酶工程酶的生产和分离纯化.ppt

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1、关于酶工程酶的生产和分离纯化现在学习的是第1页，共53页Contents of chapter 2二、酶的提取与分离纯化技术路线三、细胞破碎四、酶的提取五、酶的分离方法六、酶的浓缩、干燥与结晶一、酶的生产现在学习的是第2页，共53页1.对酶源的要求对酶源的要求2.微生物作为酶的优势微生物作为酶的优势3.对酶生产菌的要求对酶生产菌的要求一、酶的生产一、酶的生产动植物、微生物动植物、微生物生物合成生物合成化学合成化学合成现在学习的是第3页，共53页1.对酶源的要求对酶源的要求1）酶含量丰富）酶含量丰富2）提取、纯化方便）提取、纯化方便一、酶的生产一、酶的生产现在学习的是第4页，共53页2.微生物作

2、为酶的优势微生物作为酶的优势1）微生物种类多，易得到所需的酶类）微生物种类多，易得到所需的酶类2）可以控制微生物培养条件，易获得高产菌株）可以控制微生物培养条件，易获得高产菌株3）生产成本低）生产成本低4）微生物繁殖快、生长周期短）微生物繁殖快、生长周期短5）生产易管理）生产易管理6）提高微生物产酶能力的途径较多）提高微生物产酶能力的途径较多7）微生物易改造，可提高酶产量或改造酶）微生物易改造，可提高酶产量或改造酶一、酶的生产一、酶的生产现在学习的是第5页，共53页3.对酶生产菌的要求对酶生产菌的要求1）不是致病菌，也不产毒素）不是致病菌，也不产毒素2）不易变异退化，不易感染噬菌体）不易变异退

3、化，不易感染噬菌体3）产酶量高，而且最好产生胞外酶）产酶量高，而且最好产生胞外酶4）原料廉价，周期短，易培养）原料廉价，周期短，易培养一、酶的生产一、酶的生产现在学习的是第6页，共53页主要产酶菌：主要产酶菌：大肠杆菌：大肠杆菌：应用最广泛的产酶菌，一般分泌胞内酶。因为其遗传背景清楚应用最广泛的产酶菌，一般分泌胞内酶。因为其遗传背景清楚而广泛应用于遗传工程改造微生物的宿主，被改造成表达优良性状的而广泛应用于遗传工程改造微生物的宿主，被改造成表达优良性状的“工程菌工程菌”。也常在工业生产中应用于生产谷氨酸脱羧酶、门冬氨酸酶、。也常在工业生产中应用于生产谷氨酸脱羧酶、门冬氨酸酶、限制性核酸内切酶等

4、。限制性核酸内切酶等。枯草杆菌：枯草杆菌：工业上应用最广泛的产酶菌之一，淀粉酶、葡萄糖氧化工业上应用最广泛的产酶菌之一，淀粉酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酯酶等的产酶菌。酶、碱性磷酸酯酶等的产酶菌。啤酒酵母：啤酒酵母：工业上广泛应用，主要产转化酶、醇脱氢酶、丙酮酸脱羧酶工业上广泛应用，主要产转化酶、醇脱氢酶、丙酮酸脱羧酶等。等。曲酶（黑曲酶和黄曲酶）：曲酶（黑曲酶和黄曲酶）：糖化酶、蛋白酶、果胶酶、氨基酰化糖化酶、蛋白酶、果胶酶、氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、淀粉酶、氨基酰化酶、脂肪酶等多种酶。酶、葡萄糖氧化酶、淀粉酶、氨基酰化酶、脂肪酶等多种酶。现在学习的是第7页，共53页细胞结构与酶分布细胞结构与

5、酶分布现在学习的是第8页，共53页细胞破碎细胞破碎酶提取酶提取酶分离纯化酶分离纯化酶浓缩酶浓缩酶贮存酶贮存动物、植物或微生物细胞动物、植物或微生物细胞发酵液发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分离离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。离，结晶分离等。二、酶的提取与分离纯化技术路线二、酶的提取与分离纯化技术路线现在学习的是第9页，共53页酶酶的纯化过程，约可分为三的纯化过程，约可分为三个个阶段阶段：(1)(1)粗粗蛋白质蛋白质 (crude(crude protein):protein):采样采样 均均质质打破打破细胞细胞 抽出全蛋白，多使

