2022年细菌内毒素检测方法验证方案定稿整理 .pdf

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1、细菌内毒素检测方法验证方案1/9 细菌内毒素检测方法验证方案起草人：部门姓名签名日期QC 朱雪审核人：部门姓名签名日期批准人：部门姓名签名日期生效日期：文件分发范围：QA、QC 1.验证目的：为确保细菌内毒素检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求，名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 1 页，共 9 页 -细菌内毒素检测方法验证方案2/9 特制定此验证方案。2.验证范围：适用于注射液细菌内毒素检测方法验证。3.验证小组成员及职责：组长：，QC 经理，负责协调小组的行动，跟进验证方案的审批流程，协调与其他部门及小组成员内的交流，组织验证数据并文件化。组员：，QC人员

2、，负责起草方案并按照确认方案进行验证，起草验证报告。组员：QC 微生物主管，负责验证方案与报告的审核，验证过程的复核。4.验证依据：4.1 药品生产质量管理规范（2010年修订）4.2 药品生产验证指南(2003 年版)4.4 细菌内毒素检验操作规程（SN-O08-F0061-02）4.5 中国药典 2010 版二部附录5.验证前准备：5.1 人员培训确认：姓名部门培训时间培训内容考核结果注射液细菌内毒素检测方法验证方案（SN-AMVP2012055）标准所有参与人员均应培训考核合格。结论备注检查人：日期：复核人：日期：5.2 仪器设备仪器设备型号设备编码校验有效期名师资料总结-精品资料欢迎下

3、载-名师精心整理-第 2 页，共 9 页 -细菌内毒素检测方法验证方案3/9 电热干燥箱洁净工作台试管恒温仪旋涡混合器移液枪5.3 检验材料、试剂及标准品名称规格批号灵敏度内毒素含量生产厂家细菌内毒素检查用水细菌内毒素工作标准品鲎试剂异丙醇无热原吸头6.鲎试剂灵敏度复核：以上该批鲎试剂按细菌内毒素检查法操作规程（SN-O08-F0061-02）检查法的要求复核标示灵敏度，应符合规定。鲎试剂灵敏度复核记录（SN-O08-F0061-R02-01）编号：。名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 3 页，共 9 页 -细菌内毒素检测方法验证方案4/9 灵敏度复核结果：EU/ml 7.验证方

4、法：通过比较内毒素在水溶液和供试品溶液中反应的差异程度，来确定供试品在该浓度下是否对细菌内毒素（BET）检查有干扰，至少对3 批样品进行干扰试验。7.1 供试品细菌内毒素限值和最大稀释倍数的确定（L）：7.1.1限值：每 1mg中含细菌内毒素的量应小于30EU 7.1.2供试品的最大有效稀释倍数（MVD）公式：MVDC*L/式中：C 为供试品溶液的浓度（为2.5mg/ml），其中当L 以 EU/ml 表示时，C 为1.0ml/ml；当 L 以 EU/mg或 EU/U表示时，C的单位为 mg/ml 或 U/ml，为鲎试剂的灵敏度。7.1.3最大有效稀释倍数（MVD）计算结果：MVD CL/（2.

5、5mg/ml*30EU/mg）/0.25 EU/ml 300 倍7.2 干扰试验7.2.1细菌内毒素标准溶液制备：取细菌内毒素工作标准品（160EU/ml）一支，开启，加入 1ml 细菌内毒素检查用用水溶解，置旋涡混合器上混合15 分钟，得到 160EU/ml的内毒素标准溶液（以 E160表示），用细菌内毒素检查用水稀释成4 个浓度的标准溶液即2、0.5、0.25。具体稀释过程如下:（选用灵敏度=0.25 的鲎试剂进行实验）1mlBET 0.2mlE160 0.2mlE16 1.0ml E8 1.0mlE1 1.0mlE0.5 E160/支 E160 E16 E1.6 E1 E0.5 1.8m

6、lBET 1.8mlBET 0.6mlBET 1.0mlBET 1.0mlBET 1.0mlE0.25 1.0mlE0.125 E0.25 E0.125E0.0625 1.0mlBET 1.0mlBET 7.2.2供试品溶液的制备直接将供试品按最大稀释倍数稀释，即稀释300倍,供试液浓度为 S300。稀释步骤如名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 4 页，共 9 页 -细菌内毒素检测方法验证方案5/9 下：0.2ml 0.5ml 5.0ml S原液 S10S150 S300 1.8ml 7.0ml 5.0ml 7.2.3含内毒素的供试品溶液的制备用供试品溶液将 7.2.1中的同支细

7、菌内毒素标准品稀释成4个浓度 2（E0.5）、（E0.5）、0.5（E0.5）、0.25（E0.5）的含内毒素的供试品溶液。1mlBET 0.2mlE160 0.2mlE16 1.0ml E8 1.0mlE1 1.0mlE0.5 E160/支 E160 E16 E1.6 E1 E0.5 1.8ml S300 1.8ml S300 0.6ml S300 1.0ml S300 1.0ml S300 1.0mlE0.25 1.0E0.125 E0.25 E0.125E0.0625 1.0ml S3001.0ml S300注：每步稀释前被稀释液应置于旋涡混合仪上混合至少30 秒。7.2.4鲎试剂的准备

