植物基因克隆的工具酶课件.ppt
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1、关于植物基因克隆的工具酶第1页,此课件共74页哦基因工程中的工具酶:基因工程中的工具酶:应用于基因工程的各种应用于基因工程的各种酶的总称酶的总称,包括,包括核酸核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因选取序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因选取、重组、重组DNADNA制备制备等过程中所需要的酶。等过程中所需要的酶。第2页,此课件共74页哦第3页,此课件共74页哦一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别是一类能够识别双链双链DNA分子中的分子中的特定核特定核苷酸序列苷酸序列(4-8bp),并在识别序列内或附近),并在识别序列
2、内或附近特异特异切割双链切割双链DNA的核酸的核酸内切酶内切酶。限制酶天。限制酶天然存在于细菌体内。然存在于细菌体内。(Restriction endonuclease)第4页,此课件共74页哦(一)寄主控制的限制与修饰现象(一)寄主控制的限制与修饰现象(R/M体系)体系)任何物种都有排除异物保护自身的防御机制,如人的免任何物种都有排除异物保护自身的防御机制,如人的免疫系统和细菌的限制与修饰系统,即疫系统和细菌的限制与修饰系统,即限制酶与修饰酶限制酶与修饰酶组组成的系统。成的系统。早在早在20世纪世纪50年代初,有许多学者发现了限制与修饰现年代初,有许多学者发现了限制与修饰现象,当时被称作象,
3、当时被称作寄主控制的专一性寄主控制的专一性。噬菌体表现的现象便具有代表性和普遍性,其在噬菌体表现的现象便具有代表性和普遍性,其在不不同宿主中的转染频率同宿主中的转染频率可说明这一问题。可说明这一问题。第5页,此课件共74页哦这说明这说明K菌株和菌株和B菌株中存在一种限制系统,可排除菌株中存在一种限制系统,可排除外来的外来的DNA。10-4的存活率是由于宿主修饰系统作用的结果,此时的存活率是由于宿主修饰系统作用的结果,此时限制系统还未起作用。限制系统还未起作用。第6页,此课件共74页哦宿主控制限制(宿主控制限制(host-controlled restriction):菌体在某一株细菌的生长能力
4、在转移到另一株细菌宿菌体在某一株细菌的生长能力在转移到另一株细菌宿主时,要受到一定限制。主时,要受到一定限制。实际就是限制酶降解外源实际就是限制酶降解外源DNA,维护宿主遗传稳定的保护,维护宿主遗传稳定的保护机制。机制。第7页,此课件共74页哦宿主控制修饰(宿主控制修饰(host-controlled modification):用作繁殖噬菌体的用作繁殖噬菌体的感染宿主感染宿主并不会产生并不会产生DNADNA降解,这是因降解,这是因为它具有宿主控制性修饰的作用。为它具有宿主控制性修饰的作用。甲基化甲基化是常见的修饰作用,通过甲基化作用达到识别自身遗是常见的修饰作用,通过甲基化作用达到识别自身遗
5、传物质和外来遗传物质的目的。传物质和外来遗传物质的目的。如如 A A:N6-N6-甲基腺嘌呤;甲基腺嘌呤;C C:5-5-甲基胞嘧啶甲基胞嘧啶第8页,此课件共74页哦第9页,此课件共74页哦第10页,此课件共74页哦(二)限制酶的发现(二)限制酶的发现 20 世纪世纪 60 年代,人们就注意到年代,人们就注意到 DNA 在感染宿主后会被降解的现象,在感染宿主后会被降解的现象,从而提出限制性切酶和限制酶的概念。从而提出限制性切酶和限制酶的概念。1968 年,首次从年,首次从 E.coli K 中分离中分离到限制酶;到限制酶;1970 年,美国年,美国H.Smith 偶然发现,流感嗜血杆菌能迅速降
6、解外源的噬菌偶然发现,流感嗜血杆菌能迅速降解外源的噬菌体体 DNA,其细胞提取液可降解,其细胞提取液可降解 E.coli DNA,但不能降解自身,但不能降解自身 DNA,从,从而找到而找到 Hind 限制性内切酶限制性内切酶。从此以后,发现的限制酶越来越多,并且许多已经在实践中得到应用。从此以后,发现的限制酶越来越多,并且许多已经在实践中得到应用。EcoR是应用最是应用最广泛的限制性内切酶,酶切位点和切割位点如下:广泛的限制性内切酶,酶切位点和切割位点如下:5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5第11页,此课件共74页哦据统计:据统计:n1986年:年:615种限制酶,种限制酶,98种甲基
7、化酶种甲基化酶n1998年:年:1000种细菌或古细菌中存在种细菌或古细菌中存在3000多种酶,且多种酶,且200多种特异性。多种特异性。n2006年:年:4583种酶,其中限制酶种酶,其中限制酶3773种,种,第12页,此课件共74页哦命名原则:命名原则:第一个字母(大写第一个字母(大写,斜体):斜体):该酶来源的微生物属名;该酶来源的微生物属名;第二、第三个字母(小写、斜体):第二、第三个字母(小写、斜体):微生物的种名;微生物的种名;若该微生物有不同的变种和品系,再加上该变种和品系的若该微生物有不同的变种和品系,再加上该变种和品系的第一个字母第一个字母(大写)(大写)若从同一微生物发现多
