色谱分析概论.ppt

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1、关于色谱分析概论现在学习的是第1页，共62页 色谱法是一种重要的分离分析方色谱法是一种重要的分离分析方法，它是根据组分在两相中作用能法，它是根据组分在两相中作用能力不同而达到分离目的。力不同而达到分离目的。现在学习的是第2页，共62页1.1 色谱法发展简史茨维特的实验茨维特的实验茨维特（茨维特（M.S.Tswett)：俄国植物学家，主要从事植物色素的研究工作俄国植物学家，主要从事植物色素的研究工作 1903年年3月月21日：华沙自然科学会议生物学会议上宣读日：华沙自然科学会议生物学会议上宣读论文：论文：“On a new category of absorption phenomena and

2、 their application to biochemical analysis”现在学习的是第3页，共62页 “一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用”。在在1906 年发表的文章中，首次提出了色谱年发表的文章中，首次提出了色谱的概念。的概念。现在学习的是第4页，共62页茨维特的实验-分离植物色素现在学习的是第5页，共62页t s现在学习的是第6页，共62页 v在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）称为内静止不动的一相（固体或液体）称为固定相固定相 ；v自上而下运动的一相（一般是气体或液自上

3、而下运动的一相（一般是气体或液体）称为体）称为流动相流动相 ；v装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为管）称为色谱柱色谱柱 。现在学习的是第7页，共62页v色谱法是一种色谱法是一种分离分离方法。方法。它的特点是：有两相，一是固定相，一是流动相，两相它的特点是：有两相，一是固定相，一是流动相，两相作相向运动。作相向运动。v 将色谱法用于分析中，则称为色谱分析。将色谱法用于分析中，则称为色谱分析。色谱分析是一种分离、分析法。色谱分析是一种分离、分析法。现在学习的是第8页，共62页 v1941年：英国人马丁与辛格首次突出液-液色谱法（经典液相色谱发）；v1952年：

4、英国人马丁与辛格建立气液色谱法（脂肪酸混合物的分离），发展了气相色谱；1956 Van Deemter提出速率理论；v1957年美国Golay首先应用小口径毛细管进行色谱分离；v1959年Porath和Flodin空间排阻色谱法（固定相：多孔凝胶)1967 Kirkland等研制高效液相色谱仪；v1970以后逐渐发展了高效液相色谱；现在学习的是第9页，共62页 v1975年H.Small 研究组建立了离子色谱法；v1979年气相色谱应用的飞跃：弹性石英毛细管色谱柱的商品化；v20世纪50年代：毛细管电泳技术的建立和发展。其迅速发展在20世纪80年代毛细管区带电泳的建立，之后发展了胶束电动色谱、

5、毛细管凝胶色谱、毛细管电色谱（主要应用于：蛋白质分离、糖分析、DNA测试、手性分离、单细胞分析）v我国色谱研究工作起步于1954年，有中科院大连化物所进行早期的理论和技术研究（卢佩章、张玉奎）现在学习的是第10页，共62页色谱分析法的重要贡献v诺贝尔化学奖：1948年，瑞典Tiselins，电泳和吸附分析；1952年，英国马丁(Martin)和辛格(Synge)，分配色谱。v应用的科学领域：化学、化工、轻工、石油、环保、医药、农业等几乎所有学科领域。为信息科学、生命科学、材料科学、环境科学等新兴学科的发展作出了重要贡献。现在学习的是第11页，共62页按流动相分按流动相分气相色谱（GC）液相色谱

6、（LC）超临界流体色谱（SFC）按机理分按机理分吸附色谱分配色谱离子交换色谱排阻色谱现在学习的是第12页，共62页按固定相在支持按固定相在支持 体中的形状分体中的形状分柱色谱平板色谱纸色谱薄层色谱按分离效率分按分离效率分经典液相色谱高效液相色谱现在学习的是第13页，共62页毛细管电色谱法毛细管电色谱法（CEC）色谱法色谱法GSC液相色谱法液相色谱法 （LC）柱色谱法柱色谱法平面色谱法平面色谱法毛细管电泳法毛细管电泳法 （CE）LLCLSCSECIECBPC纸色谱法纸色谱法薄层色谱法薄层色谱法（TLC）LLCLLCLSC气相色谱法气相色谱法（GC）柱色谱法柱色谱法GLC超临界流体色谱法超临界流体

