第三液相色谱法课件.ppt

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1、第三液相色谱法第三液相色谱法第1页，此课件共51页哦第2页，此课件共51页哦第3页，此课件共51页哦4.1.1 特点特点 特点：高压、高效、高速、高灵敏度特点：高压、高效、高速、高灵敏度 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。第4页，此课件共51页哦4.1.2.流程流程第5页，此课件共51页哦4.1.3.主要部件主要部件(1)高压输液泵主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：150350105 Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮

2、丙酮 二氧二氧六环六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷氯仿氯仿溴乙烷溴乙烷苯苯四氯化碳四氯化碳二硫化碳二硫化碳环己烷环己烷己烷己烷煤油煤油(最小最小)第19页，此课件共51页哦4.选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题（a）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质 长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（b）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。（如使固定液溶解流失；

3、酸性溶剂破坏氧柱子。（如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定化铝固定相等。）相等。）（c）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在淀并在柱中沉积。柱中沉积。（d）流动相还应满足检测器的要求。当使用紫外检测）流动相还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。器时，流动相不应有紫外吸收。第20页，此课件共51页哦4.2.1.液液-固吸附色谱固吸附色谱 liquid-solid adsorption chromatography 固定相：为固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是：为固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等，较常使用的

4、是510 m的硅胶吸附剂；的硅胶吸附剂；流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理：组分在固定相上的吸附与解吸；：组分在固定相上的吸附与解吸；适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；的化合物和异构体有较高选择性；缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；4.2 主要分离类型与基本原理第21页，此课件共51页哦有机氯农药残留量分析有机氯农药残留量分析 固定相：薄壳型硅胶固定相：薄壳型硅胶(37 50 m)流动相：正己烷流动相：正己烷 流流 速

5、：速：1.5 mL/min 色谱柱：色谱柱：50cm 2.5mm(内径内径)检测器：差示折光检测器检测器：差示折光检测器 可对水果、蔬菜中的农药残可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。留量进行分析。第22页，此课件共51页哦4.2.2.液液-液分配色谱液分配色谱 liquid-liquid partition chromatography 固定相与流动相均为液体（互不相溶）；固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；：组分在固定相和流动相上的分配；流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定

6、液的极性（极性小于固定液的极性（正相正相 normal phase），反之，流动相的极性），反之，流动相的极性大于固定液的极性（大于固定液的极性（反相反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序）。正相与反相的出峰顺序相反。相反。常用溶剂的极性顺序常用溶剂的极性顺序：水水(最大最大)甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷 氯仿氯仿 溴乙烷溴乙烷 苯苯 四氯化碳四氯化碳 二硫化碳二硫化碳 环己烷环己烷 己烷己烷 煤油煤油(最小最小)第23

7、页，此课件共51页哦固定相固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；液-液分配及离子对分离固定相 （1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用现采用10m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体）（薄壳型微珠担体）3040m的玻璃微球，表的玻璃微球，表面附着一层厚度为面附着一层厚度为1 2m的的多孔硅胶。多孔硅

8、胶。表面积小，柱容量底；表面积小，柱容量底；第24页，此课件共51页哦 化学键合固定相化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；目前应用最广、性能最佳的固定相；a.硅氧碳键型：硅氧碳键型：SiOC b.硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：SiOSi C c.硅碳键型：硅碳键型：SiC d.硅氮键型：硅氮键型：SiN 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广（3）化学键合固定相）化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应：将各种不同基团通过化学反应 键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。第25页，此课件共51页哦化学键合固定相的

9、特点化学键合固定相的特点（1）传质快传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；（4）选择性好选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；，可键合不同官能团，提高选择性；（5）有利于梯度洗脱；有利于梯度洗脱；存在着存在着双重分离机制双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；低覆盖率：吸附为主；第26页，此课件共

10、51页哦稠环芳烃的分析稠环芳烃的分析 稠环芳烃多为致癌物质。固定相：十八烷基硅烷化键合相固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：流动相：20%甲醇甲醇-水水 100%甲醇甲醇 线性梯度淋洗，线性梯度淋洗，2%/min 流流 速：速：1mL/min 柱柱 温：温：50 C 柱柱 压：压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器检测器：紫外检测器第27页，此课件共51页哦4.2.3.离子交换色谱离子交换色谱 ion-exchange chromatography 固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用：阴离子离