8、种限制性内切酶,则依照发现和分离的先后顺序用若从同一微生物发现多种限制性内切酶,则依照发现和分离的先后顺序用罗马罗马字母表示字母表示。总之:限制酶由三部分构成(菌种名、菌系编号、分离顺序)总之:限制酶由三部分构成(菌种名、菌系编号、分离顺序)(三)限制性内切酶的命名(三)限制性内切酶的命名1973年年Smith和和Nathans提出有关限制酶命名规则的建议提出有关限制酶命名规则的建议第13页,此课件共74页哦n例如:例如:Hind前三个字母来自于菌种名称前三个字母来自于菌种名称H.influenzae,“”表示菌系为型血清型;表示菌系为型血清型;“”表示分离到的第表示分离到的第三个限制酶。三个
9、限制酶。nEcoRIEscherichia coli RI nHindHaemophilus influensae d nSacI(II)Streptomyces achromagenes I()(三)限制性内切酶的命名(三)限制性内切酶的命名第14页,此课件共74页哦举举 例例EcoR IEscherichia属名属名Coli种类种类Ry13株系株系编号编号 若种名头若种名头2 2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。字母。第15页,此课件共74页哦 限制酶的生物学功能一般是限制酶的生物学功能一般是保护宿主不受外来保护宿主不受外来DNA的感
10、的感染染,可降解外来的,可降解外来的DNA,从而阻止其复制和整合到细胞中。,从而阻止其复制和整合到细胞中。一般来说,与一般来说,与限制酶伴生的修饰酶是甲基转移酶限制酶伴生的修饰酶是甲基转移酶,能保护自,能保护自身的身的DNA不被降解。它们与对应的限制酶识别相同的序列,但不被降解。它们与对应的限制酶识别相同的序列,但其作用不是切割其作用不是切割DNA,而是在两条链上对某个碱基进行甲,而是在两条链上对某个碱基进行甲基化。限制酶和甲基转移组成限制和修饰系统。基化。限制酶和甲基转移组成限制和修饰系统。(四)限制性内切酶的种类(四)限制性内切酶的种类第16页,此课件共74页哦I:能识别专一的核苷酸顺序,
11、并在识别点附近的一些核苷酸上切割能识别专一的核苷酸顺序,并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子双链,但它随机切割核苷酸的顺序,无专一性。分子双链,但它随机切割核苷酸的顺序,无专一性。:能识别专一的核苷酸顺序,并在该顺序内的能识别专一的核苷酸顺序,并在该顺序内的固定位置固定位置上切割双上切割双链。这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的,链。这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的,这种限制这种限制性内切酶是性内切酶是DNA重组技术中常用的工具酶。重组技术中常用的工具酶。:也有专一的识别顺序,但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几也有专一的识别顺序,但不是对称的回文顺序,在识别顺
12、序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链,但这几个核苷酸不是特异性的。这个核苷酸对的固定位置上切割双链,但这几个核苷酸不是特异性的。这种限制性内切酶切割后产生的一定长度种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段,具有各种单链末端。片段,具有各种单链末端。(四)限制性内切酶的种类(四)限制性内切酶的种类第17页,此课件共74页哦性质性质酶酶酶酶酶酶结构与功能结构与功能三亚基多功能酶三亚基多功能酶单一功能的酶单一功能的酶二亚基双功能的酶二亚基双功能的酶限制与修饰限制与修饰酶蛋白酶蛋白同时同时具有甲基具有甲基化作用化作用酶蛋白酶蛋白不不具有甲基化具有甲基化作用作用酶蛋白酶蛋白同时同时具有甲具有甲基化
13、作用基化作用限制作用的辅限制作用的辅助因子助因子ATP,MgATP,Mg2+2+,SAM,SAMMgMg2+2+ATP,MgATP,Mg2+2+,SAM,SAM寄主特异性位寄主特异性位点序列点序列特异性特异性,非对称非对称序列序列特异性特异性,旋转对称旋转对称序列序列特异性特异性,非对称非对称序列序列切割位点切割位点在距寄主特异性位点在距寄主特异性位点至少至少1kb1kb的地方的地方位于寄主位于寄主特异性位点特异性位点或或其附近其附近在距寄主在距寄主特异性位特异性位点点3 3 端端2426bp2426bp处处切割方式切割方式随机随机切割切割特异特异切割切割特异特异切割切割甲基化作用位甲基化作用
