2022年淀粉酶米氏常数的测定 .pdf

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1、实验二淀粉酶米氏常数的测定一、目的要求了解底物浓度与酶反应速度之间的关系，学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度（Vm）的测定原理和方法，测出淀粉酶在以对淀粉为底物时的Km 和Vm 值。二、原理酶促反应 v-S曲线推导出米氏方程为：其中S为底物浓度；v 为初速度；Vm 为最大反应速度；Km 为米氏常数。米氏常数 Km 是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏常数 Km 往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。测定 Km 和 Vm，可通过作图法求得。最常用的 Lineweaver-Burk 双倒数作图法。这个方法是将米氏方程转化为

2、倒数形式，即：SKSVvmmmmmVSVKv111名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 1 页，共 3 页 -以 1/v 对 1/S作图，可得一条直线，所得直线的截距是1/Vm，斜率为 Km/Vm。通过 Lineweaver-Burk 作图法作图后可方便的求出Km 值。三 实验材料、仪器和试剂1实验材料淀粉酶购自国药集团医药有限公司。精确称取酶制剂0.1g(以大约 2000 Ug计)，先用少量 40蒸馏水溶解、浸提。将上层液小心倾入500ml 容量瓶内，沉淀再加水捣研。如此重复，最后全部移入容量瓶中，定容后摇匀，用四层纱布过滤，滤液供测试定用。2仪器比色管，试管 25 mm200

3、mm，平头移液管(可用磨去尖头的 2mL 移液管制)；刻度吸管 5mI(X1)，移液管 20 mI；秒表，吸耳球(1)，电热恒温水浴锅，721型分光光度计。3试剂(1)原碘浓称取碘 11 g，碘化钾(KI)22 g，先用少量蒸馏水使碘碘化钾完全溶解，定容至 500 mL，贮于棕色瓶内。(2)稀碘液取原碘液 2mL，加碘化钾 20 g，用蒸馏水定容至500 mL贮于棕色瓶内。(3)4可溶性淀粉精确称取可溶性淀粉4.000g（精确至0.001g），用少量蒸馏水调匀。边搅拌边加入煮水70mL，加热煮沸至透明，冷却后定容至 100 mL,此溶液现配现用。名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第

4、 2 页，共 3 页 -(4)0.02mL pH 6.0 磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液称取磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)4523g 和柠檬酸(C6H8O7H2O)8.07g，用蒸馏水溶解定容至1000 mI用酸度计或 pH 试纸校正 pH。（5）0.1moL/L HCl 取 36%盐酸（饱和浓盐酸）0.43ml 加入已加有少量蒸馏水的50ml 容量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀即可。四操作方法1.淀粉浓度梯度标准曲线的制作2.Km 测定在不同底物(可溶性淀粉)浓度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%）的反应体系中 60反应 5min，测定酶的反应速度

5、V(以单位时间内吸光度的减少量 dAdt 来表示)，以 1v-vs的双倒数法作图，计算Km 值。在比色管中加入不同底物(可溶性淀粉)浓度（0.2%、0.6%、1.0%、1.4%、1.8%、2.0%）可溶性淀粉 20mL，缓冲液 5mL，摇匀后，在 60水浴中平衡 5 min，加入 1.0 mL稀释好的酶液，立即记时，充分摇匀，准确反应5 min，立即取出 1.00ml 反应液置入 12.0ml 的 0.1moL/L HCl 中终止反应，然后立即取出 1.00ml 溶液置于 5.00ml稀碘液显色，摇匀，并以稀碘液作对照，于660nm 处测定吸光度。3.数据处理各管在 722 分光光度计测定波长

6、660nm 的 OD 值(OD660nm)。从淀粉标准曲线上查出 OD660nm相当于底物淀粉的含量(g/mL),计算出各种底物浓度下的初速度vo（单位以 g mL-1min-1表示），取倒数 1/v 填入表内。以 1/v 对 1/S作图，求出淀粉酶催化淀粉水解的米氏常数Km 和最大反应速度 Vm。六、注意事项1.取液量一定要准确。2.反应时间一定要精确。3.加酶前后一定要将试剂混匀。4.空白对照一定要先加NaOH，后加酶。5.测定 OD405 时要以各自的空白调零点。6.移液管或取液器的使用7.比色杯的使用七、思考题(1)试说明米氏常数 Km 的物理意义和生物学意义。(2)为什么说米氏常数Km 是酶的一个特征常数而Vm 则不是？名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 3 页，共 3 页 -