11、子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液酸性水溶液；阳离；阳离子离子交换树脂作固定相，采用子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液碱性水溶液；基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长。和力大，保留时间长。阳离子交换：RSO3H +M+=RSO3 M +H+阴离子交换：RNR4OH +X-=RNR4 X+OH-应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。第28页，此

12、课件共51页哦离子交换色谱分离固定相离子交换色谱分离固定相 结构类别：结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂）薄壳型离子交换树脂 薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂；（2）离子交换键合固定相）离子交换键合固定相 薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团）树脂类别：树脂类别：（1）阳离子交换树脂（强酸性、阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）弱酸性）（2）阴离子交换树脂（强碱性、阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）弱碱性）第29页，此课件共51页哦4.2.4.离子对色谱离子对色谱 ion pair chromatography 原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离：将一种（或多种

13、）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；六烷基三甲铵作为对离子；阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；反相离子对色谱：非极性的疏水固定相：非极性的疏水固定相(C-18柱柱)，含有阳离子，含有阳离子Y+的甲醇的甲醇-水或乙腈水或乙腈-水作为流

14、动相，试样离子水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生进入流动相后，生成疏水性离子对成疏水性离子对Y+X-后；在两相间分配。后；在两相间分配。第30页，此课件共51页哦4.2.5.尺寸排斥色谱尺寸排斥色谱size-exclusion chromatography 原理：按分子大小分离。小分子：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。最后出峰。全部在

15、死体积前出峰；全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离范围内的化合物按质量分离 第31页，此课件共51页哦M.W.tR第32页，此课件共51页哦M.W.tR第33页，此课件共51页哦M.W.tR第34页，此课件共51页哦M.W.tR第35页，此课件共51页哦4.2.6.亲和色谱亲和色谱 Affinity chromatograph 原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。力，进行选择性分离。先在载体表面键合上一种具先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔

16、臂有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等环氧、联胺等)，再连接上配基，再连接上配基(酶、抗原等酶、抗原等)，这种固载化的配，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。改变淋洗液后洗脱。第36页，此课件共51页哦以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析对象以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析对象,在在七十年代出现、八十年代迅速发展。七十年代出现、八十年代迅速发展。传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题：传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题：(1)(1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长；需

17、要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长；(2)(2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。4.3 离子色谱法离子色谱法第37页，此课件共51页哦1.离子色谱法原理离子色谱法原理 离子交换原理，与传统离子交换的不离子交换原理，与传统离子交换的不同点：同点：采用交换容量非常低的特制离子交换树脂采用交换容量非常低的特制离子交换树脂为固定相；为固定相；细颗粒柱填料，高柱效；采用高压输液泵细颗粒柱填料，高柱效；采用高压输液泵；低浓度淋洗液或本底电导抑制（在分离柱后，采用抑制柱来消除低浓度淋洗液或本底电导抑制（在分离柱后，采用抑制柱来消除淋洗液的高本底电导）；淋洗液

18、的高本底电导）；可采用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物；可采用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物；各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。第38页，此课件共51页哦离子色谱连续抑制装置图离子色谱连续抑制装置图第39页，此课件共51页哦4 离子色谱的应用离子色谱的应用阴离子分析:双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3250mm),流动相：流动相：0.003molL-1 NaHCO3/0.0024 molL-1 Na2CO3，流量流量138 mL/hr。七种阴离子在七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离，

19、各组分含量分钟内基本上得到完全分离，各组分含量在在350 ppm。第40页，此课件共51页哦1.概述 超临界流体超临界流体：在高于临界压力与临界温度时，物质的一种状在高于临界压力与临界温度时，物质的一种状态。性质介于液体和气体之间。态。性质介于液体和气体之间。超临界流体色谱超临界流体色谱(SFC)，8080年代快速发展，具有液相、气相色年代快速发展，具有液相、气相色谱不具有的优点谱不具有的优点:（1）可处理高沸点、不挥发试样；）可处理高沸点、不挥发试样；（2）比）比LC有更高的柱效和分离效率。有更高的柱效和分离效率。4.4 超临界色谱超临界色谱(SFC)Supercritical Fluid

20、Chromatograph第41页，此课件共51页哦2.超临界流体性质超临界流体性质（1 1）性质介于液体和气体之间）性质介于液体和气体之间;具有气体的低黏度、液体的高密度，扩散系数位于两者之具有气体的低黏度、液体的高密度，扩散系数位于两者之间。间。（2 2）可通过改变超临界流体的密度（程序改变）调节组分分离（类似）可通过改变超临界流体的密度（程序改变）调节组分分离（类似于气相色谱的程序升温，液相色谱中的梯度淋洗）。于气相色谱的程序升温，液相色谱中的梯度淋洗）。超临界流体的密超临界流体的密度与压力有关。度与压力有关。第42页，此课件共51页哦3.原理原理 SFC的流动相：超临界流体；的流动相：

