2022年生物化学与分子生物学实验技术剖析 .docx

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1、精选学习资料 - - - - - - - - - 生物化学与分子生物学试验技术试验安全与试验基本操作试验室常用试剂的使用安全二甲苯. 无色液体,有芳香气味,易挥发；用来制造、染料、塑料和药物；属低毒类,对皮肤和黏膜有刺激作用,高浓度有麻醉作用；神经系统会受损害,仍会使肾和肝受时性损耗；.眼睛接触：蒸气会刺激眼睛,液体导致严峻刺激,发红肿胀和灼伤；通常影响是暂20 分钟,时性的；皮肤接触：产生灼伤感、干燥；可以用微温的缓慢流水冲洗至少用无摩擦性的肥皂有助于从皮肤上洗去二甲苯；. 易燃,有爆炸危急；属于甲类防火危急物质；用二氧化碳或干粉或泡沫灭火剂,不宜用水；三氯甲烷. 无色透亮易挥发液体,有特别

2、的香甜气味；沸点：,医药上用作麻醉剂；也用作萃取剂和溶剂；.有很强的麻醉作用,在光的作用下, 能被空气中的氧反应生成氯化氢和剧毒的光气；通常加入 12% 乙醇,使生成的光气与乙醇作用而生成碳酸乙酯,以排除其毒性；. 吸入高浓度蒸汽时,开头刺激眼、口腔、鼻孔粘摸,发生流泪、感觉麻醉、呕吐、痉挛、直到昏睡、不省人事；. 在空气、水分和光的作用下,酸度增加,因而对金属有剧烈的腐蚀性乙醚. 透亮、无色、易挥发有芳香刺激性气味的液体；沸点：；对人体有麻醉性能；当吸入含量为 3.5% 时, 3040 分钟就可失去知觉；. 人体过量吸入,会引起严峻的急性中毒；呼气中带醚味,并显现呕吐、出汗、喷嚏、咳嗽、头痛

3、、记忆力减退、无力、兴奋；. 微溶于水,易溶于盐酸,能与醇、醚、石油醚、苯、氯仿等有机溶剂混溶；应储存于阴凉、干燥、通风的低温库房内,库温最好掌握在 防止阳光直射；25以下；远离热源、火种,. 本品易燃；与强氧化剂反应能起火爆炸；在空气中与氧长期接触或受光照会生成不稳固的过氧化物,受热能自行着火爆炸；着火时,可用干粉、泡沫、二氧化碳、沙土灭火；用水灭火无效,但可用水保持火场容器冷却；乙醇. 无色有酒味,易挥发的澄清液体；沸点：用于溶剂、清洗剂、分析试剂等；属微毒类,对眼睛黏膜有稍微刺激作用；名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页,共 20 页精选学习资料 - - - - - - -

4、 - - . 乙醇可使皮肤发干,长期受大剂量作用时,可使神经系统、消化器官等发生严峻的器质性疾病；. 易燃,手热或遇明火有燃烧爆炸危急,燃烧时,发出兰色火焰；蒸气能与空气形成爆炸性混合物,在火场中,受热的容器有爆炸的危急；着火时,用二氧化碳、雾状冰醋酸水、干粉、 1211 或抗泡沫灭火； 用水冷却火场中的容器,驱散蒸气, 赶出溢出液体,使其稀释成为不燃性混合物. 有酸性气味的无色透亮液体,沸点：；用于制造氯乙烯塑料、醋酐、有机醋酸酯、醋酸盐铅、铝、铜等及醋酸纤维；也可用于染料、制药、罐头食品、食品防腐、色素生产等工业；. 属低毒类,可经消化道、呼吸道、皮肤吸取,对眼、皮肤和上呼吸道有刺激作用；

5、眼睛接触：引起眼睑水肿、结膜充血；皮肤接触：轻者显现红斑,重者显现化学灼 伤,有水泡和疼痛；. 吸入：当空气中蒸气浓度不明时,应佩带有黄色色标滤毒盒罐的防毒面具；使 用时应有良好的通风条件和有效的防护用品,如有醋酸的泄露或溅污,应以碱液中 和,然后用水冲洗,经稀释的污水排入废水系统；注意试验过程中产生的废气、废液、废渣大多数是有害的,必需经过处理才能排放；少.量有毒气体可以通过排风设备排出室外,被空气稀释；毒气量大时,必需处理后再排出；如氧化氮、二氧化硫等酸性气体用碱液吸取；可燃性有机废液可于燃烧炉中 通氧气完全燃烧；. 大家在试验室里,接触到的化学试剂多半都有危害性,所以每个人都应当留意保

