生命大分子物质的制备.ppt

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1、生命大分子物质的制生命大分子物质的制备备现在学习的是第1页，共85页 在自然科学，尤其是生命科学高度发展的今天，蛋白质、在自然科学，尤其是生命科学高度发展的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题。生物大分子结构与功能的研究，中心课题。生物大分子结构与功能的研究，没有能够达到足够纯度的生物大分子，没有能够达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前题，结构与功能的研究就无从谈起。的制备工作为前题，结构与功能的研究就无从谈起。生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困

2、难的工作。难的工作。现在学习的是第2页，共85页生物大分子的制备有以下主要特点：生物大分子的制备有以下主要特点：与化学产品的分离制备相比较：与化学产品的分离制备相比较：蛋白质的蛋白质的导致分离、导致分离、纯化和鉴定有难度和特殊性；核酸较之要简单。纯化和鉴定有难度和特殊性；核酸较之要简单。通常以通常以的形式存在，提取分离困难。的形式存在，提取分离困难。许多生物大分子离开了生物体环境就许多生物大分子离开了生物体环境就，因此分离，因此分离过程中如何防止其失活，是生物大分子提取制备最困难过程中如何防止其失活，是生物大分子提取制备最困难之处。之处。现在学习的是第3页，共85页许多生物大分子在生物材料中的

3、许多生物大分子在生物材料中的，分离纯化的，分离纯化的步骤繁多，流程长。步骤繁多，流程长。生物材料的生物材料的，常常包含有数百种乃至几千，常常包含有数百种乃至几千种化合物，方法的通用性较差种化合物，方法的通用性较差。现在学习的是第4页，共85页生物大分子制备的一般过程：生物大分子制备的一般过程：现在学习的是第5页，共85页现在学习的是第6页，共85页在水和各种有机溶剂中的在水和各种有机溶剂中的。在不同温度、在不同温度、pHpH值和各种缓冲液中生物大分子的值和各种缓冲液中生物大分子的。各种各种：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现

4、、在各种凝胶、况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。树脂等填料中的分配系数。首要了解生物大分子的理化性质：首要了解生物大分子的理化性质：现在学习的是第7页，共85页固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。各种化学试剂的稳定性。对其他生物分子的特殊亲和力对其他生物分子的特殊亲和力。现在学习的是第8页，共85页蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质蛋白质的两性电离和蛋白质的两性电离和等电点等电点蛋白质的胶体性质蛋白质的

5、胶体性质蛋白质的变性、复性、沉淀和凝固蛋白质的变性、复性、沉淀和凝固蛋白质的紫外吸收蛋白质的紫外吸收现在学习的是第9页，共85页目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是现在学习的是第10页，共85页现在学习的是第11页，共85页 制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。所选用的材料主要依据所选用的材料主要依据来确定。来确定。选择的材料应选择的材料应。现在学习的是第12页，共85页 指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。指欲

6、纯化的某种单一的生命大分子物质。杂质杂质：有效成分以外的其他物质的统称。有效成分以外的其他物质的统称。现在学习的是第13页，共85页例一：例一：含量：牛胰腺含量：牛胰腺 猪胰腺猪胰腺 来源：猪来源：猪 牛牛 成本：牛成本：牛 猪猪 综合结果：选用综合结果：选用作为材料。作为材料。现在学习的是第14页，共85页例二：含量：小麦的胚芽中含量高含量：小麦的胚芽中含量高现在学习的是第15页，共85页 材料尽可能保持新鲜，尽快加工处理，以防有效成分降解材料尽可能保持新鲜，尽快加工处理，以防有效成分降解、破坏，必要时可冷冻、干燥处理。、破坏，必要时可冷冻、干燥处理。必须选择必须选择有效成份含量丰富有效成份

7、含量丰富的脏器组织为原材料，先的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理后在适当的溶剂中提取，如果所进行绞碎、脱脂等处理后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。二、材料的处理二、材料的处理现在学习的是第16页，共85页 -70保存备用较好保存备用较好 现在学习的是第17页，共85页必须清洗必须清洗,去壳，脱脂，并注意植物去壳，脱脂，并注意植物品种品种和和不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。与季节性关系密切。如如 叶片叶片:直接洗净直接洗净 植物种子植物种子:泡胀或粉碎泡

