实验生物显微制片技术讲稿.ppt

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1、关于实验生物显微制片技术第一页，讲稿共二十五页哦实验目的与要求1.理解石蜡切片法各主要步骤的基本原理。理解石蜡切片法各主要步骤的基本原理。2.掌握各种试剂的配制和各种器材的使用方掌握各种试剂的配制和各种器材的使用方法。法。3.掌握石蜡切片法的具体操作方法。掌握石蜡切片法的具体操作方法。4.熟悉实验过程中应注意的事项。熟悉实验过程中应注意的事项。5.自己取材，植物、动物材料制备标本片。自己取材，植物、动物材料制备标本片。6.通过在显微镜下观察鱼肝细胞染色玻片标通过在显微镜下观察鱼肝细胞染色玻片标本，了解鱼肝细胞的显微结构。本，了解鱼肝细胞的显微结构。第二页，讲稿共二十五页哦生物制片技术概述生物制

2、片技术概述 生物显微制片技术是观察研究细胞、组织、生物显微制片技术是观察研究细胞、组织、胚胎、动物等的形态、结构及病理变化的重胚胎、动物等的形态、结构及病理变化的重要方法。由于生活时的生物体器官组织过大要方法。由于生活时的生物体器官组织过大或过厚不能在光学显微镜下观察，或者能放或过厚不能在光学显微镜下观察，或者能放在光学显微镜下，光线也不能透过，而且一在光学显微镜下，光线也不能透过，而且一些微细结构的折光率相同，即使光线能够透些微细结构的折光率相同，即使光线能够透过也看不清楚。因此，就必须运用显微技术过也看不清楚。因此，就必须运用显微技术中各种方法将其制成玻片标本，使组织细胞中各种方法将其制成

3、玻片标本，使组织细胞既能在光学显微镜下观察又可长期保存，结既能在光学显微镜下观察又可长期保存，结构对比变明显。一般可分为切片法和非切片构对比变明显。一般可分为切片法和非切片法两类制片方法。法两类制片方法。第三页，讲稿共二十五页哦 切片法：石蜡切片法；火棉胶切片法；冰切片法：石蜡切片法；火棉胶切片法；冰冻切片法等。冻切片法等。非切片法：包括整体封藏法；涂布法；非切片法：包括整体封藏法；涂布法；压片法，此外还有铺片、磨片等。压片法，此外还有铺片、磨片等。显微制片需经历一系列操作，相当细致而显微制片需经历一系列操作，相当细致而复杂，每一步骤的失误都可导致整体的失复杂，每一步骤的失误都可导致整体的失败

4、，因此需要耐心细致，手脑并用。败，因此需要耐心细致，手脑并用。切片法：取材切片法：取材固定固定冲洗冲洗脱水脱水透明透明包埋包埋切片切片染色染色脱水脱水透明透明封藏。封藏。非切片法：取材非切片法：取材固定固定冲洗冲洗脱水脱水透明透明染色染色脱水脱水 透明透明封藏封藏第四页，讲稿共二十五页哦切片法与非切片法比较切片法与非切片法比较切片法能显示出组织、细胞内部的微细结构切片法能显示出组织、细胞内部的微细结构,且对比非常明显清且对比非常明显清晰。但操作步骤多晰。但操作步骤多,手续复杂手续复杂,制片速度慢制片速度慢,耗时较长。耗时较长。如洋葱根尖纵切片中对线粒体、有丝分裂的观察如洋葱根尖纵切片中对线粒体

5、、有丝分裂的观察;小麦叶片横小麦叶片横切和玉米叶横切中对细胞木质化细胞质、纤维素细胞质的观察。切和玉米叶横切中对细胞木质化细胞质、纤维素细胞质的观察。切片法是生物显微制片技术中最常用和最主要的方法切片法是生物显微制片技术中最常用和最主要的方法,其中又以其中又以石蜡切片法最为重要。石蜡切片法最为重要。非切片法能保持生物体或某部分器官组织的原有状态及其完整非切片法能保持生物体或某部分器官组织的原有状态及其完整性性,但因不经过切片手续但因不经过切片手续,不仅不能清晰地显示各器官组织之间的相不仅不能清晰地显示各器官组织之间的相互关系互关系,更无法显示组织和细胞之间的结构关系。更无法显示组织和细胞之间的