6、护自己,留意标准操作,同时对别人也是一种爱护,而不能由于图省事或者别的什 么缘由而放松对安全的留意；试验误差肯定误差 absolute error ：肯定误差是测量值与真实值之差； = x- ：肯定误差；x：测量值； ：真实值肯定误差是以测量值的单位为单位,肯定误差越小；可以是正值, 也可以是负值； 测量值越接近真实值,真实值是一个可以接近而不行到达的理论值；上式可以写成： = x- 说明在已知肯定误差值的情形下,真实值可以从测定值减去肯定误差而求得；相对误差 relative error：为了反映误差在测量结果中所占的比例,分析工作中常常使用相对误差；相 对误差是以真实值的大小为基础表示的误

7、差值,没有单位；名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页,共 20 页精选学习资料 - - - - - - - - - / =x- / 通常以 %, 或 ppm 表示；例如：测定纯NaCl 中 Cl 的百分含量为60.52%,而其真实含量理论值为60.66%；就 肯定误差 =60.52%-60.66% = -0.14% 相对误差 =60.52% - 60.66% / 60.66% 1000 = -2.3 假如不知道真实值,而知道肯定误差值,就相对误差也可以表示为：相对误差= 100% x 例如：用分析天平称两个重量,一个是, 另一个是, 两个重量的肯定误差都是,可是相对误差却大不相同

8、,一个是1/21 100%,另一个是 1/5432 100%；可见,由于两个被测组分含量高低不同,即使肯定误差相同, 相对误差也不同；对高含量组分测定的相对误差应当要求小些,低含量组分测定的相对误差要求答应大些；例如： 用重量法和滴定法测量样品主要成分,相对误差需要到达千分之一,而用比色法测定样品重微量成分时,相对误差只要求到达百分之几即可 2. 系统误差 系统误差 systematic error也叫 “ 可定误差 ” ,是由某种确定的缘由引起的,一般有固定的 方向正或负和大小,重复测定时重复显现；依据系统误差的来源,可分为：1 方法误差 方法误差是由于不适当的试验设计或所选方法不恰当所引起

9、的,通常影响较大；比方：滴定分析中终点与化学计量点不相符合、重量分析中沉淀的溶解度过大或有共沉淀等,都会产生误差；2 仪器或试剂误差是由于仪器未经校准或试剂不合规格引起的；例 准或试剂不纯等,均能产生这种误差；3 操作误差操作误差是由于分析者操作不符合要求引起的；例如：分析者对滴定终点颜色转变的判定才能不够高,如：天平砝码不准、容量仪器刻度不总是偏深或偏浅, 便会产生误差；由于系统误差是重复的以固定方向和大小显现,所以能用加校正值的方法加以排除,但不能用增加平行测定次数的方法排除；3.随机误差 accidental error : 也称偶然误差, 是由于偶然的缘由,如测量条件、试验室温度、湿度

10、等变动而未能得到掌握的条件波动引起的,其大小和正负都不固定；偶然误差的显现看起来好像没有规律,但多次测量就会发觉肯定值相同的正负偶然误差显现的概率大致相等,它们之间能完全或部分抵消；因此通过增加平行测定次数,就可以减免测定结果中这种误差；也可以通过统计学方法估量出偶然误差值,并在测定结果中予以正确表达；系统误差和偶然误差往往不能区分；比方： 在观看滴定终点的颜色变化时,有人总是偏深,产生系统误差；但多次测定中偏深程度不一样,又必定有偶然误差；5.提高分析精确度的方法1挑选恰当的分析方法不同方法的精确度和灵敏度不同；重量分析法和容量分析法灵敏度虽然不高,但对常量组分的测定可以获得比较精确的结果,