7、色谱法 （SFC）现在学习的是第14页，共62页1.3 色谱法的特点与局限性v1.特点v1）选择性好v2）效率高、速度快v3）灵敏度高、样品用量少v4）应用范围广v2.局限性v1）定性能力相对弱；v2）定量时必须有标准品；v3）有些物质如异构体、固体物质的分析能力较差。现在学习的是第15页，共62页1.4 色谱图和相关术语色谱过程实现色谱操作的基本条件是必须具备相对运动的两相，固定相(stationary phase)和流动相(mobile phase)。色谱过程是组分的分子在流动相和固定相间多次“分配”的过程。现在学习的是第16页，共62页v 现在学习的是第17页，共62页 v v1.色谱图

8、（色谱流出曲线）是由检测器输出的电信号强度对时间作图所绘制的曲线，又称为色谱流出曲线。现在学习的是第18页，共62页 峰峰高基线峰宽半峰宽峰面积标准偏差现在学习的是第19页，共62页2.2.基线基线 在实验操作条件下，在实验操作条件下，色谱柱后没有样色谱柱后没有样品组分流出时的流出曲线称为基线品组分流出时的流出曲线称为基线，稳，稳定的基线应该是一条水平直线。定的基线应该是一条水平直线。3.3.峰高峰高 色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以（以（h h）表示。表示。现在学习的是第20页，共62页 v色谱流出曲线和色谱峰色谱流出曲线和色谱峰v基线（基线（a）v峰高（峰

9、高（h）信号信号进样空气峰ha色谱流出曲线色谱流出曲线色谱峰色谱峰现在学习的是第21页，共62页（四）保留值（四）保留值 1.1.死时间死时间t tM M 不被固定相吸附或溶解的物质进入色不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的空时间称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积，如下图隙体积，如下图。信号进样tM现在学习的是第22页，共62页 因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相流动速度相近。其流动速度将与流动相流动速度相近。测定测定流动相平均线速流动相平

10、均线速 时，可用柱长时，可用柱长L L与与t tM M的比值的比值计算，即计算，即 =L/tM现在学习的是第23页，共62页2.保留时间保留时间tR 试样从进样到柱后出现峰极大点时所试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时间，称为保留时间，如下图。经过的时间，称为保留时间，如下图。信号信号进样进样tR现在学习的是第24页，共62页3.3.调整保留时间调整保留时间t tR R 某组分的保留时间扣除死时间后，称某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的为该组分的调整保留时间调整保留时间，即即 tR=tR tM 由于组分在色谱柱中的保留时间由于组分在色谱柱中的保留时间t tR R包含了包含了组分随流

11、动相通过柱子所需的时间和组分组分随流动相通过柱子所需的时间和组分在固定相中滞留所须的时间，在固定相中滞留所须的时间，所以所以t tR R实际实际上是组分在固定相中保留的总时间。上是组分在固定相中保留的总时间。现在学习的是第25页，共62页 保留时间是色谱法定性的基本依据，保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组分的保留时间常受到流动相流但同一组分的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积来表示保留值。体积来表示保留值。现在学习的是第26页，共62页4.4.死体积死体积V V0 0 指色谱柱在填充后，柱管内固定指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗

12、粒间所剩留的空间、色谱仪中管路相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两项很小可忽略不计时，总和。当后两项很小可忽略不计时，死死体积可由死时间与色谱柱出口的载气流体积可由死时间与色谱柱出口的载气流速速F Fcoco（cmcm3 3minmin-1-1）计算计算。现在学习的是第27页，共62页 V0 =tMFco 式中式中 Fco为扣除饱和水蒸气压并为扣除饱和水蒸气压并经温度校正的流速。经温度校正的流速。仅适用于气相仅适用于气相色谱色谱，不适用于液相色谱，不适用于液相色谱。现在学习的是第28页，共62页5.5.保留体积保留体

13、积V VR R 指从进样开始到被测组分在指从进样开始到被测组分在柱后出柱后出现浓度极大点现浓度极大点时所通过的流动相的体积。时所通过的流动相的体积。保留时间与保留体积关系：保留时间与保留体积关系：VR=tR Fco 现在学习的是第29页，共62页6.6.调整保留体积调整保留体积V VR R 某组分的保留体积扣除死体积后，称为该某组分的保留体积扣除死体积后，称为该组分的调整保留体积。组分的调整保留体积。VR =VR V0 =tR Fco 现在学习的是第30页，共62页7.7.相对保留值相对保留值r r2,12,1 某组分某组分2 2的调整保留值与组分的调整保留值与组分1 1的调整的调整保留值之比