6、结构关系。非切片法中整体切片法仅能对很小的材料制片非切片法中整体切片法仅能对很小的材料制片,如人体口腔上皮如人体口腔上皮装片装片,草履虫装片。涂片法仅对含有大量水分或完全为液体的组织或草履虫装片。涂片法仅对含有大量水分或完全为液体的组织或器官适用。器官适用。第五页，讲稿共二十五页哦1 非切片法非切片法1.1 1.1 涂片法涂片法 主要用于血液、精液、尿液、微生物液体培养物主要用于血液、精液、尿液、微生物液体培养物等不能用切片法制成薄片的液态颗粒性材料，可在载等不能用切片法制成薄片的液态颗粒性材料，可在载玻片上涂成单层细胞，还可再经固定，脱水，染色等玻片上涂成单层细胞，还可再经固定，脱水，染色等

7、手段制成永久标本。手段制成永久标本。1.2 1.2 铺片法铺片法 主要用于动、植物组织的表皮层观察，可活体主要用于动、植物组织的表皮层观察，可活体取待观察动、植物组织，用尖镊子撕去一层表皮，取待观察动、植物组织，用尖镊子撕去一层表皮，迅速平铺在载玻片上。迅速平铺在载玻片上。如如:洋葱表皮细胞的铺片制洋葱表皮细胞的铺片制备。备。第六页，讲稿共二十五页哦1.3 1.3 压片法压片法 一些较幼嫩，柔软的材料可将其置载玻片上，用小解一些较幼嫩，柔软的材料可将其置载玻片上，用小解剖刀将其分散，加染料一滴，再盖上盖玻片，用拇指垂剖刀将其分散，加染料一滴，再盖上盖玻片，用拇指垂直用力挤压，使组织散成一薄片，

8、再进行观察，如植物直用力挤压，使组织散成一薄片，再进行观察，如植物根尖压片观察染色体。根尖压片观察染色体。1.4 1.4 磨片磨片 用于质地坚硬的组织，如骨和牙。用于质地坚硬的组织，如骨和牙。1.5 1.5 离析法离析法 此法是利用化学试剂使组织的细胞间质溶解，使组此法是利用化学试剂使组织的细胞间质溶解，使组织分散成单个游离细胞。如植物去壁低渗法制备染色织分散成单个游离细胞。如植物去壁低渗法制备染色体标本。体标本。第七页，讲稿共二十五页哦2 2 切片法切片法切片是供光学显微镜或电子显微镜观察的切片是供光学显微镜或电子显微镜观察的动植物组织薄片。动植物组织薄片。切片法是通过手工或切片机将组织切成

9、薄切片法是通过手工或切片机将组织切成薄片来进行观察的方法。需先经过一系列步骤片来进行观察的方法。需先经过一系列步骤将组织内渗入某些支持物质，使组织变硬以将组织内渗入某些支持物质，使组织变硬以利于切成薄片，根据所用支持剂的种类不同，利于切成薄片，根据所用支持剂的种类不同，可分为可分为徒手切片法，石蜡切片法，火棉胶切徒手切片法，石蜡切片法，火棉胶切法，冰冻切片法法，冰冻切片法等类型，切成薄片后还需要等类型，切成薄片后还需要去蜡，染色，脱水，透明等步骤。去蜡，染色，脱水，透明等步骤。第八页，讲稿共二十五页哦2.1 2.1 石蜡切片法石蜡切片法石蜡切片法包括以下各主要步骤：取材固定洗涤和脱水透明浸蜡包