11、一般相对误差不超过千分之几；但对于微量和痕量组分的分析,常常做不出来,谈不上精确度；名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页,共 20 页精选学习资料 - - - - - - - - - 仪器分析法对测定常量组分无法精确,但对测定微量和痕量组分灵敏度很高,尽管相对误差较大,但肯定误差不大,能符合精确度的要求；总之,必需依据分析对象,样品情形以及对分析结果的要求,挑选恰当的分析方法；2减小测量误差为了保证分析结果的精确度,必需尽量减小各步的测量误差；例如：一般分析天平的称量误差为+0.0001g,用减重法称量两次,可能引起的最大误差是+0.0002g,为了使称量的相对误差小于0.1%,

12、取样量就不能小于0.2g；3排除测量中的系统误差A、校准仪器：对砝码、滴定管和移液管进行校准；B、做对比试验：用含量已知的标准试样或纯物质当样品进行分析,由分析结果和其已 知含量的差值,确定分析的误差；C、做空白试验：在不加样品的情形下,以与样品相同的方法、步骤进行分析,把所得的结果作为空白值从样品分析结果中减去；带进的误差； 0.0058 之类的数字；五、生物化学常用缓冲液一基本概念这样可以排除由于试剂不纯或容器不符合要求所 Bronsted-Lowry 酸碱理论酸碱质子理论: nsted 和英国化学家 T.M.Lowry 同时提出了酸碱质子学说,认为凡能释放质子的分子或离 子如： H2O,

13、HCl ,NH4+ ,HSO4- 等称为酸,凡能接受质子的分子或离子如：H2O,NH3 ,Cl-等称为碱；因此,一种酸释放质子后即成为碱,称为该酸的共轭碱,同样一种 碱与质子结合后,形成对应的酸,称为该碱的共轭酸；如盐酸在水中的解离：HCl Cl- H+ HCl 是酸, Cl- 是它的共轭碱；pH = pKa+log 质子受体 / 质子供体 缓冲体系的设计：1960 年, N.E.Good 和他的同事们提出,适合生命科学争论使用的缓冲体系应具有以下 特性： pKa 值在 6-8 之间； 在水中的溶解度高； 不易穿透生物膜； 盐效应小； 离子浓度、溶液组成和温度对解离的影响小； 不与金属离子生成

14、复合物或沉淀； 该缓冲剂化学稳固； 紫外和可见光波长范畴内光吸取小； 易制得高纯度的盐；二生物化学常用缓冲液 磷酸盐缓冲液：名师归纳总结 磷酸盐是生物化学争论中使用最广泛的一种缓冲剂,由於它们是二级解离,有二个 pKa第 4 页,共 20 页值,所以用它们配制的缓冲液,pH 范畴最宽：NaH2PO4 ：pKa12.12,pKa27.21 - - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 配酸性缓冲液：用 NaH2PO4,pH 1-4,配中性缓冲液：用混合的两种磷酸盐,pH6-8,SDS-聚丙烯酰胺凝胶配碱性缓冲液：用 Na2HPO4,pH 10-12；用钾盐比钠盐好,

15、由于低温时钠盐难溶,钾盐易溶, 但假设配制电泳的缓冲液时,只能用磷酸钠而不能用磷酸钾,由于 生成难溶的十二烷基硫酸钾；磷酸盐缓冲液的优点为：简洁配制成各种浓度的缓冲液；适用的 pH 范畴宽；pH 受温度的影响小；SDS十二烷基硫酸钠会与钾盐缓冲液稀释后pH 变化小,如稀释十倍后pH 的变化小于0.1；其缺点为：易与常见的钙Ca+离子、镁Mg+ 离子以及重金属离子缔合生成沉淀；会抑制某些生物化学过程,如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制作用； Tris三羟甲基氨基甲烷缓冲液：Tris 缓冲液在生物化学争论中使用的越来越多,有超过磷酸盐缓冲液的趋势,如在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中已都使用

