2022年生物工程下游技术复习总结 .pdf

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1、学习好资料欢迎下载2013生物工程下游技术复习1、2、常用酶蛋白的提取、分离与制备方法：溶解度：改变离子强度，pH,温度，介电常数电荷极性：离子交换层析，色谱聚焦电泳等电聚焦大小或重量：离心分离，透析超滤凝胶过滤亲和层析：染料配体亲合层析免疫吸附层析共价层析3、拟选用紫外可见分光光度计直接测定细菌铁蛋白的特征吸收峰(波长：414,525,550nm),拟选用石英比色杯或玻璃比色杯，是否合适？参考答案：均合适名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 1 页，共 6 页 -学习好资料欢迎下载4、简要叙述 3-5 种定量分析蛋白质的常见方法参考答案：考马斯亮蓝法；Folin 酚法；紫外吸法；

2、双缩脲法5、选用考马斯亮蓝G-250法定量分析蛋白质含量时，已知蛋白质-考马斯亮蓝复合物为蓝色溶液。根据题意，最佳测定波长是：参考答案：595 nm 蛋白质的分离与纯化的方法：6、等电点 分离与纯化根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白质解离成两性离子，其净电荷为零，此时环境的pH值即为该蛋白质的等电点。在等电点时蛋白质性质比较稳定，其物理性质如导电性、溶解度、粘度、渗透压等皆最小，因此可以利用蛋白质等电点时溶解度最小的特性来制备或沉淀蛋白质。（利用蛋白质等电点沉淀混合蛋白体系中的目标蛋白）7、根据蛋白质 分子形状和大小 的不同来纯化蛋白质蛋白质的一个主要特点是分子大，而且不同种类的蛋白质分子大小也

3、不相等。由此可以用凝胶过滤法，超滤法、离心法及透析法等将蛋白质与其它小分子物质分离，也可将大小不同的蛋白质分离。（存在的问题：纯度不够）8、根据蛋白质 溶解度 的不同来纯化蛋白质蛋白质的溶解度受溶液的pH、离子强度、溶剂的电解质性质及温度等多种因素的影响。在同一特定条件下，不同的蛋白质有不同的溶解度，达到分离的目的。盐溶与盐析，结晶，低温有机溶剂沉淀法（通过控制有机溶剂的溶度）。9、根据蛋白质 电离性质 的不同来纯化蛋白质离子交换剂作为一种固定相，本身具有正离子或负离子基团，它对溶液中不同的带电物质呈现不同的亲和力，从而使这些物质分离提纯。蛋白质、多肽或氨基酸具有能够离子化的基团。对蛋白质的离

4、子交换层析，一般多用离子交换纤维和以葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶为骨架的离子交换剂。主要是取得其有较大的蛋白质吸附容量、较高的流速和分辨力。10、根据蛋白质 疏水基团 与相应的载体基团 结合来纯化蛋白质蛋白质上有疏水区，它们主要由酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等非极性的侧链密集在一起，并暴露于分子表面。这些疏水区能够与吸附剂上的疏水性基团结合，在通过降低介质的离子强度和极性等方法将蛋白质洗脱下来。11、根据 蛋白质在溶剂系统中分配的不同来纯化蛋白质逆流分配色谱分配常数是以相同分子形态(相对分子质量相同)存在于两相中的溶质浓度之比，但在多数情况，溶质在各相中并非以同一种分子

5、形态存在，特别是在化学萃取中。因此，萃取过程中常用溶质在两相中的总浓度之比表示溶质的分配平衡，该比值称为分配系数(distribution coefficient)或分配比(distribution ratio)12、根据蛋白质受物理、化学等作用因素的影响来纯化蛋白质。蛋白质易受 pH、温度、酸碱、金属离子、蛋白质沉淀剂，络合剂等的影响，用于各种蛋白质都存在差异，可利用这种差异来分离纯化蛋白质。（例如：动物肝脏铁蛋白理化特性:pH210 不变性;70 不变性,25%硫酸铵沉淀）13、根据蛋白质的 选择性吸附性质 来纯化蛋白质在蛋白质分离中，最广泛使用的吸附剂有结晶磷酸钙，磷酸钙凝胶，硅胶，皂土