10、埋切片与粘片脱蜡染色脱水透明封片等步骤。一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，标本片可以长期保存使用。第九页，讲稿共二十五页哦详细步骤和各个环节要求详细步骤和各个环节要求取材：材料必须取材：材料必须新鲜、完整新鲜、完整，搁置时间过久则产生蛋白，搁置时间过久则产生蛋白质分解变性，导致细胞自溶及细菌的滋生，且质分解变性，导致细胞自溶及细菌的滋生，且避免挤压、避免挤压、挫伤挫伤而不能反映组织活体时的形态结构。而不能反映组织活体时的形态结构。注明采集时注明采集时间、地点、名称、组织部位等。组织块大小以间、地点、名称、组织部位等。组织块大小以0.50.50.50.50.2cm0.2cm为宜。为

11、宜。固定：用化学药液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固固定：用化学药液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时保持其活体时的结构的结构。此外固定还有使组织。此外固定还有使组织硬化作用，硬化作用，助染作用助染作用。此外还有物理方法如此外还有物理方法如干燥、高热和低温骤冷等方法固干燥、高热和低温骤冷等方法固定。定。第十页，讲稿共二十五页哦洗涤与脱水：洗涤与脱水：洗涤：固定后的组织材料需除去留在组织内的固定洗涤：固定后的组织材料需除

12、去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，以免影响以后的染色效果。多以流水液及其结晶沉淀，以免影响以后的染色效果。多以流水冲洗。冲洗。脱水：洗涤后的组织内充满水分，需除去水分方可进脱水：洗涤后的组织内充满水分，需除去水分方可进行之后的透明、浸蜡与包埋。脱水用一种既能与水又能与行之后的透明、浸蜡与包埋。脱水用一种既能与水又能与透明剂混溶的液体来逐渐置换样品中游离的水。脱水剂常透明剂混溶的液体来逐渐置换样品中游离的水。脱水剂常采用乙醇或丙酮、采用乙醇或丙酮、正丁醇、叔丁醇正丁醇、叔丁醇进行梯度脱水。每次时进行梯度脱水。每次时间为间为1 1数小时。数小时。脱水的过程：通常从脱水的过程：通常从3030或或50

13、50乙醇开始，一般是乙醇开始，一般是30%30%乙醇乙醇50%50%乙醇乙醇70%70%乙醇乙醇80%90%100%100%80%90%100%100%脱水剂浓度不应跨度太大，以免引起组织强烈的收缩脱水剂浓度不应跨度太大，以免引起组织强烈的收缩或变形。或变形。第十一页，讲稿共二十五页哦 透明透明 透明是用一种既能与脱水剂（乙醇）又能与包埋介质透明是用一种既能与脱水剂（乙醇）又能与包埋介质（石蜡）互溶的液体来置换样品中的脱水剂（乙醇），从（石蜡）互溶的液体来置换样品中的脱水剂（乙醇），从而为最终的包埋创造一个有利的条件。而为最终的包埋创造一个有利的条件。现采用的透明剂现采用的透明剂一般是二甲苯，

14、甲苯，氯仿、香柏油等。一般是二甲苯，甲苯，氯仿、香柏油等。一般过程为：一般过程为：1/31/3二甲苯二甲苯+2/3+2/3乙醇混合液乙醇混合液1/21/2二二甲苯甲苯+1/2+1/2乙醇混合液乙醇混合液2/32/3二甲苯二甲苯+1/3+1/3乙醇混合液乙醇混合液二甲二甲苯苯二甲苯二甲苯 二甲苯是使用最广泛的一种透明剂，渗透力强，溶蜡量二甲苯是使用最广泛的一种透明剂，渗透力强，溶蜡量大，易挥发，缺点是易使组织收缩，变硬，变脆。大，易挥发，缺点是易使组织收缩，变硬，变脆。第十二页，讲稿共二十五页哦浸蜡浸蜡 将完成透明步骤的组织块浸入透明剂与石蜡混合将完成透明步骤的组织块浸入透明剂与石蜡混合液中，梯