16、Tris 缓冲液,而很少再用磷酸盐；Tris 缓冲液的常用有效 pH 范畴是在 “ 中性 ”范畴,例如：Tris-HCl 缓冲液的优点是：由于 Tris 的碱性较强,所以可以只用这一种缓冲体系配制大范畴 pH 值的缓冲液；pH 范畴由酸性到碱性的对生物化学过程干扰很小,不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀；其缺点是：缓冲液的 pH 值受溶液浓度影响较大,缓冲液稀释十倍,pH 值的变化大于 0.1；温度效应大, 温度变化对缓冲液 pH 值的影响很大, 例如： 4时缓冲液的 pH 8.4,而 37时的 pH7.4,所以肯定要在使用温度下进行配制,室温下配制的 Tris-HCl 缓冲液不能用于 0-4

17、；易吸取空气中的CO2,所以配制的缓冲液要盖严密封；Tris 溶液具有兼容性此缓冲液对某些pH 电极发生肯定的干扰作用,所以要使用与的电极； 有机酸缓冲液：这一类缓冲液多数是用羧酸与它们的盐配制而成,pH 范畴为酸性,即pH3.0-6.0,最常用的是甲酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸等；有机酸缓冲液的缺点是：全部这些羧酸都是自然的代谢产物,因而对生化反应过程可能发生干扰作用；柠檬酸盐和琥珀酸盐可以和过渡金属离子受到干扰；Fe3+、Zn+、Mg+ 等结合而使缓冲液这类缓冲液易与Ca+离子结合,所以样品中有Ca+离子时,不能用这类缓冲液； 硼酸盐缓冲液：常用的有效 pH 范畴是： pH8.5-10.0,因

18、而它是碱性范畴内最常用的缓冲液,其优点 是配制便利, 只使用一种试剂,缺点是能与很多代谢产物形成络合物,特别是能与糖类的羟 基反应生成稳固的复合物而使缓冲液受到干扰；名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页,共 20 页精选学习资料 - - - - - - - - - 氨基酸缓冲液：此缓冲液使用的范畴宽,可用于pH=2.0-11.0 ,例如最常用的有：甘氨酸 -HCl 缓冲液： pH=2.0-5.0 ,甘氨酸 -NaOH 缓冲液： pH=8.0-11.0 ,甘氨酸 -Tris 缓冲液： pH=8.0-11.0 ,广泛使用的 液,组氨酸缓冲液：pH=5.5-6.5 ,SDS-聚丙烯酰胺

19、凝胶电泳的电极缓冲此类缓冲体系的优点是：为细胞组份和各种提取液供应更接近的自然环境；其缺点是：与羧酸盐和磷酸盐缓冲体系相像,也会干扰某些生物化学反应过程,如代谢过程等；试剂的价格较高；六、 pH 值的测定测定溶液 pH 值通常有两种方法,最简便但较粗略的方法是用pH 试纸,分为广泛和精密pH试纸两种；广泛 pH 试纸的变色范畴是 pH=1-14 、9-14 等,只能粗略确定溶液的 pH 值；精密 pH 试纸, 可以较精确地测定溶液的 pH 值,其变色范畴是 2-3 个 pH 单位,例如有 pH=1.4-3.0 、5.4-7.0、9.5-13.0 等很多种,可依据待测溶液的酸、碱性选用某一范畴的

20、试纸；测定的方法是将试纸条剪成小块,用镊子夹一小块试纸,用玻璃棒蘸少许溶液与试纸接触,试纸变色后与色阶板对比,估读出所测 染样品溶液；紫外可见分光光度法 一、基本原理一 Beer-Lambert 定律pH 值；切不行将试纸直接放入溶液中,以免污当一束单色光通过溶液时,由于溶液吸取了一部分光能,光的强度就会减弱；设入射光的强度为 I0,透过浓度为 c,液层厚度为 b 的溶液后,透射光的强度 I 必定小于 I0,随浓度和厚度的增加, 光被吸取的程度亦增加,透射光的强度就减小；透射光强度与入射光强度的比值,称为透光度 transmittance,以 T 表示；试验证明,当液层厚度 b 和溶液浓度 c

21、 按算术级数增加时,透光度 T 按几何级数减小,数学式为：A -lgT abcA：吸光度,又称光密度“ ”；T：透光度,TI / I ；a：吸光系数 Lmol1 cm1；比例常数,称吸光系数b：样品光程 cm,通常使用 1.0cm 的吸取池,就 b=1cm；c：样品浓度 mol/L ；吸光度与液层厚度和溶液浓度的乘积成正比,称为朗伯比尔定律,简称比尔定律, 即光的吸取定律；其数学表达式为：A=abc吸光度 “A” 有一个重要性质是其具有加和性：即混合物的总吸光度等于溶液中的各组份各悠闲该波长下吸光度的算术和；这是多元混合物分光光度法定量分析的基础；假设溶液中各溶质的吸光系数 相同,就各溶质吸光