8、胀或粉碎 现在学习的是第18页，共85页 种类多，繁殖快、培养简便、易诱变、不受季节种类多，繁殖快、培养简便、易诱变、不受季节的影响，是常用的材料。的影响，是常用的材料。应注意它的生长期。在微生物的应注意它的生长期。在微生物的，酶和核酸，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量。以微生物为材料时有两种情况的含量较高，可以获得高产量。以微生物为材料时有两种情况：（1 1）微生物菌体）微生物菌体到培养基中的代谢产物和胞外酶等到培养基中的代谢产物和胞外酶等 （2 2）菌体）菌体的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等现在学习的是第19页，共85页另外，对预处理好的材料，若不

9、立即进行实验，应另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应；对于易分解的生物大分子应选用对于易分解的生物大分子应选用制备制备；现在学习的是第20页，共85页第二节第二节 确立测定方法确立测定方法现在学习的是第21页，共85页一、目的与要求一、目的与要求生物大分子的两个重要特征：极易失活和含量极微生物大分子的两个重要特征：极易失活和含量极微测定方法应该：测定方法应该：现在学习的是第22页，共85页即生物学和物理化学的测定方法。即生物学和物理化学的测定方法。生物学的测定法主要有：酶的各种测活方法、蛋白生物学的测定法主要有：酶的各种测活方法、蛋白质含量的各种测定法、免疫化学方法、放射性同位质含量的

10、各种测定法、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等；素示踪法等；二、常用的测定方法二、常用的测定方法现在学习的是第23页，共85页l物理、化学方法主要有：物理、化学方法主要有：、气相色谱和液相色谱、气相色谱和液相色谱法、法、（紫外可见、红外和荧光等分光光度法）、（紫外可见、红外和荧光等分光光度法）、以及核磁共振等。、以及核磁共振等。l实际操作中尽可能多用实际操作中尽可能多用，以使分析测定更，以使分析测定更加快速、简便。加快速、简便。现在学习的是第24页，共85页1 1、光谱法、光谱法不同的生命大分子物质与相应波长的光会发生特定的不同的生命大分子物质与相应波长的光会发生特定的作用，依据作用结果可推断

11、出被测物质的含量和部分作用，依据作用结果可推断出被测物质的含量和部分理化性质，这类测定方法为光谱法。理化性质，这类测定方法为光谱法。所需的样品量少、操作简单、反应迅速、灵敏广泛用于所需的样品量少、操作简单、反应迅速、灵敏广泛用于物质的含量测定。物质的含量测定。紫外光谱法、可见光光谱法、荧光光谱法、浊度法紫外光谱法、可见光光谱法、荧光光谱法、浊度法现在学习的是第25页，共85页紫外光谱法紫外光谱法 利用某些生物大分子具有吸收紫外光的性质而建利用某些生物大分子具有吸收紫外光的性质而建立的一种方法。将一定浓度的待测物溶液，通过某一立的一种方法。将一定浓度的待测物溶液，通过某一特定波长的紫外分光光度计

12、，测定此溶液的消光值即特定波长的紫外分光光度计，测定此溶液的消光值即可换算出待测物的浓度。可换算出待测物的浓度。1.测定核酸含量测定核酸含量 2.测定蛋白质的含量及纯度测定蛋白质的含量及纯度现在学习的是第26页，共85页芳芳香香族族氨氨基基酸酸的的紫紫外外吸吸收收现在学习的是第27页，共85页l测定核酸测定核酸 蛋白质的含量蛋白质的含量:ODOD260260=1.0=1.0相当于相当于 5050g/mlg/ml双链双链DNADNA 40 40g/mlg/ml单链单链DNADNA（或（或RNARNA）2020g/mlg/ml寡核苷酸寡核苷酸l测定核酸测定核酸 蛋白质的纯度蛋白质的纯度:DNA D

13、NA纯品纯品:OD:OD260260/OD/OD280280=1.8=1.8 RNA RNA纯品纯品:OD:OD260260/OD/OD280280=2.0=2.0现在学习的是第28页，共85页可见光光谱法可见光光谱法有色物质溶液的颜色与其浓度有关。溶液的浓度越大，有色物质溶液的颜色与其浓度有关。溶液的浓度越大，颜色越深。利用光学比较溶液颜色的深度，可以测定颜色越深。利用光学比较溶液颜色的深度，可以测定溶液的浓度。溶液的浓度。可见光光谱法是基于可见光光谱法是基于而建而建立起来的一种分析方法。将待测物与相关试剂或酶作用立起来的一种分析方法。将待测物与相关试剂或酶作用后的有色产物置于相应的可见光波