15、度提高石蜡的比例，直至用石蜡完全置换组液中，梯度提高石蜡的比例，直至用石蜡完全置换组织块中的透明剂，便于之后的包理与切片。织块中的透明剂，便于之后的包理与切片。浸蜡要在温箱（浸蜡要在温箱（6060，液态石蜡）中进行，每级液态石蜡）中进行，每级1-1-3h3h。包埋包埋 样品浸蜡后，内部间隙已完全被石蜡占据，接着样品浸蜡后，内部间隙已完全被石蜡占据，接着还需要用同种硬度的石蜡包埋成蜡块以便切片。用镊还需要用同种硬度的石蜡包埋成蜡块以便切片。用镊子轻轻将浸蜡后的组织块夹入盛有液态石蜡的纸盒，子轻轻将浸蜡后的组织块夹入盛有液态石蜡的纸盒，摆好位置，待石蜡冷却成固态即包埋完毕。可同时包摆好位置，待石蜡

16、冷却成固态即包埋完毕。可同时包埋多块组织。埋多块组织。至此，组织材料的前处理过程已完成，可用于切片。至此，组织材料的前处理过程已完成，可用于切片。第十三页，讲稿共二十五页哦切片切片修块：切片前需修整蜡块，先将大块蜡块切开，使每一小块都修块：切片前需修整蜡块，先将大块蜡块切开，使每一小块都含有一块组织，再修整成正方体或长方体，从切面看组织含有一块组织，再修整成正方体或长方体，从切面看组织周围的石蜡厚度相等周围的石蜡厚度相等(3mm)(3mm)。固着：将修好的蜡块粘在大小适宜的样品台（台木）上，以便固着：将修好的蜡块粘在大小适宜的样品台（台木）上，以便于固定在切片机上。于固定在切片机上。切片：调整

17、切片机刀片位置与台木上的蜡面平行切片：调整切片机刀片位置与台木上的蜡面平行。一手持毛。一手持毛笔，一手转动切片机，切下的蜡片连成一长条蜡带。切下笔，一手转动切片机，切下的蜡片连成一长条蜡带。切下的蜡带根据需要切成数段，放在的蜡带根据需要切成数段，放在4040水面上。水面上。贴片：蜡带分别用粘片剂（蛋白甘油）贴在干净载玻片上。在贴片：蜡带分别用粘片剂（蛋白甘油）贴在干净载玻片上。在恒温展片台上展平，烘干。恒温展片台上展平，烘干。第十四页，讲稿共二十五页哦第十五页，讲稿共二十五页哦脱蜡、水化、染色脱蜡、水化、染色蜡带必须先用二甲苯去除石蜡再用乙醇去除蜡带必须先用二甲苯去除石蜡再用乙醇去除二甲苯，再

18、进入水中，才能染色。二甲苯，再进入水中，才能染色。染色的方法很多，要根据标本要求显示的目染色的方法很多，要根据标本要求显示的目的选择不同的染剂，最常用的是苏木精的选择不同的染剂，最常用的是苏木精-伊红染色（伊红染色（HE HE 染色）。苏木精使细胞染色）。苏木精使细胞核显深紫色，伊红使细胞质显粉红色，可核显深紫色，伊红使细胞质显粉红色，可显示清晰的细胞形态和核的大小，位置。显示清晰的细胞形态和核的大小，位置。染色后再使带水的切片经历脱水染色后再使带水的切片经历脱水透明，最透明，最后用树胶封片。后用树胶封片。第十六页，讲稿共二十五页哦HEHE染色：苏木精（染色：苏木精（HematoxylinHe

19、matoxylin）伊红（）伊红（EosinEosin）染色）染色碱性染料碱性染料将嗜碱性物质（本将嗜碱性物质（本身酸性）染成蓝色身酸性）染成蓝色酸性染料酸性染料将嗜酸性物质（本将嗜酸性物质（本身碱性）染成红色身碱性）染成红色细胞核中的细胞核中的DNADNA、RNARNA细细胞质中的胞质中的RNARNA细胞质、膜性结构（细胞质、膜性结构（线粒体、溶酶体、滑线粒体、溶酶体、滑面内质网）面内质网）第十七页，讲稿共二十五页哦 (l)(l)细胞核染色剂细胞核染色剂 用于细胞核的染色剂有天然染色剂的苏木精、洋红以用于细胞核的染色剂有天然染色剂的苏木精、洋红以及合成染色剂中的番红、结品紫、硫堇、甲苯胺蓝、