22、度的大小与溶质浓度成比例； 103 M-1cm ,运算其摩尔浓度；L；A bC A溶剂加样品的吸光度溶剂的吸光度名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页,共 20 页精选学习资料 - - - - - - - - - b 1cm 10-5 mol / L 吸取池使用留意事项： 要完全清洗,特别是盛过蛋白质等溶液,干后形成一层膜,不易洗去,通常杯子不 用时可放在 1洗洁净液中浸泡,去污成效好,使用时用水冲洗洁净,要求杯壁不挂水珠,仍可以用绸布丝线或软塑料制作一个小刷子清洗杯子； 严禁用手指触摸透光面,因指纹不易洗净； 严禁用硬纸和布擦拭透光面,只能使用镜头纸和绸布； 严禁加热烘烤； 急用

23、干的杯子时, 可用酒精荡洗后用冷风吹干；决不行用超声波清 洗器清洗；三、分光光度法的定性与定量方法一定性方法：一系列不同波长的单色光照耀待测溶液,可测的一系列相应的吸光度；以吸光度为纵 坐标,以波长为横坐标作图,可以得到待测物质的吸取曲线；通过与标准品比较而定性；二定量方法：依据比尔定律, 物质在肯定波特长的吸光度与浓度之间有线性关系；因此, 只要挑选一 定的波长测定溶液的吸光度,即可求出浓度；1.吸光系数法肯定法 ：依据比尔定律A= c l ,假设l 和吸光系数 或E1%1cm 已知,即可依据测得的A ,求出被测物的浓度；C = A / l 通常 或 E1%1cm 可以在手册或文献中查到；例

24、如见课本 P10. 2.标准曲线法 : 在有些情形下, 如单色光不纯等情形, 测得的吸光值随所用仪器不同而有相当大的变化；假设此时用吸光系数换算成浓度,将产生很大的误差；但假如只用一台固定的仪器,就可认定在固定的工作状态和测定条件下,浓度与吸光度之间的关系在很多情形下是线性关系或接近于线性关系；A=KC K 只为比例常数,而非物质常数依据上式的关系进行定量是分光光度法中比较简便易行的方法；标准曲线的制作1配置一系列浓度不同的标准溶液；2在测定条件相同的情形下,分别测定其吸光度；3以标准溶液浓度为横坐标不必考虑显色剂等引起的浓度变化,以相应的吸光度为纵坐标,绘制A-C 关系图；4在相同条件下测出

25、样品溶液的吸光度,从标准曲线上查出浓度；离心机的使用1.使用各种离心机时,必需事先在天平上精密地平稳离心管和其内容物,平稳时重量之 差不得超过各个离心机说明书上所规定的范畴,每个离心机不同的转头有各自的答应差值,转头中肯定不能装载单数的管子,当转头只是部分装载时,管子必需相互对称地放在转头中,以便使负载匀称地分布在转头的四周；2.离心前必需认真检查转头各孔内有无异物；名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页,共 20 页精选学习资料 - - - - - - - - - 3.假设要在低于室温的温度下离心时；室内预冷；转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头4.装载溶液时,要依据各种离

26、心机的详细操作说明进行,依据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管,有的离心管无盖,液体不得装得过多,以防离心时甩出,造成转头不平衡、生锈或被腐蚀,而制备性超速离心机的离心管,就常常要求必需将液体装满,以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形；每次使用后,必需认真检查转头,准时清洗、擦干,转头是离心机中须重点爱护的部件,搬动时要当心, 不能碰撞, 防止造成伤痕, 转头长时间不用时,要涂上一层上光腊爱护,严禁使用显著变形、损耗或老化的离心管；5.离心过程中不得随便离开,应随时观看离心机上的外表是否正常工作,如有反常的声音应立刻停机检查,准时排除故障；6.每个转头各有其最高答应转速和使用累积限时,使用转