14、长下，即测定其消光后的有色产物置于相应的可见光波长下，即测定其消光值值现在学习的是第29页，共85页例如：测定某一蛋白质溶液的浓度例如：测定某一蛋白质溶液的浓度 方法：蛋白质与相关试剂（如方法：蛋白质与相关试剂（如）作用后产生）作用后产生特定颜色的物质（特定颜色的物质（），紫色络合物颜色的），紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，于波长深浅与蛋白质浓度成正比，于波长540nm540nm处进行比色测处进行比色测定。定。最后与标准品比对即可计算出该待测蛋白质溶液的浓最后与标准品比对即可计算出该待测蛋白质溶液的浓度度现在学习的是第30页，共85页现在学习的是第31页，共85页 利用有些生命大分利用

15、有些生命大分子物质自身可以吸收子物质自身可以吸收特定光波的能量后，特定光波的能量后，发出荧光的特性而建发出荧光的特性而建立的一种方法。立的一种方法。现在学习的是第32页，共85页主要用于悬浮液的测定。主要用于悬浮液的测定。测定悬浮液在不被吸收的波长下表现的消光值。测定悬浮液在不被吸收的波长下表现的消光值。不被吸收，主要是不被吸收，主要是散射、反射。散射、反射。现在学习的是第33页，共85页电化学法电化学法生物活性检测法生物活性检测法免疫分析法免疫分析法生物传感器生物传感器现在学习的是第34页，共85页第三节第三节细胞的破碎细胞的破碎现在学习的是第35页，共85页不同的生物体或同一生物体的不同部

16、位的组织，其不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同。细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同。如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。采取专门的细胞破碎方法。现在学习的是第36页，共85页将剪碎的将剪碎的动物组织置于研动物组织置于研钵或匀浆器中，钵或匀浆器中，加入少量石英砂加入少量石英砂研磨或匀浆。研磨或匀浆。现在学习的是第37页，共85页这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，这是一种

17、较剧烈的破碎细胞的方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用10000r/min10000r/min20000r/min20000r/min的内刀式组织捣碎机的内刀式组织捣碎机(即高速即高速分散器分散器)将组织的细胞打碎。将组织的细胞打碎。注意注意温度温度的影响的影响现在学习的是第38页，共85页此法此法是借助超声波的振动是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要和酵母菌时，时间要长久一些。长久一些。现在学习的是第39页，共85页这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在这是一种温

18、和的、彻底破碎细胞的方法。在1.771.7710108 8PaPa3.543.5410108 8Pa Pa 的高压下使细胞悬液通的高压下使细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。现在学习的是第40页，共85页将待破碎的细胞冷至将待破碎的细胞冷至1515到到2020，然后，然后放于室温放于室温(或或40)40)迅速融化，如此反复冻融多次，由迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。胞溶胀破碎。现在学习的是第41页，共85页将新鲜的生物材料存放于一定的将

19、新鲜的生物材料存放于一定的pHpH和适当的温度和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。现在学习的是第42页，共85页利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或或SD

20、SSDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。使用。利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于牛酶和酯酶等，于3737，pH8pH8，处理，处理1515分钟，可以专一性分钟，可以专一性地将细胞壁分解。地将细胞壁分解。现在学习的是第43页，共85页第四节第四节抽抽 提提现在学习的是第44页，共85页指用适当的溶剂和方法，从原料中把有效成分指用适当的溶剂和方法，从原料中把有效成分分离出来的过程。

21、分离出来的过程。是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶剂是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽中，使被分离的生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽可能可能现在学习的是第45页，共85页提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持其生物活性。持其生物活性。目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小；目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小；由固相扩散到液相的难易；由固相扩散到液相的难易；溶剂的溶剂的pHpH值和提取时间等。值和提取时间等。现在学习的是第46页，共85页对蛋白质的稳定性好，对蛋