6、、沸石、硅藻土、活性白土、氧化铝以及活性炭等。（廉价降低成本）名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 2 页，共 6 页 -学习好资料欢迎下载14、根据酶对蛋白质的作用来纯化蛋白质例子：SOD 酶抗蛋白水解酶15、几种离心的方法：差速离心，分辨率较低，仅适用于粗提或浓缩。速率区带法，如离心时间太长所有的物质都会沉淀下来，故需选择最佳分离时间，可得到相当纯的亚细胞成分用于进一步纯化，避免了差速离心中大小组分一起沉淀的问题，但容量较小，只能用于 少量制备。（分子大小差异不显著的组分）等密度梯度离心 常用的主要分离介质有蔗糖、聚蔗糖、氯化铯、溴化钾、碘化钠等等。是按细胞组分的浮力密度不同进

7、行分离的方法。适用于大小、形态相似而密度不同的组分。常将样品通过高浓度的蔗糖或氯化铯的密度梯度沉降在达到与自身密度相等的位置就停滞不再向下沉降。此方法直接证明了DNA 的不保留复制。16、可逆性缔合在某些溶液条件下，有一些酶能聚合成二聚体、四聚体等，而在另一种条件下则形成单体，如相继在这两种不同的条件下按大小就可以进行分级分离。（举例:胰岛素与锌离子形成多聚体）17、泡沫分离泡沫分离过程是利用待分离物质本身具有表面活性(如表面活性剂)或能与表面活性剂通过化学的、物理的力结合在一起(如金属离子、有机化合物、蛋白质和酶等)，在鼓泡塔中被吸附在气泡表面，得以富集，藉气泡上升带出溶剂主体，达到净化主体

8、液、浓缩待分离物质的目的。可见它的分离作用主要取决于组分在气液界面上吸附的选择性和程度，其本质是各种物质在溶液中表面活性的差异。18、离子对色谱将与被分析离子带相反电荷的离子(配对离子或反离子)加到流动相中，与溶质离子结合形成弱极性离子对，此离子对在流动相中不易离解而迅速转移到键合相中，进而在固定相和流动相间进行分配，最终实现分离的一种色谱模式。19、凝胶过滤大的蛋白质分子被凝胶颗粒排斥，因而在颗粒外移动，速度快。小的蛋白质分子则进入凝胶颗粒的小孔径内，路径加长，移动速度慢。Sephadex G系列 Bio-Gel系列 Sepharose 系列20、蛋白质复性1）a.机械破碎（高压匀浆，高速珠

9、磨法）b.离心法提取出包含体c.加变性剂溶解 d.除变性剂复性。2）机械破碎膜分离可溶性蛋白变性溶解包含体除变性剂复性。3）化学破碎（加变性剂）离心除细胞碎片出除变性剂复性。第三章 凝胶过滤分离技术1、凝胶过滤分子筛名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 3 页，共 6 页 -学习好资料欢迎下载作用原理：相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，移动速度快；所以首先流出。相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，移动速率慢；所以最后流出。中等大小的分子，它们

10、在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。（凝胶层析：可用于重组蛋白溶液脱盐（一般常用的是Sephadex G-25，另外还有 Bio-Gel P-6 DG或 Ultragel AcA 202等排阻极限较小的凝胶类型），分子量测定以及分离纯化、多肽、多糖（目前常用于多糖纯度的鉴定方法有:凝胶层析法、电泳法、色谱法、旋光度法等.）、核酸、蛋白质、病毒、细胞等的分离纯化，此外，还广泛应用于生物样品的除盐和缓冲液的交换。广泛用

11、于蛋白质（包括酶）、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。）2、离子交换法：流速快，适用于小分子物质的交换，容量大，因而适用于氨基酸，核苷酸等分子生化物质分离纯化。一般而言，酸性物质用阴离子交换剂分离，碱性用阳离子交换分离。氨基酸、核苷酸、蛋白质等两性电解质，可根据其pl 值及离子化曲线来选择。名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 4 页，共 6 页 -学习好资料欢迎下载电泳分离技术原理：带电离子的迁移小分子，生物大分子，蛋白质，核酸，病毒颗粒，细胞器等等。不同等电点的 AA在电解质中所带的电荷不一样。pHpI 时，蛋白质分子释放出H+，