6、抽出全蛋白，多使用用 盐盐析析沉淀沉淀法法；可以粗略去；可以粗略去除蛋白质以外的物质。除蛋白质以外的物质。(2)(2)部分纯化部分纯化 (partially(partially purified):purified):初步的纯化，使用初步的纯化，使用各钟各钟 柱柱层层析法析法。(3)(3)均均质酶质酶 (homogeneous):(homogeneous):目标酶目标酶的的进进一步精制纯化，一步精制纯化，可用可用制备制备式式电泳电泳 或或 HPLCHPLC。酶分离纯化不同阶段酶分离纯化不同阶段现在学习的是第10页，共53页许多酶存在于细胞内。为了许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要

7、提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。对细胞进行破碎处理。1）机械破碎）机械破碎2）物理破碎）物理破碎3）化学破碎）化学破碎4）酶解破碎）酶解破碎JY92-II D超声波超声波细胞粉碎机细胞粉碎机细胞破碎珠细胞破碎珠高压细胞破碎机高压细胞破碎机DY89-I型型 电动玻璃匀浆机电动玻璃匀浆机三、细胞破碎三、细胞破碎现在学习的是第11页，共53页机械破碎机械破碎捣碎法捣碎法研磨法研磨法匀浆法匀浆法 物理破碎物理破碎温度差破碎法温度差破碎法压力差破碎法压力差破碎法超声波破碎法超声波破碎法 化学破碎化学破碎有机溶剂：有机溶剂：甲苯、丙酮甲苯、丙酮丁醇、氯仿丁醇、氯仿表面活性剂：表面活性剂：Tri

8、ton、Tween酶促破碎酶促破碎自溶法自溶法外加酶制剂法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理细胞破碎方法及其原理现在学习的是第12页，

9、共53页l酶的提取酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。也称为酶的抽提。l酶提取时首先应根据酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。l酶都能溶解

10、于水，通常可酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。基团，则可用有机溶剂提取。四、酶的提取四、酶的提取现在学习的是第13页，共53页提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、缩短扩散距离提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、缩短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。大提取效果。为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程

11、中还要注意控制好温度、过程中还要注意控制好温度、pHpH值等提取条件。值等提取条件。四、酶的提取四、酶的提取现在学习的是第14页，共53页提取方法提取方法使用的溶剂或溶液使用的溶剂或溶液提取对象提取对象盐溶液提取盐溶液提取0.020.020.5mol/L0.5mol/L的盐的盐溶液溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶度较大的酶酸溶液提取酸溶液提取pH2pH26 6的水溶液的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶且稳定性较好的酶碱溶液提取碱溶液提取pH8pH81212的水溶液的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大用于提取

12、在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶且稳定性较好的酶有机溶剂提有机溶剂提取取可与水混溶的有机溶可与水混溶的有机溶剂剂用于提取那些与脂质结合牢固或用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶含有较多非极性基团的酶大多数蛋白类酶都溶于水，而大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为而增加，这称为盐溶现象盐溶现象。四、酶的提取四、酶的提取现在学习的是第15页，共53页五、酶的分离方法五、酶的分离方法1、沉淀分离2、离心分离3、过滤与膜分离4、层析分离GoGoGoGo5、电泳分离Go现在学习的是

13、第16页，共53页1 1、沉淀分离、沉淀分离沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降溶解度降低低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。沉淀分离方法沉淀分离方法分离原理分离原理盐析沉淀法盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离从而使酶与杂质分离等电点沉淀法等电点沉

14、淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的性，通过调节溶液的pHpH值，使酶或杂质沉淀值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离析出，从而使酶与杂质分离现在学习的是第17页，共53页1 1、沉淀分离、沉淀分离沉淀分离方法沉淀分离方法分离原理分离原理有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀法法利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离或杂质

15、沉淀析出，从而使酶与杂质分离复合沉淀法复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离选择性变性选择性变性沉淀法沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂性沉淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离质分离现在学习的是第18页，共53页在盐浓度达到某一界限在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为度升高而降低，这称为盐析现象盐析现象。在一定的温度和在一定的温度和pHpH值条件下（值

16、条件下（为常数），通过改变离子强度为常数），通过改变离子强度使不同的酶或蛋白质分离的方法称为使不同的酶或蛋白质分离的方法称为KsKs分段盐析分段盐析；而在一定的盐和离；而在一定的盐和离子强度的条件下（子强度的条件下（KsKsI I为常数），通过改变温度和为常数），通过改变温度和pHpH值，使不同的值，使不同的酶或蛋白质分离的方法，称为酶或蛋白质分离的方法，称为分段盐析分段盐析。盐析盐析现在学习的是第19页，共53页 在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中