22、白质的稳定性好，溶解度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶溶解度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。剂。现在学习的是第47页，共85页1)pH1)pH值：值：蛋白质、酶与核酸的蛋白质、酶与核酸的有关。有关。过酸、过碱均应尽量避免，一般控制在过酸、过碱均应尽量避免，一般控制在pH=68范围范围内，提取溶剂的内，提取溶剂的pHpH应在蛋白质和酶的稳定范围内，通应在蛋白质和酶的稳定范围内，通常选择偏离等电点的两侧。远离等电点的常选择偏离等电点的两侧。远离等电点的pH值，值，溶解溶解度增加。度增加。通常，碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性通常，碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂。溶剂。现在

23、学习的是第48页，共85页2)2)溶剂的极性和离子强度：溶剂的极性和离子强度：l离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响，有些离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响，有些物质，如物质，如DNA-蛋白复合物，在高离子强度下溶解度增加。蛋白复合物，在高离子强度下溶解度增加。有些蛋白质和酶，在低离子强度的溶液中有较大的溶解度，有些蛋白质和酶，在低离子强度的溶液中有较大的溶解度，l如在纯水中加入少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水如在纯水中加入少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加，称为时大大增加，称为“”现象。现象。现在学习的是第49页，共85页为了提高提取效率，有时需要降低或提高溶剂的极性。

24、为了提高提取效率，有时需要降低或提高溶剂的极性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其极性降低；增加离向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其极性降低；增加离子强度（如加入子强度（如加入KClKCl、NaClNaCl、NH4ClNH4Cl或或(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4）可以）可以增加溶液的极性。增加溶液的极性。通常，极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于通常，极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂。非极性溶剂。现在学习的是第50页，共85页3)3)水解酶：水解酶：无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中

25、，使大分子生物降解，导致天然核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少。物质量的减少。加入抑制剂或调节提取液的加入抑制剂或调节提取液的pHpH、离子强度或极性等方、离子强度或极性等方法使相应的水解酶失去活性，防止它们对欲提纯的蛋白法使相应的水解酶失去活性，防止它们对欲提纯的蛋白质、酶及核酸的降解作用。质、酶及核酸的降解作用。现在学习的是第51页，共85页 加入二异丙基氟磷酸（加入二异丙基氟磷酸（DFPDFP）可以抑制或减慢自溶作用）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性；解酶的活性；

26、加入苯甲磺酰氟化物（加入苯甲磺酰氟化物（PMSFPMSF）也能清除蛋白水解酶）也能清除蛋白水解酶活力；活力；还可通过选择还可通过选择pHpH、温度或离子强度等，使这些条件都要、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。适合于目的物质的提取。现在学习的是第52页，共85页4)4)温度：温度：为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和酶，提取时为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和酶，提取时一般在一般在0055的低温操作。的低温操作。温度升高，溶解度加大温度升高，溶解度加大。现在学习的是第53页，共85页5)5)搅拌：搅拌：搅拌能促使被提取物的溶解，一般采用温和搅拌为宜，搅拌能促使被提

27、取物的溶解，一般采用温和搅拌为宜，速度太快容易产生大量泡沫，增大了与空气的接触面，速度太快容易产生大量泡沫，增大了与空气的接触面，会引起酶等物质的变性失活。会引起酶等物质的变性失活。现在学习的是第54页，共85页6)6)氧化：氧化：因为一般蛋白质都含有相当数量的巯基，有些巯基常因为一般蛋白质都含有相当数量的巯基，有些巯基常常是活性部位的必需基团。常是活性部位的必需基团。若提取液中有氧化剂或与空气中的氧气接触过多都若提取液中有氧化剂或与空气中的氧气接触过多都会使巯基氧化为分子内或分子间的二硫键，导致酶会使巯基氧化为分子内或分子间的二硫键，导致酶活性的丧失。在提取液中加入少量巯基乙醇或半胱活性的丧

28、失。在提取液中加入少量巯基乙醇或半胱氨酸以防止氨酸以防止。还有金属离子、提取液的比例等因素还有金属离子、提取液的比例等因素现在学习的是第55页，共85页第五节第五节现在学习的是第56页，共85页1.1.沉淀法沉淀法:是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，是分离纯化生物大分子，通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液

29、相，而与杂质得到初步的分离。或留在液相，而与杂质得到初步的分离。现在学习的是第57页，共85页2.2.吸咐法吸咐法:通过吸咐剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩通过吸咐剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩 常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等。糖和凝胶等。现在学习的是第58页，共85页3.3.超滤超滤:是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行进行的方法，液体在一定压力下（氮气压的方法，液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受