14、位点点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点在在DNADNA克隆中克隆中的用途的用途无无十分有用十分有用有用有用表表2-1 限制性内切酶的类型及其主要特征限制性内切酶的类型及其主要特征第18页,此课件共74页哦 限制性内切酶以双链限制性内切酶以双链DNADNA为底物,识别特定的核为底物,识别特定的核苷酸序列,切断特定位置的磷酸二酯链,产生具有苷酸序列,切断特定位置的磷酸二酯链,产生具有3-OH3-OH和和5-P5-P的的DNADNA片段。片段。(五)限制性内切酶作用机制(五)限制性内切酶作用机制第19页,此课件共74页哦限制性内切酶作用
15、过程限制性内切酶作用过程第20页,此课件共74页哦(六)限制性内切酶的识别与切割(六)限制性内切酶的识别与切割1.1.在在DNADNA分子双链的特异性识别序列部位切割分子双链的特异性识别序列部位切割DNADNA分子产分子产生链的断裂生链的断裂2.2.识别由识别由4-84-8个(多数个(多数4-64-6个)个)核苷酸组成的特定的核苷酸核苷酸组成的特定的核苷酸序列序列3.3.识别碱基对的顺序呈识别碱基对的顺序呈回文结构回文结构(PalindromicPalindromic),切点),切点就在其内部。就在其内部。识识 别别第21页,此课件共74页哦第22页,此课件共74页哦回文结构(回文结构(Pal
16、indromic)A B C C B AA B C C B AA B N B AA B N B A大多数识别位点具有大多数识别位点具有180180度旋转对称的结构形式,即这度旋转对称的结构形式,即这些核苷酸对的顺序是回文结构。些核苷酸对的顺序是回文结构。第23页,此课件共74页哦 限制性内切酶切断限制性内切酶切断DNA链上链上磷酸二酯键磷酸二酯键的位置一般的位置一般在识别序列内部,在识别序列内部,如如GGATCC,ATCGAT;也有少数在识别序列的两端也有少数在识别序列的两端 如如GATC,CATG。切切 割割注意:注意:环状环状DNA分子上,若某种限制性内切酶有分子上,若某种限制性内切酶有n
17、个个识别序列,识别序列,则完全切割后可获得则完全切割后可获得n个片段个片段。线状线状DNA分子,若某种限制性内切酶有分子,若某种限制性内切酶有n个识别序列个识别序列,则完全切割后可获得则完全切割后可获得n+1个片段个片段。第24页,此课件共74页哦几种几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点型限制性核酸内切酶的酶切位点Pst IProvindencia stuartii 164 CTGCAGGACGTCHaemophilus influenzae Rd 第25页,此课件共74页哦EcoR IPst I5 C T G C A G33 G A C G T C.5不同核酸内切酶的特异识别位点不同核酸内切
18、酶的特异识别位点5 G A A T T C 33 C T T A A G 5第26页,此课件共74页哦A A G C T TT T C G A A A A G C T TT T C G A A DNAABCDDNAHindHind切割位点切割位点核酸内切酶Hind对双链DNA分子的切割作用第27页,此课件共74页哦酶生物来源识别序列黏/平末端EcoR I大肠杆菌GAATTC黏末端BamH I淀粉芽孢杆菌GCATCC黏末端Bal II枯草芽孢杆菌AGATCT黏末端Pvu I普通变形菌CGATCG黏末端Pvu II普通变形菌CAGCTG平末端Hind III流感嗜血杆菌RdAAGCCT黏末端Hin
19、f I流感嗜血杆菌RfGANTC黏末端Sau3 A金黄色葡萄球菌GATC黏末端Alu I藤黄节杆菌AGCT平末端Taq I水声栖热菌TCGA黏末端Hae III埃及嗜血菌GGCC平末端Not I豚鼠耳炎诺卡氏菌GCGGCCGC黏末端Sfi I镶边链霉菌GGCCNNNNNGGCC黏末端最常用的限制性内切酶的识别序列最常用的限制性内切酶的识别序列第28页,此课件共74页哦切切割割方方式式平头末端(平头末端(blunt end or flush end)经酶切所形成的末端具有经酶切所形成的末端具有互补碱基对完好互补碱基对完好的末端的末端,称为,称为平头末端平头末端。第29页,此课件共74页哦粘性末端
20、(粘性末端(cohesive endcohesive end)切切割割方方式式 大多数大多数型限制性内切酶结合并切割的型限制性内切酶结合并切割的DNADNA序列是一种序列是一种回文序列回文序列,经切割一端产生,经切割一端产生5 5-磷酸磷酸突出的末端,另一端产生突出的末端,另一端产生3 3-OH-OH突出突出的末端,即的末端,即DNADNA片段双链的片段双链的两个末端两个末端含有几个含有几个等长核苷酸碱基互补配对等长核苷酸碱基互补配对的单链末端,称为的单链末端,称为粘粘性末端性末端。第30页,此课件共74页哦第31页,此课件共74页哦部部分分常常用用的的限限制制性性内内切切酶酶第32页,此课件
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