17、以硫酸铵最为常以硫酸铵最为常用用。这是由于硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小，不影。这是由于硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。然而用硫酸铵进行响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。然而用硫酸铵进行盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存在会干扰蛋白质的测盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。在盐浓度达到某一界限在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为度升高而降低，这称为盐析现象盐析现象。盐析盐析现在学习的是第20页，共53页

18、影响蛋白质盐析沉淀的因素影响蛋白质盐析沉淀的因素a.蛋白质的浓度蛋白质的浓度:2.5-3.0%b.介质的介质的pH:接近等电点接近等电点 c.温度温度:一般在室温，特殊在一般在室温，特殊在4度度 d.盐类型盐类型:单价盐很差单价盐很差1 1、沉淀分离、沉淀分离盐析盐析现在学习的是第21页，共53页空间排阻学说：空间排阻学说：PEG分子在溶液中形成网状结构，与分子在溶液中形成网状结构，与溶液中的蛋白质分子发生空间排挤作用，从而使蛋白质分溶液中的蛋白质分子发生空间排挤作用，从而使蛋白质分子凝聚而沉淀下来。子凝聚而沉淀下来。1 1、沉淀分离、沉淀分离PEG沉淀沉淀现在学习的是第22页，共53页影响因

19、素影响因素 a.蛋白质的分子质量蛋白质的分子质量大，沉降好大，沉降好 b.蛋白质浓度蛋白质浓度:浓度高，易于沉淀；太高，分段作用减弱浓度高，易于沉淀；太高，分段作用减弱 c.pH值值:接近等电点接近等电点 d.离子强度离子强度:低离子强度影响不大，过高影响分段效果低离子强度影响不大，过高影响分段效果 e.温度温度:030度度 f.PEG聚合度聚合度:越高，用量越少；过高操作不便，多用越高，用量越少；过高操作不便，多用PEG60001 1、沉淀分离、沉淀分离PEG沉淀沉淀现在学习的是第23页，共53页 有机溶剂之所以能使酶沉淀析出，主要是由于有机溶剂的存在有机溶剂之所以能使酶沉淀析出，主要是由于

20、有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，会使溶液的介电常数降低。例如，2020时水的介电常数为时水的介电常数为8080，而，而8282乙醇水溶液的介电常数为乙醇水溶液的介电常数为4040。溶液的介电常数降低，就使溶质分子溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。也使其溶解度降低而沉淀析出。常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等

21、常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等 有机溶剂有机溶剂现在学习的是第24页，共53页等电点沉淀法等电点沉淀法蛋白质在等电点（蛋白质在等电点（I）处，净电荷为）处，净电荷为0，易于，易于沉淀。沉淀。热变性沉淀法热变性沉淀法可用其他辅助因子、底物等方法，使目的酶的热变可用其他辅助因子、底物等方法，使目的酶的热变性温度提高。性温度提高。1 1、沉淀分离、沉淀分离现在学习的是第25页，共53页 离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力离心力，使，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。在离心分离时，要根据欲

22、分离物质以及杂质的在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大颗粒大小、密度和特性的不同小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。法和离心条件。2 2、离心分离离心分离现在学习的是第26页，共53页低速离心机低速离心机,其最大转速在其最大转速在8000 r/min以内，在酶的分离纯化过程以内，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。于酶的结晶等较大颗粒的分离。高速离心机高速离心机的最大转速为（的最大转速为（12.5）104 r/

23、min，在酶的分离，在酶的分离中主要用于沉淀细胞碎片和细胞器等的分离。为了防止高速离中主要用于沉淀细胞碎片和细胞器等的分离。为了防止高速离心过程中心过程中,温度升高而造成酶的变性失活温度升高而造成酶的变性失活,有些高速离心机装设有有些高速离心机装设有冷冻装置冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。谓之高速冷冻离心机。超速离心机超速离心机的最大转速达的最大转速达(2.512)104 r/min，超速离心主要用，超速离心主要用于于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。；样品纯度的检测；沉

24、降系数和相对分子质量的测定等。2 2、离心分离离心分离现在学习的是第27页，共53页区带离心法区带离心法等密度平衡离心法等密度平衡离心法高速离心法的比较高速离心法的比较现在学习的是第28页，共53页 蛋白质蛋白质分子在离心时，其分子在离心时，其 分子量、分子密度、组成分子量、分子密度、组成、形状、形状等，均会影响其沉降速率，等，均会影响其沉降速率，沉降系数沉降系数 即用來描即用來描述此沉降性质；述此沉降性质；其单位为其单位为 S S(Svedberg unit)(Svedberg unit)。每一种的沉降系数与其分子密度或分子量成正比。每一种的沉降系数与其分子密度或分子量成正比。不不同沉降系数