14、，称为相对保留值。保留值之比，称为相对保留值。r2,1=tR2 /tR1=VR2 /VR1 由于相对保留值只与柱温及固定相性质由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它在色谱法中，特别相流速无关，因此，它在色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛是在气相色谱法中，广泛用作定性的依据用作定性的依据。现在学习的是第31页，共62页 在定性分析中，通常固定一个色谱峰在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（作为标准（s s），），然后再求其它峰（然后再求其它峰（i i）对对这个峰的相对保留值，此时可用符号这个峰的相对保留

15、值，此时可用符号 表表示，即示，即 =tR (i)/tR (s)式中式中t tR R (i)(i)为后出峰的调整保留时间，为后出峰的调整保留时间，所以所以 总是大于总是大于1 1的。相对保留值往往可作的。相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标，又称选择因为衡量固定相选择性的指标，又称选择因子。子。现在学习的是第32页，共62页(五五)区域宽度区域宽度 色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，用于衡量柱效率及反映色谱操作条参数之一，用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。表示色谱峰区域宽度通常有件的动力学因素。表示色谱峰区域宽度通常有三种方法三

16、种方法。现在学习的是第33页，共62页1.1.标准偏差标准偏差 即即0.6070.607倍峰高处色谱峰宽倍峰高处色谱峰宽的一半。的一半。2.2.半峰宽半峰宽Y Y1/21/2即峰高一半处对应的峰宽。即峰高一半处对应的峰宽。它与标准偏差的关系为它与标准偏差的关系为 Y Y1/21/2=2.354=2.354 3.3.峰底宽度峰底宽度Y Y即色谱峰两侧拐点上的切即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离。它与标准偏线在基线上截距间的距离。它与标准偏差差 的关系是的关系是 Y=4 Y=4 现在学习的是第34页，共62页现在学习的是第35页，共62页从色谱流出曲线中，可得许多重要信息：从色谱流出曲线

17、中，可得许多重要信息：(i)i)根据色谱峰的个数根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含，可以判断样品中所含 组分的最少个数；组分的最少个数；(ii)ii)根据色谱峰的保留值根据色谱峰的保留值，可以进行定性分，可以进行定性分析；析；(iii)iii)根据色谱峰的面积或峰高根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定，可以进行定量分析；量分析；(iv)iv)色谱峰的保留值及其区域宽度色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价，是评价色谱柱分离效能的依据；色谱柱分离效能的依据；(v)v)色谱峰两峰间的距离色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据。流动相）选择是否合适的依据。现在学

18、习的是第36页，共62页 色谱分析的色谱分析的目的目的是将样品中是将样品中各组分彼此分离各组分彼此分离，组分，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。谱过程的热力学性质有关。但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。

19、中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。现在学习的是第37页，共62页n 关于保留值p死时间死时间(tM):):无保留组分出峰时间无保留组分出峰时间p保留时间保留时间(tR):):p调整保留时间调整保留时间(tR):):p死体积死体积(VM):):p保留体积保留体积(VR):):p调整保留体积调整保留体积(VR):):0FtVMMMRRttt0FtVRR00)(FttFtVMRRR现在学习的是第38页，共62页1.5 色谱现代发展及相关联用技术v1.理论方面v 色谱理论的本质是研究色谱热力

20、学、色谱动力学以及热力学与动力学有机结合来寻求色谱分离的最佳化途径。v 平衡理论、塔板理论、纵向扩散理论、速率理论；v 块状液膜模型、分子顶替模型、各种保留值预测理论，等等。现在学习的是第39页，共62页2.新型固定相和检测器的研究v（1）固定相v 手性固定相手性化合物的分离分析v固定相载体的研究：粒径均匀、高强度的高分子多孔微球制备技术v一般仪器所用填料35m；v超高液相色谱仪中所用填料1.7 m；v整体柱技术（棒柱）：v 将填料单体、引发剂、制孔剂混合后通过原位聚合或固化在柱管中形成的多孔结构的棒状整体式柱体。目的：提高柱效和重现性，实现快速分离分析。现在学习的是第40页，共62页 v（2

