟,然后通风20分钟;B:手要洗净,用75%酒精擦手,在操作过程中要经常用酒精擦手;
8、C:将初步洗涤及切割的材料放入烧杯(烧杯用75%酒精擦杯壁),带入超净台上,用消毒剂灭菌,再用无菌水冲洗最后沥去水分,取出放置在灭过菌的层纱布上或滤纸上。D:材料吸干后,一手拿镊子,一手拿剪子或解剖刀,对材料进行适当的切割。E:用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。第14页,此课件共37页哦培养培养:指把培养材料放在培养室(有光照、温度条件)里,使之生长,分裂、分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。第15页,此课件共37页哦(一)培养方法1固体培养法即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。是现在最常用的方法。该法设备简单,易行。但养分分布不均,生长速度不均衡。并常有褐
9、化中毒现象发生。2液体培养法即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。由于液体中氧气含量较少,常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给,采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养,其速度一般为50100转分,这种定期浸没的方法,既能使培养基均一,又能保证氧气的供给。静止培养:滤纸桥培养振荡培养:磁力搅拌器、摇床、自旋式培养架 第16页,此课件共37页哦(二)培养步骤:1初代培养:即接种某种外植体后,最初的几代培养。初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系。初代培养时,常用诱导或分化培养基,即培养基中含有较多的细胞分裂素和少量的生长素。初代培养建立的无性繁殖系包括茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。第
10、17页,此课件共37页哦(1)顶芽和腋芽的发育采用外源的细胞分裂素,可促使具有顶芽或没有腋芽的休眠侧芽启动生长。适宜这种再生繁殖的植物,在采样时,只能采用顶芽、侧芽或带有芽的茎切段,其它如种子萌发后取枝条也可以。(2)不定芽的发育在培养中由外植体产生不定芽,通常首先要经脱分化过程,形成愈伤组织的细胞。多数情况下它先形成芽,后形成根。另一种方式是从器官中直接产生不定芽,如矮牵牛、福禄考、悬钩子等。许多常规方法不能无性繁殖的种类,在试管条件下却能较容易地产生不定芽而再生,如柏科,松科,银杏等一些植物。许多单子叶植物储藏器官能强烈地发生不定芽,用百合鳞片的切块就可大量形成不定鳞茎。在不定芽培养时,也
11、常用诱导或分化培养基,如非洲菊、草莓等。(3)体细胞胚状体的发生与发育第18页,此课件共37页哦NoImage第19页,此课件共37页哦2继代培养:在初代培养的基础上所获得的芽、苗、胚状体和原球茎等,数量都还不多,它们需要进一步增殖,使之越来越多,从而发挥快速繁殖的优势。第20页,此课件共37页哦继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。旨在繁出相当数量的无根苗,最后能达到边繁边生根的目的。继代培养的后代是按几何级数增加的过程。在快速繁殖中初代培养只是一个必经的过程,而继代培养则是经常性不停的进行过程。但在达到相当的数量之后,则应考虑使其中一部分转入生根阶段。从某种意义上讲,增殖只是贮
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