25、的蛋白质，可利用超高速离心法分离。同沉降系数的蛋白质，可利用超高速离心法分离。2 2、离心分离离心分离现在学习的是第29页，共53页3 3、过滤与膜分离、过滤与膜分离过滤是借助于过滤是借助于过滤介质过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等，可以根据需要选用。各种高分子膜等，可以根据需要选用。过滤过滤非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质 膜过滤：采用各种

26、高分子膜为过滤介质膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质 现在学习的是第30页，共53页过滤的分类及其特性过滤的分类及其特性(根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同)类别类别截留颗粒大小截留颗粒大小截留的主要物质截留的主要物质过滤介质过滤介质粗滤粗滤 2m 2m酵母、霉菌、动物细胞、酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金多孔陶瓷、烧结金属等属等微滤微滤0.20.22m2m细菌、灰尘等细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶瓷微滤膜、微孔陶瓷超滤超滤20200.2m0.2m病毒、生物大分子等病毒、生物大分子等超滤膜超

27、滤膜反渗透反渗透 20 20生物小分子、盐、离子生物小分子、盐、离子反渗透膜反渗透膜现在学习的是第31页，共53页膜分离加压膜分离加压膜分离 微滤微滤超滤超滤反渗透反渗透电场膜分离电场膜分离 电渗析电渗析 离子交换膜电渗析离子交换膜电渗析 扩散膜分离扩散膜分离 透析透析现在学习的是第32页，共53页4 4、层析分离、层析分离层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的用混合物中各组分的物理化学性质物理化学性质的差别，使各组分以不同程的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的度分布在两个相中，其中一个

28、相为固定的(称为固定相称为固定相)，另一个相，另一个相则流过此固定相则流过此固定相(称为流动相称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。达到分离。分子的大小和形状、分分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子子极性、吸附力、分子亲和力和分配系数亲和力和分配系数现在学习的是第33页，共53页 层析方法层析方法分离依据分离依据离子交换层析离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的目的凝胶过滤层析凝胶过滤层析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中以

29、各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离物质分离亲和层析亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的专一而利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化4 4、层析分离、层析分离现在学习的是第34页，共53页离子交换层析是利用离子交换离子交换层析是利用离子交换剂上的剂上的可解离基团（活性基可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不团）对各种离子的亲和力不同而达到分离同而达到分离目的的一种层目的的一种层析分离方法。析分离方法。离子交换层析离子交换层析现在学习的是第35页，

30、共53页按活性基团的性质不同，按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为离子交换剂可以分为阳离阳离子交换剂子交换剂和和阴离子交换剂阴离子交换剂。由于酶分子具有两性性质，由于酶分子具有两性性质，所以可用阳离子交换剂，也所以可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。分离纯化。离子交换剂离子交换剂是含有若干活是含有若干活性基团的不溶性高分子物性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）可解离基团（活性基团）而制成。而制成。现在学习的是第36页，共53页凝胶层析又称为凝胶层析又称为

31、凝胶过滤，凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析分子排阻层析，分子筛层析等等。是指以各种多孔凝胶为固定。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。物质分离的一种层析技术。凝胶过滤层析凝胶过滤层析现在学习的是第37页，共53页凝胶层析柱中装有凝胶层析柱中装有多孔凝胶多孔凝胶，当含有，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间

32、隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的层析柱，而达到分离的目的。现在学习的是第38页，共53页常用的凝胶：葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶琼脂凝胶与琼脂糖凝胶琼脂凝胶与琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 现在学习的是

33、第39页，共53页亲和层析是利用生物分子与配基之亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术。，而使生物分子分离纯化的技术。亲和层析亲和层析现在学习的是第40页，共53页酶与底物酶与底物,酶与竞争性抑制剂酶与竞争性抑制剂,酶与酶与辅助因子辅助因子,抗原与抗体抗原与抗体，RNARNA与互与互补的补的RNARNA分子或片段分子或片段,RNARNA与互补的与互补的DNADNA分子或片段分子或片段等之间等之间，都是具有专都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对一而又可逆亲和力的生物分子对。故此。故此,亲和层析在酶的分离纯化中亲和层