20、甲基及合成染色剂中的番红、结品紫、硫堇、甲苯胺蓝、甲基绿、美蓝、孔雀绿和焦油紫等。绿、美蓝、孔雀绿和焦油紫等。(2)(2)细胞质染色剂细胞质染色剂 用于细胞质的染色剂有合成染色剂中的曙红、用于细胞质的染色剂有合成染色剂中的曙红、亮绿、橘黄亮绿、橘黄G G、酸性品红、苦味酸和水溶性苯胺蓝等。、酸性品红、苦味酸和水溶性苯胺蓝等。（3 3）脂质染色剂）脂质染色剂 用于显示脂质的染色剂有合成染色剂中的苏丹用于显示脂质的染色剂有合成染色剂中的苏丹IIIIII、苏、苏丹丹IvIv、硫酸尼罗蓝及油红等。、硫酸尼罗蓝及油红等。第十八页，讲稿共二十五页哦其步骤如下：其步骤如下：二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯1/21/

21、2二甲苯二甲苯+1/2+1/2乙醇混乙醇混合液合液100%100%乙醇乙醇95%95%乙醇乙醇85%85%乙醇乙醇70%70%乙醇乙醇50%50%乙醇乙醇30%30%乙醇乙醇苏木精染液苏木精染液0.01%0.01%盐酸盐酸0.01%0.01%氢氧化钠氢氧化钠蒸馏水蒸馏水30%30%乙醇乙醇50%50%乙醇乙醇70%70%乙醇乙醇85%85%乙醇乙醇伊红染液伊红染液95%95%乙醇乙醇100%100%乙醇乙醇100%100%乙乙醇醇1/21/2二甲苯二甲苯+1/2+1/2乙醇混合液乙醇混合液二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯封片封片第十九页，讲稿共二十五页哦镜检、贴标签、干燥、记录。镜检、贴标签、干燥、记

22、录。第二十页，讲稿共二十五页哦3 石蜡切片实例石蜡切片实例鱼肝制片鱼肝制片 材料：鱼肝（厚材料：鱼肝（厚2-3mm，carnoy3-4h/bouin/Zenker固定固定24h）。）。试剂：固定液，埃里希苏木精染液，试剂：固定液，埃里希苏木精染液，1%伊红水溶液，伊红水溶液，1%盐酸乙醇溶液，氨水，二甲苯，盐酸乙醇溶液，氨水，二甲苯，30%100%各级乙醇各级乙醇，甘油蛋白粘片剂，中性树胶。，甘油蛋白粘片剂，中性树胶。苏木精为碱性染料（含阳离子），伊红为酸性染料，鱼肝细胞核含酸性物质，苏木精为碱性染料（含阳离子），伊红为酸性染料，鱼肝细胞核含酸性物质，易与碱性染料的阳离子结合染上蓝色，胞质含碱

23、性物质，易与酸性染料中阴离易与碱性染料的阳离子结合染上蓝色，胞质含碱性物质，易与酸性染料中阴离子结合而染上粉红色。子结合而染上粉红色。第二十一页，讲稿共二十五页哦实验程序：实验程序：取材取材（2-355 mm3）固定固定（carnoy3-4h，bouin 12-24h）洗涤（洗涤（70%乙醇乙醇3-5次）次）脱水脱水（80%、90、100、100%乙醇各乙醇各0.5h）透明透明（乙醇（乙醇+二甲苯等量混合二甲苯等量混合15min，二甲苯，二甲苯15min 2次）次）透蜡透蜡（二甲苯（二甲苯+石蜡各半石蜡各半35-37,0.5h，石蜡，石蜡56-60,0.5h 2次）次）包埋包埋（凝（凝30mi