27、头时要查阅说明书,不得过速使用； 每一转头都要有一份使用档案,记录累积的使用时间,假设超过了该转头的最高使用限时,就须按规定降速使用；7.离心时不准开盖,不准用手停止转头；移液器的使用设定移液体积从大体积调剂到小体积时,为正常调剂方法,逆时针旋转刻度即可；从小体积调剂至大体积时,可先顺时针调至超过设定体积的刻度,再回调至设定体积,这样可以保证最正确的精确度；装配移液器吸头单道移液器,将移液端垂直插入吸头,左右微微转动,上紧即可用移液器反复撞击吸头来上紧的方法是不行取的,这样操作会导致移液器部件 因剧烈撞击而松散,严峻的情形会导致调剂刻度的旋钮卡住；多道移液器,将移液器的第一道对准第一个吸头,倾

28、斜插入,前后稍许摇动上紧,吸头插入后略超过 O 型环即可；养护：1、如液体不当心进入活塞室应准时清除污染物；2、移液器使用完毕后,把移液器量程调至最大值,且将移液器垂直放置在移液器架上；3、依据使用频率全部的移液器应定期用肥皂水清洗或用 蒸水清洗并晾干；4、防止放在温度较高处以防变形致漏液或不准；5、发觉问题准时找专业人员处理； 留意事项60 的异丙醇消毒,再用双1、当移液器吸嘴有液体时切勿将移液器水平或倒置放置,以防液体流入活塞室腐蚀移液器 活塞；名师归纳总结 - - - - - - -第 8 页,共 20 页精选学习资料 - - - - - - - - - 2、正确使用移液器吸液、排液,以

29、达高精准度；特别留意排液的 3、平常检查是否漏液的方法：2 、 3 操作；吸液后在液体中停 1-3 秒观看吸头内液面是否下降；假如液面下降第一检查吸头是否有问题,如有问题更换吸头,更换吸头后液面仍下降说明活塞组件有问题,应找专业修理人员修理；4、 需要高温消毒的移液器应第一查阅所使用的移液器是否适合高温消毒后再行处理；酪蛋白的制备原理：等电点沉淀挑选性沉淀利用蛋白质在等电点时留意：调剂溶液到蛋白质等电点时,可以使蛋白质溶解度出来；40水浴预热 10 分钟 HAC 缓冲液同时预热用滴管加入 HAC 缓冲液约 2ml离心, 3000 转/分, 15 分钟1、布朗运动加速蛋白分子的碰撞2、等电点邻近

30、蛋白质的溶解度最低用 4ml 蒸馏水洗涤离心,3000 转/分, 15 分钟除去沉淀中的可溶部分95%乙醇洗涤离心,2500 转/分, 10 分钟除去沉淀中的脂类物乙醚 2ml 洗涤离心, 2500 转 /分, 10 分钟脱水0.1N NaOH 2ml 溶解加水至 10ml 溶解度最低 的性质；最低 ,但是并不意味着蛋白质会沉淀酪蛋白是酸性蛋白质,溶解于碱性溶液中,便利下次双缩脲法测定名师归纳总结 - - - - - - -第 9 页,共 20 页精选学习资料 - - - - - - - - - 牛乳2ml40水浴预热 10分钟HAC缓冲液同时预热用滴管加入 HAC缓冲液约 2ml离清液 沉淀

31、用 4ml 蒸馏水洗涤离心,3000转/分,15分钟清液 沉淀95%乙醇洗涤离心,2500转/分,10分钟清液 沉淀乙 醚 2ml 洗 涤 离 心 ,2500转/分,10分钟清液 沉淀加水至 10ml待测名师归纳总结 - - - - - - -第 10 页,共 20 页精选学习资料 - - - - - - - - - 双缩脲法测定蛋白质浓度 一、试验目的3. 把握双缩脲法测定蛋白质含量的方法 二、原理一、分光光度法的基本原理及方法一利用吸取光谱对物质进行定性分析2主要方法：1比较吸取光谱曲线2比较最大吸取波长 蛋白质的最大吸取波长为 280nm,核酸的最大吸取波长为 260nm 3比较吸光度的