34、析在酶的分离纯化中有重要应用有重要应用.亲和层析亲和层析现在学习的是第41页，共53页根据欲分离组分与配基的结合特性根据欲分离组分与配基的结合特性,亲和层析可以分为：亲和层析可以分为：共价亲和层析共价亲和层析疏水层析疏水层析金属离子亲和层析金属离子亲和层析免疫亲和层析免疫亲和层析染料亲和层析染料亲和层析凝集素亲和层析凝集素亲和层析 现在学习的是第42页，共53页5 5、电泳分离、电泳分离带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为程称为电泳电泳。现在学习的是第43页，共53页5 5、电泳分离、电泳分离颗粒在电场中的移动速度主

35、要决颗粒在电场中的移动速度主要决定于其定于其本身所带的净电荷量本身所带的净电荷量，同，同时受时受颗粒形状颗粒形状和和颗粒大小颗粒大小的影响的影响。此外，还受到。此外，还受到电场强度、溶液电场强度、溶液pH值、离子强度及支持体的特值、离子强度及支持体的特性性等外界条件的影响。等外界条件的影响。现在学习的是第44页，共53页5 5、电泳分离、电泳分离聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦等电聚焦 现在学习的是第45页，共53页SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）加入加入1%2%的的SDS制备而成。制备而成。SDSPAGE主要用于测定主要用于测定蛋白质的分子质量蛋白质

36、的分子质量。基本原理：基本原理：SDS蛋白质复合物中蛋白质复合物中SDS含有大量阴离子，从而含有大量阴离子，从而掩盖掩盖了蛋了蛋白质之间原来的电荷的白质之间原来的电荷的差异差异；而且蛋白质构象发生改变变成；而且蛋白质构象发生改变变成椭椭圆形圆形，短轴为，短轴为18埃左右，埃左右，长轴与蛋白质分子质量成正比长轴与蛋白质分子质量成正比 SDS蛋白质复合物的蛋白质复合物的迁移率迁移率不再受其原在电荷和分子形状不再受其原在电荷和分子形状的影响，而只决定于的影响，而只决定于蛋白质的分子质量蛋白质的分子质量。现在学习的是第46页，共53页现在学习的是第47页，共53页现在学习的是第48页，共53页现在学习

37、的是第49页，共53页六、酶的浓缩、干燥与结晶六、酶的浓缩、干燥与结晶浓缩与干燥都是酶与溶剂（通常是水）分离的过程。在浓缩与干燥都是酶与溶剂（通常是水）分离的过程。在酶的分离纯化过程中是一个重要的环节。酶的分离纯化过程中是一个重要的环节。离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作用。用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸去水分作用。用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸去水分，也可以达到浓缩效果。，也可以达到浓缩效果。蒸发浓缩是通过加热或者减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸发浓缩是通过加热或者减压方法使溶液中的部

38、分溶剂汽化蒸发，使溶液得以浓缩的过程。由于酶在高温条件下不稳定蒸发，使溶液得以浓缩的过程。由于酶在高温条件下不稳定，容易变性失活，故酶液的浓缩通常采用，容易变性失活，故酶液的浓缩通常采用真空浓缩真空浓缩。即在一定。即在一定的真空条件下，使酶液在的真空条件下，使酶液在6060以下进行浓缩。以下进行浓缩。现在学习的是第50页，共53页在固体酶制剂的生产过程中，在固体酶制剂的生产过程中，为了提高酶的稳定性，便于保为了提高酶的稳定性，便于保存、运输和使用，一般都必须存、运输和使用，一般都必须进行干燥。常用的干燥方法有进行干燥。常用的干燥方法有：真空干燥真空干燥冷冻干燥冷冻干燥喷雾干燥喷雾干燥气流干燥气流干燥吸附干燥吸附干燥六、酶的浓缩、干燥与结晶六、酶的浓缩、干燥与结晶现在学习的是第51页，共53页结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。酶结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。酶的结晶是酶分离纯化的一种手段。它不仅为酶的的结晶是酶分离纯化的一种手段。它不仅为酶的结构与功能等的研究提供了适宜的样品，而且为结构与功能等的研究提供了适宜的样品，而且为较高纯度的酶的获得和应用创造了条件。较高纯度的酶的获得和应用创造了条件。六、酶的浓缩、干燥与结晶六、酶的浓缩、干燥与结晶现在学习的是第52页，共53页感谢大家观看感谢大家观看现在学习的是第53页，共53页