12、而使蛋白壳带负电，向正极方向移动。当pHpI 时，其结果相反。醋酸纤维素薄层电泳：比滤纸相好，精准度高，快，灵敏度高，用量少，应用面广。与聚丙烯酰胺相比：操作简单，分离效果不太好。例如血清蛋白在前者分离只有6 条带，而后者有10 条带。但该方法被广泛应用与医学临床相关疾病的诊断（适用于病理情况下微量异常蛋白的检测）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：重复性好，机械强度好，利于各种处理；无电渗作用；设备简单，样品用量少，分辨率高，用途：蛋白质，多肽，核酸等生物大分子的分离）分离的简要原理:由于蛋白质 SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由

13、于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后。SDS-PAGE 常用于定性分析蛋白质的电泳方法但是要注意：有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在 SDS 和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，与 SDS-凝胶电泳的结果互相参照。不是所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量，已发现有些蛋白质

14、用这种方法测出的分子量是不可靠的。这些蛋白质有：电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。变性梯度凝胶电泳DGGE 双链 DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的DNA 片段能够被区分开.如果同样长度的 DNA 片段在胶中的迁移行为一样，不能被区分。DGGE/T(温度)GGE 技术在 PAGE 基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的 DNA 片段区分开来。可以直接测定天然状态蛋白质的分子量而不需要解离为亚基，因此这一方法可以与 SDS-PAGE 测定分子量的方法互

15、为补充注意：如果不同 DNA 片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来。在 DNA 片段的一端加入一段富含GC 的 DNA 片段（GC 夹子，一般 30-50 个碱基对）可以解决这个问题。含有 GC 夹子的 DNA 片段最高的解链区域在GC 夹子这一段序列处，它的解链浓度很高，可以防止 DNA 片段在 DGGE 胶中完全解链。当加了GC 夹子后，DNA 片段中基本上每个碱基处的序列差异都能被区分开。聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳IEF 原理：利用有 pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可达0.01pH 单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋

16、白质组分。一维固相 pH梯度等电聚焦（IEF with IPG）根据公布的配方计算后，将适宜的 IPG试剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透作用，因而可以进行特别稳定的IEF 分离达到真正的平衡状态。常用的 pH梯度支持介质:名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 5 页，共 6 页 -学习好资料欢迎下载聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等，其中聚丙烯酰胺凝胶为最常应用双向凝胶电泳分离技术2-DE(双向凝胶电泳)技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术。低丰度蛋

17、白的分离：尽管增加上样量和提高总蛋白的溶解度能增加分离时的低丰度蛋白的量，但同时增加了高丰度蛋白的负荷，且造成蛋白的叠加效应而影响分离。解决方法:(1)常用预分级窄 pH胶的微制备技术进行分离,即将总蛋白组分成蛋白质组亚群.(2)再用 pH梯度小于 2 个 pH单位的分离胶进行窄pH范围的分离。强碱性蛋白质（如核糖体）的处理：(1)先将蛋白预处理以富集.(2)再用特殊 pH梯度的 IPG胶条（如 pH3 12、4-12 或 10-12）进行等电聚焦。其中窄范围碱性 IPG胶（如 pH10-12）是克服反向、阴极向阳极、电渗流和水平条纹现象，而宽范围的碱性 IPG胶（如 pH3-12、4-12）

18、等消除了窄范围胶所需要的专门水化液。分离胶 IEF 中 pH梯度的选择（老师上课经常讲的）常用方法：先宽后窄，先线性后非线性，先短后长，预试验确定。核酸电泳分离技术琼脂糖凝胶用于 DNA 和 RNA 的常规分析聚丙烯酰胺凝胶常用于小分子核酸分析DNA 琼脂糖凝胶：核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系。DNA分子大小：小分子的 DNA 迁移速度比大分子DNA快。DNA 迁移速度与其分子量的对数成反比，当分子量超过20kb 时，电泳的迁移速度不再依赖与分子大小。琼脂糖浓度：凝胶浓度大，待分析DNA分子量小反相 HPLC 分离技术（高效液相色谱分离技术）亲合层析分离技术常用的配位体：1)三嗪染色剂，用于蛋白质的纯化；2）酶的底物或偶联因子，用于特定酶的纯化；3）抗体，用于相应的抗原；4）蛋白质 A，用于 IgG 抗体的纯化；5）单链寡核苷酸，用于互补的核酸如 mRNA，或特定的单链 DNA 序列；6）凝集素，用于特定的单糖亚基。名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 6 页，共 6 页 -