32、比值二利用吸取光谱对物质进行定量分析 1原理 Beer-Lambert比尔定律：T=I/I0 A=lg1/T=lgI0/I A=KCL 其中：T 为透光率； A 为吸光率； I0 为入射光强度； I 为透射光强度；K 为吸取系数； C 为溶液浓度； L 为溶液光程的厚度名师归纳总结 - - - - - - -第 11 页,共 20 页精选学习资料 - - - - - - - - - 2常用方法1标准曲线法 . 标准曲线与样品的测定条件必需一样；2标准管法 CX/AX=CS/AS ,已知 CS,测定 AS、AX ,可求得 CX ；3摩尔吸光系数法 C=A/ 为 L=1cm,C 为 1 mol/L

33、 时的吸光系数,也称为 摩尔吸光系数； 打开电源开关,使仪器预热 20 分钟 用“波长设置 ” 按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上 打开样品室盖,将挡光体插入比色皿架,并将其推或拉入光路 盖好样品室盖,按 “0%T”键调透射比零 取出挡光体,盖好样品室盖,按“100%T” 调 100%透射比 按“方式键 ” MODE将测试方式设置为吸光度方式 A 将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中 打开样品室盖,将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中,盖上样品室盖 将参比溶液推入或拉入光路中,按“100%T”调零 A 将被测溶液拉入光路中,此时,显示器上所显示是被测样品的吸 光度参数试验完成后,关闭电

34、源,洗净比色皿 ,并盖好盖布；名师归纳总结 - - - - - - -第 12 页,共 20 页精选学习资料 - - - - - - - - - 肝脏 DNA 的粗提取破裂细胞提取核蛋白 DNA 核蛋白和 RNA 核蛋白别离蛋白和核酸别离原就低温：抑制 DNA 酶的活性操作柔和：防止 DNA 断链DNA 别离纯化的原理 DNA 或 DNP 在 0.14MNaCl 盐溶液中溶解度很低,而 RNA 就溶于0.14MNaCl 盐溶液,利用这一性质可将生物组织中的 DNA 与 RNA 分开DNA 在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的,因此提取脱氧核 糖核蛋白复合物 -DNP 后,必需将其中蛋白去

35、除其中蛋白质部分可用SDS 使之变性除去同时破坏核酸分解酶 ；进一步纯化就利用氯仿 -异戊醇震荡除蛋白,震荡时,蛋白质变性,形成 凝胶,并与 DNA 分开, DNA 就留在水层中；利用 DNA 不溶于乙醇,因而用乙醇将 离心机的使用 平稳 对称放入,盖上盖 设定转速、时间 离心开头 完全停止后开盖DNA 从溶液中沉淀出来；试验步骤 0.15mol/L EDTA 溶液,置匀浆器中研磨； 初步破裂细胞；已做2、取一支 5mlEP 管,装入糊状物基本装满 ,离心 5min10000rpm,弃去上清液沉淀用 0.14mol/l NaCl-0.15mol/l EDTA 溶液洗三次； 每次加入溶液后用吸

36、管吹打匀称再离心同上 ,直到上清液无血细胞；弃上清液,所得沉淀为DNPDNA 蛋白复合物粗制品 0.15mol/L EDTA 溶液 5ml,分装于 2 支 10mlEP 管,然后每管滴加 25%SDS 溶液 0.5mL,边加边振荡；加毕,置 60水浴 20min 不停振 荡,直至溶液变得粘稠并略透亮,取出冷却至室温；此步骤使核酸与蛋白质别离；4、每管加入 5 mol/l NaCl 溶液 1mL,蝴蝶形振荡 5min；加入约 1 倍体积的氯仿 异戊醇混合液,蝴蝶形振荡 此步骤后溶液分三个相：上层水相机相和残余的 RNA ；10min,离心 10min4000rpm；DNA ；中层变性蛋白质相；下

37、层有2 倍体积的 95%乙醇, DNA 沉淀析出,离心 4000rpm10 分钟名师归纳总结 用玻棒搅出的丝状物就为粗DNA 第 13 页,共 20 页- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 血糖的测定原理.无蛋白血滤液 葡萄糖.碱性铜试剂 CuOH 2.磷钼酸试剂 磷钼酸葡萄糖 CuOH2 Cu2OCu2O 磷钼酸 钼蓝钼蓝的蓝色深浅与葡萄糖的含量成正比 ,用比色法可测定血糖的含量操作 . 临床意义mg/dl正常 疑心 糠尿病空腹血糖110 110-139140 餐后两小时血糖140 140-199200 服糖后两小时糖140 140-199200 1、

