2022年生物素标记蛋白操作方法推荐 .pdf

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1、抗体生物素标记操作方法一般每个抗体可以标记3-5个生物素，标记时，生物素与抗体的比率受抗体浓度影响，对于 10 mg/ml 的抗体溶液来说，生物素应超过蛋白12倍（摩尔数），对于2 mg/ml 的抗体溶液应超过 20倍，生物素也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。蛋白样品不得含有叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris 或其他任何有自由氨基的添加物。一、试剂和器材：1、标记反应溶液：0.1M pH 7.2 PBS（0.15M sodium chloride）NaCl 8.77 g；Na2HPO412H2O 32.3g；NaH2PO42H2O 4.5g；加双蒸水 900mL 左右，用 HCl/NaOH

2、调 pH至 7.2，最后定容为 1000mL 2、10mM NHS-dPEG4-Biotin 配方：称取0.56mg NHS-dPEG4-Biotin（分子量为587），溶解于 95 l 超纯水中，临用前配置，不可储存，立刻使用。NHS-PEG4-Biotin 容易潮解，开瓶前平衡至室温。也可以配置 200 nmol/L 储备液：20mg NHS-dPEG4-Biotin溶解于 170 l DMSO中，-20稳定几个月。由于NHS-PEG4-Biotin昂贵，而且使用量少，不能保存，配制时，直接将NHS-PEG4-Biotin 放入 1.5ml EP 管中，以实际称量的NHS-PEG4-Bio

3、tin 按比率加入超纯水。3、超滤管、Millipore超滤管 0.5ml 10KD:截留分子量 10KD，残留体积 200 l，蛋白回收率 95%，7500 g（允许的最大离心力 14000 g）离心 10min。、Millipore超滤管 0.5ml 50KD:截留分子量 50KD，残留体积 80 l，蛋白回收率 94%，7500 g（允许的最大离心力 14000 g）离心5 min。、Amicon Ultra-0.5ml离心超滤管（Millipore），效果更好，典型的最终浓缩物体积：5-15ul。名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 1 页，共 5 页 -二、抗体超滤处理标

4、记前需要应用截留分子量为50kDa 的超滤柱对抗体进行标记前纯化处理(如果不是抗体，一定要按蛋白分子量来确定超滤柱截留分子量)，以除去蛋白样品中可能含有的叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris 或其他任何有自由氨基的添加物，防止干扰标记反应。具体操作步骤：1、于超滤柱中加入200l 标记反应溶液，加入 500ug 单克隆抗体，混匀。2、4，6000rpm，离心 2min。弃滤液。3、于超滤柱中加入 100l 标记反应溶液，混匀。4，Max 14000 g，2min。4、重复步骤 2 6 到 7 次。5、混匀超滤柱中的残留的液体，室温静置1min。6、将超滤柱反转倒置于一新的超滤管中，4，1000 g

5、，2min，收集滤液。7、取 50l PBS 于超滤柱中混匀，静置1min。8、倒置超滤柱，4，6000rpm，2min。收集滤液，与步骤6 的滤液合并，4放置备用。用标记反应溶液调节抗体浓度到2mg/ml（0.25ml）。三、生物素标记抗体1、计算抗体标记需要生物素用量。抗体浓度 2 mg/ml 时的简要计算：1mL of 2 mg/mL IgG(150,000 MW)需要 26 L of 10mM NHS-PEG4-Biotin 具体计算方式见附录一（标记生物素计算）2、超滤后的滤液加入NHS-PEG4-Biotin溶液，室温反应1h。3、葡聚糖凝胶分离纯化(去除游离生物素)：四、葡聚糖凝

6、胶分离纯化标记抗体操作步骤：（一）、试剂：1、纯化柱处理液 :100 mmol/L Na0H;2、纯化柱平衡液:50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，每升含 0.5g NaN3，8g NaCl;3、样品洗脱液:同纯化柱平衡液;4、标记抗体保护液（50）:10ml0.01M pH7.2 PBS 中加入 0.5g BSA，0.2g 名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 2 页，共 5 页 -NaN3。（二）、凝胶过滤：方法见“凝胶过滤法纯化微量标记蛋白”五、标记抗体的长期保存方法将“标记抗体保护液（50）”加入到标记抗体溶液中，使 BSA终浓度为 0.1%，4 或-2

7、0 保存。六、数据记录：抗体浓度：mg/ml 加入抗体体积：l 标记前抗体体积：l 加入NHS-PEG4-Biotin体积：l 纯化柱规格：cm cm凝胶体积：ml 加入标记抗体体积：l 所有洗脱溶液1ml/管收集，到核酸蛋白检测仪显示出峰后，改为0.5ml/管收集，并记录数据：管号1 2 3 4 洗脱液体积A280 管号5 6 7 8 洗脱液体积A280 管号9 10 11 12 洗脱液体积A280 名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 3 页，共 5 页 -附录：一、标记生物素计算：1、不同抗体浓度时，抗体与Sulfo-NHS-Biotin的比率：Sulfo-NHS-Bioti

8、n MW：589 2、10mmol/L Sulfo-NHS-Biotin 配方：3、标记生物素计算加入体积计算：Sulfo-NHS-Biotin：抗体抗体浓度 10-12mg/ml 时12 抗体浓度 4-7mg/ml 时16 抗体浓度 1-3 mg/ml 时20 抗体浓度 0.5mg/ml 时50 Sulfo-NHS-Biotin （mg)PBS（l)Sulfo-NHS-Biotin （mg/l)0.56 95.1 0.00589 计算公式抗体浓度 2 mg/ml时*抗体浓度（mg/ml）4.5 抗体加入量（ml)0.11 抗体加入量（mg)抗体浓度 抗体加入量0.495 抗体的毫摩尔数（其他蛋白注意分子量）抗体加入量/1500000 0.0000033 需要的活化 Biotin量（mmol）抗体的毫摩尔数 200.000066 活化 Biotin量（mg）Sulfo-NHS-Biotin量（毫摩尔）5890.038874 需要10mmol/L 活化 Biotin体积（l）活化 Biotin量（mg）/活化 Biotin浓度（mg/l)6.6 名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 4 页，共 5 页 -名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 5 页，共 5 页 -