30、阻保留。受阻保留。最适于生物大分子尤其是最适于生物大分子尤其是并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。物大分子的活性，回收率高等优点。现在学习的是第59页，共85页 关键在于关键在于，不同类型，不同类型和规格的膜，水和规格的膜，水的流速，的流速，（即大体（即大体上能被膜保留分子上能被膜保留分子最小分子量值）等最小分子量值）等参数均不同，必须参数均不同，必须根据工作需要来选根据工作需要来选用。用。现在学习的是第60页，共85页4.4.透析法透析法:在生物大分子的制备过程中，在生物大分子的制备过程中，除盐、除少

31、量有机溶剂、除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。等都要用到透析的技术。透析只需要使用透析只需要使用专用的半透膜即可专用的半透膜即可完成。保留在透析完成。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为袋内未透析出的样品溶液称为“保留液保留液”，袋（膜），袋（膜）外的溶液称为外的溶液称为“渗出液渗出液”或或“透析液透析液”。截留分子量通。截留分子量通常为常为1 1万左右。万左右。现在学习的是第61页，共85页半透膜阻留蛋白质分子，而让半透膜阻留蛋白质分子，而让小的溶质分子和水通过，以达小的溶质分子和水通过，以达到除去蛋白质溶液中小分子（到除去蛋

32、白质溶液中小分子（盐、低分子酸等）。盐、低分子酸等）。现在学习的是第62页，共85页5.5.蒸馏法蒸馏法:减压加温蒸发浓缩减压加温蒸发浓缩:通过降低液面压力使液体沸点降低，通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些法适用于一些的生物大分子的浓缩。的生物大分子的浓缩。现在学习的是第63页，共85页6.6.空气流动蒸发浓缩空气流动蒸发浓缩:空气的流动可使液体加速蒸发空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室

33、，用电或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂蒸发，而达到浓缩扇对准吹风，使透过膜外的溶剂蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。现在学习的是第64页，共85页7.7.冰冻干燥法冰冻干燥法:生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于保存，生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于保存，常需要干燥处理，最常用的方法是冷冻真空干燥常需要干燥处理，最常用的方法是冷冻真空干燥,适适用于用于现在学习的是第65页，共85页 在低温低压下，冰很易升华为气体。操作时一般先将待干在低温低压下，冰很易升华为气体。操作时一般

34、先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。此法干后的产品溶剂变成气体而除去。此法干后的产品适用于各类生物大分子的干燥保存。适用于各类生物大分子的干燥保存。现在学习的是第66页，共85页现在学习的是第67页，共85页第六节第六节纯化方案的设计与评价纯化方案的设计与评价现在学习的是第68页，共85页 由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中，因此上万种生物分子又处于同一体系中，因此但多数分离工作关但多数分离工作关键部分的基本手段是相

35、同的。键部分的基本手段是相同的。为了避免盲目性，节省实验探索时间，要认真参考和借为了避免盲目性，节省实验探索时间，要认真参考和借鉴前人的经验，少走弯路。鉴前人的经验，少走弯路。现在学习的是第69页，共85页 制备生物大分子的方法分类如下：制备生物大分子的方法分类如下：差速离心、差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等。区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等。盐析、萃取、分配层盐析、萃取、分配层析、选择性沉淀和结晶等。析、选择性沉淀和结晶等。一、纯化方案的设计一、纯化方案的设计现在学习的是第70页，共85页电泳、电渗析、等电点沉淀、电泳、电渗析、等电点沉淀、吸附层析和离子交换层析等。吸附层析和离子交

36、换层析等。亲和层析等。亲和层析等。现在学习的是第71页，共85页切忌！切忌！重复使用同一种分离纯化方法。重复使用同一种分离纯化方法。现在学习的是第72页，共85页分离纯化步骤前后要有科学的安排和衔接，尽可能分离纯化步骤前后要有科学的安排和衔接，尽可能减少工序，提高效率。减少工序，提高效率。2.2.分离纯化方法的排布分离纯化方法的排布:现在学习的是第73页，共85页 1)1)特点：特点：粗提取液中物质成份十分复杂粗提取液中物质成份十分复杂;欲制备的生物大分子浓度很稀欲制备的生物大分子浓度很稀;物理化学性质相近的物质很多物理化学性质相近的物质很多;希望能除去大部分与目的产物物理化学性质差异大希望能