8、取规格为 0.1ml/支的鲎试剂 36支，轻弹壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，70%异丙醇棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。7.2.5加样（1）将准备好的规格为 0.1ml/支鲎试剂取其中 18支（管）放在试管架上，排成 5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的 4支4列每列每支分别加入 0.1ml的2.0（E0.5）、1.0（E0.25）、0.5（E0.125）、0.25（E0.0625）的内毒素标准溶液，另一列2支（管）加入0.1ml检查用水作为阴性对照。（2）将另外 18支（管）鲎试剂放在试管

9、架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的 4支4列每列每支分别加入 0.1ml的含2.0、1.0、0.5、0.25的内毒素的供试品溶液，另一列 2支（管）分别加入 0.1mlS300供试品溶液作为供试品对照。7.2.6加样结束后，轻轻振动混匀，避免产生气泡，放入371.0试管恒温器中，保温 602分钟后，观察并记录结果。7.2.7试验结果记录（阳性表示为“+”；阴性表示为“-”）：见附件干扰试验记录。7.2.8试验结果计算如两组最大浓度 2.0均为阳性，最低浓度 0.25均为阴性，阴性对照 4管均为阴性名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 5 页，共 9 页 -细菌内

10、毒素检测方法验证方案6/9 时，按下式计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（Es）和用供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值(Et)。Es=lg-1（Xs/4）Et=lg-1（Xt/4）式中：Xs、Xt分别为用检查用水和供试品溶液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（lg）。7.2.9结果判断及结论当 Es在 0.5 2.0（包括 0.5 和 2.0）时，且 Et在 0.5 Es2.0 Es（包括 0.5 Es和2.0 Es时，则认为供试品在该浓度下不干扰实验，可在该浓度下对此供试品进行细菌内毒素检查。试验记录及结论见附件干扰试验记录。8.异常情

11、况处理验证过程中，应严格按照岗位标准操作规程和验证方案进行操作，如出现偏差或检查结果不符合标准时应及时报告验证小组组长，验证小组组长组织人员进行讨论，确认是否影响产品质量和验证结果，如无影响可继续进行验证；如有影响应分析原因或调整方案后重新进行验证操作,调整方案后应经验证委员会批准，所有异常情况应在验证报告中予以描述说明。9.验证结果评价与结论验证管理员负责收集各项验证试验结果记录，验证小组组长进行综合评审，做出验证结论，确认验证周期。对验证结果的评审应包括：验证试验是否有遗漏，验证记录是否完整？验证试验过程中对验证方案有无修改？修改原因依据以及是否经过批准？验证试验结果是否符合要求？偏差及偏

12、差说明是否合理？是否需要进一步补充试验？起草好的相关SOP应同验证参数吻合，如出现偏差，应根据验证数据修订相关SOP。验证小组成员根据验证结果，确定该验证的再验证周期。10.附录附件：干扰试验记录名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 6 页，共 9 页 -细菌内毒素检测方法验证方案7/9 附件干扰试验记录检验项目：细菌内毒素检品名称批号样品来源检验目的取样日期检验日期检验依据中国药典2010 版二部附录XI E 细菌内毒素检验操作规程（SN-O08-F0061-XX）【细菌内毒素】标准规定：每1mg中含细菌内毒素的量应小于30EU。1.检验仪器及设备：设备名称设备型号设备编码校验有

13、效期至洁净工作台电热鼓风干燥箱试管恒温仪微型漩涡仪移液枪2.检验用材料、试剂及标准品名称生产厂家规格批号内毒素工作标准品细菌内毒素检查用水鲎试剂无热原吸头3.检验操作：3.1 鲎试剂复溶：鲎试剂灵敏度复核结果：EU/ml 配制：每支鲎试剂加入ml 细菌内毒素检查用水，复溶。名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 7 页，共 9 页 -细菌内毒素检测方法验证方案8/9 3.2 供试品稀释步骤：3.3 细菌内毒素溶液的配制：3.4含内毒素的供试品溶液的制备：3.5 加样：内毒素浓度（EU/ml）2.00.50.25供试品对照阴性对照1 内毒素标准溶液(ml)2 3 4 1 含供试品的内毒

14、素溶液(ml)2 3 4 3.6 检验结果记录：内毒素浓度（EU/ml）2.00.50.25供试品对照阴性对照反应终点浓度的对数值 X Es Et 1 内毒素标准溶液2 3 4 名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 8 页，共 9 页 -细菌内毒素检测方法验证方案9/9 1 含供试品的内毒素溶液2 3 4（备注：“+”表示阳性；“”表示阴性）3.7 检验结果计算：Es=lg-1（Xs/4）Et=lg-1（Xt/4）式中：Xs、Xt分别为用检查用水和供试品溶液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（lg）。3.8 结果判断：3.9 结论：注：本次试验异常情况。有无检验人/日期：复核人/日期：主管/日期：名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 9 页，共 9 页 -