24、n）切片切片（8m，水面展开，水面展开）贴片贴片（涂粘片剂，滴水（涂粘片剂，滴水1滴）滴）展片展片（40-45）烘干烘干（37，24h）脱蜡脱蜡（二甲苯（二甲苯2-5min，二甲苯，二甲苯+乙醇乙醇2-5min）复水复水（100%、90、80、70、50%、蒸馏水各、蒸馏水各2min）染色染色（埃里希（埃里希苏木精染液苏木精染液15-20min）水洗水洗（2.5min 换换2次，共次，共5min）分分色色（分化，（分化，1%盐酸乙醇溶液数秒，再水洗盐酸乙醇溶液数秒，再水洗1min，染色合适可不做，染色合适可不做此步，）此步，）蓝化（氨水蓝化（氨水3-4s）水洗水洗（2次共次共5min）复染色复

25、染色（1%伊红水溶液伊红水溶液1-5min）脱水脱水（50%数秒、数秒、70%、80%、100、100%乙醇各乙醇各2min）透明透明（乙醇（乙醇+二甲苯二甲苯5min，二甲苯，二甲苯5min 2次）次）封藏封藏（中性树胶（中性树胶 50）。）。第二十二页，讲稿共二十五页哦4 植物组织制片技术实例植物组织制片技术实例4.1 徒手切片徒手切片重要的是切下一小片平而薄的组织，而不是切下完整的组织片；重要的是切下一小片平而薄的组织，而不是切下完整的组织片；左手持材料或夹持物（莴苣茎、胡萝卜根、泡沫塑料等），右手平稳持左手持材料或夹持物（莴苣茎、胡萝卜根、泡沫塑料等），右手平稳持刀（刀片或手术刀），用

26、臂力不用腕力；刀（刀片或手术刀），用臂力不用腕力；刀刃平置经削平的平面上，轻轻压住刀片，以均匀的力量平稳的刀刃平置经削平的平面上，轻轻压住刀片，以均匀的力量平稳的动作，从刀刃的右侧斜向左侧切削，不可挤压材料或拉锯式切动作，从刀刃的右侧斜向左侧切削，不可挤压材料或拉锯式切割；割；材料切面上和刀刃上保持有水，以免材料干枯；材料切面上和刀刃上保持有水，以免材料干枯；切片可简易染色切片可简易染色1-2min，0.1%亚甲基蓝，亚甲基蓝，0.5%中性红，中性红，1%番红番红（木质化细胞壁及核染成红色）（木质化细胞壁及核染成红色）I I2 2-KI-KI溶液（淀粉粒蓝色，核呈黄溶液（淀粉粒蓝色，核呈黄色）

27、色）第二十三页，讲稿共二十五页哦4.2 石蜡切片法（根、茎、叶）显微观察，便于器官的立体重构。显微观察，便于器官的立体重构。硬质材料可用滑走切片机，一般可用手摇切片机。硬质材料可用滑走切片机，一般可用手摇切片机。程序：程序：取材取材（0.5-1cm3）固定固定（卡诺、（卡诺、FAA，2-24h，材料有，材料有空气的需抽气）空气的需抽气）洗涤洗涤（70%乙醇乙醇2次）次）脱水脱水（80%、90、100、100%乙醇各乙醇各0.5h）透明透明（乙醇（乙醇+二甲苯等量混合二甲苯等量混合15min，二甲苯，二甲苯0.5h 2次）次）透蜡透蜡（二甲苯（二甲苯+石蜡各半石蜡各半35-37,0.5-48h，石蜡，石蜡56-60,0.5-1h 2次）次）包埋包埋（凝（凝30min）切片切片（8m，水面展开），水面展开）贴片贴片（涂粘片剂，滴水（涂粘片剂，滴水1滴）滴）展展片片（40-45）烘干烘干（37，24h）。）。第二十四页，讲稿共二十五页哦9/7/2022感谢大家观看感谢大家观看第二十五页，讲稿共二十五页哦