38、无蛋白血滤液的制备：取干试管一支,精确加入蒸馏水 3.5ml,血液 0.1ml,2/3NH2SO40.2ml,10Na2WO4 0.2ml,混匀,待有澄清液显现后,过滤,收集滤液备用编号标准管测定管空白管标 准 葡 萄 糖液1.0ml = 0.025mg无 蛋 白 滤 液ml蒸馏水 ml碱 性 铜 试 剂ml名师归纳总结 - - - - - - -第 14 页,共 20 页精选学习资料 - - - - - - - - - 充分摇匀,置沸水浴精确煮沸 磷 钼 酸 试 剂ml混匀,放置 3 分钟蒸馏水 ml8 分钟,取出切勿摇动,置于冷水浴冷却.将各试管摇匀后,用红色滤光片或 620nm,以空白管

39、校零点,比色；课后摸索题.Folin-吴法测定血糖的优缺点是什么？.进行比色法测定时,假如测得样品的质粒 DNA 的提取 试验目的A 值超过 100%,该如何处理,为什么？把握：质粒 DNA 提取的原理和方法；熟识：碱裂法提取质粒的基本操作步骤；明白：质粒小抽提取试剂盒的组成和试验原理；试验原理在碱性环境中, 线性的大分子量细菌染色体DNA 变性,共价闭环质粒 DNA 虽然氢键也发生断裂,但两条互补链仍会紧密缠绕结合在一起；将 pH 调至中性并有高盐浓度存在的条件下, 染色体 DNA 之间交联形成不溶性网状结构；大部分DNA 和蛋白质在去污剂SDS 的作用下形成沉淀,质粒DNA快速复性,仍旧为

40、可溶状态；名师归纳总结 通过离心,可去除大部分细胞碎片染色体DNA 、RNA 及蛋白质,质粒DNA第 15 页,共 20 页尚在上清中,别离上清,用两倍体积乙醇沉淀质粒DNA ；- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 试验步骤加 5mL 培育物于 10 mL EP 管, 12000 r/min 2min 除去上清,加入 100 L 溶液 I,中悬浮细菌沉淀,并转入 加入 200L 溶液 II,快速颠倒数次,冰浴 2 min 1.5 mL EP 管中；加入 150L 溶液 III ,温顺振荡 10s,冰浴 5min,12000 r/min 5min 转移上清到

41、新EP 管,加入等体积酚/氯仿/异戊醇,温顺振荡,抽提2 次,12000r/min 2min 上层水相转移到新 EP 管,加入 2 倍体积无水冰乙醇 -20 冰箱中放置,颠倒混匀, 12000r/min 10 min 弃上清,沉淀中加1 mL70%乙醇, 12000g 2min - 20 储存、待用 ；去上清,沉淀物于37 恒温箱中干燥至透亮状,后于主要试剂及作用溶液：由葡萄糖、 EDTA、Tris-HCl 组成 爱护、缓冲 葡萄糖的作用是增加溶液的粘度悬浮细胞 EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子 解作用爱护作用 Tris-HCl 使溶菌液维护溶菌作用的最适, 防止 DNA 酶对质粒分子的降 PH 范畴缓冲作用溶液 II ：由 SDS十二烷基硫酸钠与 NaOH 组成 裂解、变性 SDS：？ NaOHpH12：破坏细胞膜,裂解细胞 溶液 III ：HAc 和 KAc 组成的高盐溶液 复性,别离 HAc 溶液能中和溶液的碱性, 使染色体 DNA 变性而发生缠绕, 并使质 粒 DNA 复性； KAc 会与 SDS 形成溶解度很低的盐,并与蛋白质形成沉淀而除去；溶液中的 DNA 也会与蛋白质 -SDS 复合物缠绕成大分子而与小分子质粒 别离；DNA试验结果及争论；PCR 技术聚合酶链式反应 PCR概述名师归纳总结