37、除去大部分与目的产物物理化学性质差异大的杂质的杂质;现在学习的是第74页，共85页2)2)对所选方法的要求：对所选方法的要求：要快速、粗放要快速、粗放;能较大地缩小体积能较大地缩小体积;分辨力不必太高分辨力不必太高;负荷能力要大负荷能力要大;现在学习的是第75页，共85页3)3)可选用的方法：可选用的方法：吸附；吸附；萃取；萃取；沉淀法（热变性、盐析、有机溶剂沉淀等）；沉淀法（热变性、盐析、有机溶剂沉淀等）；离子交换（批量吸附、胖柱交换）、亲和层析。离子交换（批量吸附、胖柱交换）、亲和层析。现在学习的是第76页，共85页 分离纯化后期，目的产物的纯度和浓度都大大提高，分离纯化后期，目的产物的纯

38、度和浓度都大大提高，此时对于很多敏感的酶极易变性失活，因此操作步骤要此时对于很多敏感的酶极易变性失活，因此操作步骤要（如在冷室中）进行。（如在冷室中）进行。现在学习的是第77页，共85页可选用的方法：可选用的方法：吸附层析、盐析、凝胶过滤、吸附层析、盐析、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、离子交换层析、亲和层析、等电聚焦制备电泳、制备等电聚焦制备电泳、制备HPLC等。等。现在学习的是第78页，共85页每一步都要进行测定每一步都要进行测定(活力单位数活力单位数/毫克蛋白毫克蛋白)(每步的比活力每步的比活力/粗抽提液比活力）粗抽提液比活力）(每步的总活力每步的总活力/粗抽提液总活力）粗抽提液总活力

39、）二、纯化方案的评价二、纯化方案的评价现在学习的是第79页，共85页步骤总蛋白/g总活性/U比活性/（U/mg）纯化倍数收得率%1.粗抽体液 30.0 21000 0.7 1.0 100 2.氯化锰处理 7.64 15017 2.0 2.8 723.冰冻融解 5.58 14872 2.7 3.8 71 4.DEAE-纤维素层析 0.113 5025 44.5 63.5 245.硫酸铵盐析 0.048 3367 71.7 102.0 17 6.羟基磷灰石柱层析 0.016 3133 200.0 286.0 15 7.聚丙烯酰胺凝胶电泳 0.012 3100 255.0 365.0 15 现在学习

40、的是第80页，共85页第七节第七节有效成分纯度和性质的分析有效成分纯度和性质的分析现在学习的是第81页，共85页现在学习的是第82页，共85页 生物大分子制成品的正确保存极为重要，一旦保存生物大分子制成品的正确保存极为重要，一旦保存不当，辛辛苦苦制成的样品失活、变性、变质，使前面的不当，辛辛苦苦制成的样品失活、变性、变质，使前面的全部制备工作化为乌有，损失惨重，全功尽弃。全部制备工作化为乌有，损失惨重，全功尽弃。现在学习的是第83页，共85页影响生物大分子样品保存的主要因素有：影响生物大分子样品保存的主要因素有：空气的影响主要是潮解、微生物污染和自动氧空气的影响主要是潮解、微生物污染和自动氧化

41、。化。每种生物大分子都有其稳定的温度范围，温度每种生物大分子都有其稳定的温度范围，温度升高升高1010，氧化反应约加快数倍，酶促反应增加，氧化反应约加快数倍，酶促反应增加1 13 3倍。倍。样品本身所带的水份和由空气中吸收的水份。加速样品本身所带的水份和由空气中吸收的水份。加速氧化、聚合、离解和霉变。氧化、聚合、离解和霉变。现在学习的是第84页，共85页某些生物大分子可以吸收一定波长的光，使分某些生物大分子可以吸收一定波长的光，使分子活化不利于样品保存，尤其日光中的子活化不利于样品保存，尤其日光中的能量大，能量大，影响最大，样品受光催化的反应有变色、氧化和分解等，影响最大，样品受光催化的反应有变色、氧化和分解等，通称通称。因此样品通常都要避光保存。因此样品通常都要避光保存。现在学习的是第85页，共85页