21、超临界流体；CO2、N2O、NH3 SFC的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；可使用液相色谱的柱填料。填充柱）上的高聚物；可使用液相色谱的柱填料。填充柱SFC和毛细管柱和毛细管柱SFC。分离机理：吸附与脱附。组分在两相间的分配系数不同而被分离。分离机理：吸附与脱附。组分在两相间的分配系数不同而被分离。通过调节流动相的压力（调节流动相的密度），调整组分保留值通过调节流动相的压力（调节流动相的密度），调整组分保留值。第43页，此课件共51页哦程程序序升升压压第44页，此课件共51页哦1.结构流程 第45页，此课件共5

22、1页哦2.主要部件主要部件（1）SFC的高压泵的高压泵 无脉冲的注射泵；通过电子压力传感器和流量检测器，计算机控无脉冲的注射泵；通过电子压力传感器和流量检测器，计算机控制流动相的密度和流量；制流动相的密度和流量；（2）SFC的色谱柱和固定相的色谱柱和固定相 可以采用液相色谱柱和交联毛细管柱；可以采用液相色谱柱和交联毛细管柱；SFC的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；专用的毛细管柱壁）上的高聚物；专用的毛细管柱SFC；第46页，此课件共51页哦（3）流动相）流动相 SFC的流动相：超临界流体；的流动相：超临界流体；C

23、O2、N2O、NH3 CO2应用最广泛；无色、无味、无毒、易得、对各类有机物溶解性好，应用最广泛；无色、无味、无毒、易得、对各类有机物溶解性好，在紫外光区无吸收；缺点：极性太弱；加少量甲醇等改性；在紫外光区无吸收；缺点：极性太弱；加少量甲醇等改性；（4）检测器）检测器 可采用液相色谱检测器，也可采用气相色谱的可采用液相色谱检测器，也可采用气相色谱的FID检测器检测器第47页，此课件共51页哦蜂皇浆中壬烯双酸的分析蜂皇浆中壬烯双酸的分析LC 说明说明 蜂皇浆作为食品和中药已广为人知，但其中的蜂皇浆作为食品和中药已广为人知，但其中的10羟基羟基壬烯双酸壬烯双酸(10-HDA)是蜂皇浆中的特有成分，

24、它的含量和检查方是蜂皇浆中的特有成分，它的含量和检查方法是蜂皇浆组成基准中的重要项目。它的分析例如下所示。法是蜂皇浆组成基准中的重要项目。它的分析例如下所示。前处理法前处理法 采取一定量的试样，加蒸馏水混合溶解，加一定量的内标采取一定量的试样，加蒸馏水混合溶解，加一定量的内标(安息香酸安息香酸/甲醇甲醇)后，用后，用0.45m的一次性过滤器过滤。的一次性过滤器过滤。第48页，此课件共51页哦 分析条件：分析条件：柱柱：STR ODS-II(4.6mm150mm)流动相流动相：10mM磷酸钠缓冲液磷酸钠缓冲液/甲醇甲醇=55/45(V/V)流量流量：1.0mL/min 温度：温度：40 检测检测

25、：紫外吸光度：紫外吸光度=210nm 内标物质壬烯双酸第49页，此课件共51页哦 离子交换色谱法检测三聚氰胺离子交换色谱法检测三聚氰胺1.提取液提取液:乙腈乙腈2.流动相流动相:0.05%磷酸二氢钾水溶液磷酸二氢钾水溶液-乙腈乙腈(70:30)3.色谱柱色谱柱:SCX离子交换色谱柱离子交换色谱柱(250mm4.6mm)4.检测器检测器:紫外检测紫外检测器器,波长波长 240nm第50页，此课件共51页哦LC-MS(高效液相色谱高效液相色谱-质谱联用质谱联用)检测三聚氰检测三聚氰胺胺 色谱条件色谱条件 流动相流动相:乙酸铵水溶液乙酸铵水溶液-甲醇甲醇(90:10)色谱柱色谱柱:C18反向柱反向柱 150mm 2.1mm 质谱条件质谱条件 电离方式电离方式:电喷雾电离源电喷雾电离源(ESI)第51页，此课件共51页哦