21、）检测器v 紫外检测器；荧光检测器；电化学检测器；示差折光检测器等。v 蒸发光散射检测器可用于不吸收紫外光的物质（糖类等）的检测；适合于测挥发性低于流动相得物质。v v 半导体荧光检测器具有高灵敏度，检测限可优于紫外分光光度法2个数量级。现在学习的是第41页，共62页2.技术方面v1）超临界流体色谱（SFC）v 超临界流体：物质处于临界温度和临界压力以上，既不是液体，又不是气体，是一种单一相态的流体。但它兼有气体的低粘度、液体的高密度以及介于气、液之间较高的扩散系数等特性。现在学习的是第42页，共62页 现在学习的是第43页，共62页 v2）多维色谱v 多维技术有GC-GC、LC-GC、LC-

22、LC等多种组合。v3）毛细管电动色谱（CEC）v 可以看成是高效液相色谱和毛细管区带电泳相结合的产物。现在学习的是第44页，共62页 v生物芯片vGC-MSMS(或 LC-MS-MS)vLC-GC-MSv3.仪器方面v 全微机化控制和数据处理的多功能色谱仪器已成为主流产品。v4.色谱专家系统现在学习的是第45页，共62页v高效液相色谱现在学习的是第46页，共62页气相色谱仪现在学习的是第47页，共62页 v1.6 中文工具书及国内外期刊v1.中文工具书v 分析化学手册，分析仪器手册v2.主要色谱期刊v色谱；分析化学现在学习的是第48页，共62页 v Journal of Chromatogra

23、phy（荷兰）2.777（B）Journal of Chromatographic Science（美国）Chromatographia（德国）1.398 Journal of Liquid Chromatography&Related Techniques（美国）Journal of Separation Science现在学习的是第49页，共62页 vBiomedical Chromatography（英国）1.639vAnalytical Chemistry （美国）5.2vElectrophoresis 3.7vJournal of Capillary Electrophoresisv

24、 Journal of Pharmaceutical&Biomedical Analysis 2.453v 等等现在学习的是第50页，共62页 3.在互联网上查阅色谱文献现在学习的是第51页，共62页现在学习的是第52页，共62页现在学习的是第53页，共62页现在学习的是第54页，共62页v色谱法分离理论v(一)基本术语(二)塔板理论(三)速率理论(四)分离度现在学习的是第55页，共62页色谱相关术语v关于色谱峰关于色谱峰v关于保留值关于保留值v关于分配平衡关于分配平衡现在学习的是第56页，共62页n 关于色谱峰峰峰高基线峰宽半峰宽峰面积标准偏差现在学习的是第57页，共62页n 关于保留值p死

25、时间死时间(tM):):无保留组分出峰时间无保留组分出峰时间p保留时间保留时间(tR):):p调整保留时间调整保留时间(tR):):p死体积死体积(VM):):p保留体积保留体积(VR):):p调整保留体积调整保留体积(VR):):0FtVMMMRRttt0FtVRR00)(FttFtVMRRR现在学习的是第58页，共62页v相对保留值相对保留值(ri,s):v保留指数保留指数(I)：又叫：又叫Kovats，它规定正构烷烃的保留指数是，它规定正构烷烃的保留指数是其碳数的其碳数的100倍，其它物质的保留指数在实际色谱条倍，其它物质的保留指数在实际色谱条件下测定。选取与被测物相邻的两种正构烷烃做参

26、件下测定。选取与被测物相邻的两种正构烷烃做参照系，其中一种碳数为照系，其中一种碳数为Z，另一种为另一种为Z+1，被测物的，被测物的保留指数由下式计算保留指数由下式计算：,RsRiRsRisiVVttrZttttIRzzRRzR100lglglglg100)1(现在学习的是第59页，共62页n 关于分配平衡p分配系数分配系数K(distribution coefficient)p分配比分配比k又称为容量因子、容量比、分配容量，是指在一定温度和又称为容量因子、容量比、分配容量，是指在一定温度和压力下，平衡状态时组分在固定相中的量与在流动相中的量之比值。压力下，平衡状态时组分在固定相中的量与在流动相中的量之比值。是衡量柱子对组分保留能力的重要参数是衡量柱子对组分保留能力的重要参数。（柱温）量每毫升流动相上溶质的溶质的量或吸附每毫升固定相上溶解.)(KMRMSttVVKk现在学习的是第60页，共62页p相比相比 色谱柱内固定相和流动相体积之比色谱柱内固定相和流动相体积之比 是柱型及结构的重要特征。是柱型及结构的重要特征。kKVVSM现在学习的是第61页，共62页感谢大家观看感谢大家观看现在学习的是第62页，共62页