慢性肾炎湿热证系膜细胞凋亡及尿表皮生长因子变化实验的研究——慢肾蛋白停对系膜增生性肾小球肾炎湿热证模型大鼠系膜细胞凋亡和尿表皮生长因子影响.pdf

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1、慢性肾炎湿热证系膜细胞凋亡及尿表皮生长因子变化的实验研究 4英文缩略词表 英文缩略词表 EGF Epidermal growth factor 表皮生长因子 EGFR Epidermal growth factor receptor 表皮生长因子受体 BSA Bovine serum albumin 牛血清白蛋白 MsPGN Mesangial proliferative glomerulonephritis 系膜增生性肾小球肾炎 GMC Glomerular mesangial cell 系膜细胞 GBM Glomerular basement membrane 肾小球基底膜 MM Mesa

2、ngial matrix 系膜基质 ECM Extracellular matrix 细胞外基质 IL Interleukin 白介素 ET Endothelin 内皮素 TNF Tumor necrosis factor 肿瘤坏死因子 IFN Interferon 干扰素 LPS Lipopolysaccharide 脂多糖 LDL Low density lipoprotein 低密度脂蛋白 HDL High density lipoprotein 高密度脂蛋白 OX-LDL Oxidized LDL 氧化型低密度脂蛋白 SOD Superoxide dismutase 超氧化物歧化酶 T

3、GF Transforming growth factor 转化生长因子 ACEI Angiotensin converting enzyme inhibitor 血管紧张素转换酶抑制剂 ICAM Intercell adhesion molecule 细胞间粘附分子 PGN Proliferative glomerulonephritis 增生性肾小球肾炎 CGN Chronic glomerulonephritis 慢性肾小球肾炎 慢性肾炎湿热证系膜细胞凋亡及尿表皮生长因子变化的实验研究 1中文摘要 中文摘要 目的目的：研究慢性肾炎湿热证肾小球系膜细胞凋亡和尿表皮生长因子（EGF）的变化特

4、征及中药复方慢肾蛋白停对实验性大鼠系膜增生性肾炎湿热证肾小球系膜区细胞凋亡及尿 EGF 的影响。探讨中药复方慢肾蛋白停治疗系膜增生性肾小球肾炎湿热证的作用机制。 方法:方法: 采用手术摘除一侧肾脏加腹腔多次注射牛血清白蛋白（BSA）与大肠杆菌内毒素（LPS）及皮下多次注射完全弗氏佐剂，复制系膜增生性肾小球肾炎湿热证动物模型。分四组（正常组、模型组、肾炎四味片组、慢肾蛋白停组）进行对比研究。实验末检测24小时尿蛋白定量，血清Cr、血清BUN含量,放射免疫法测定尿EGF含量；TUNEL法检测系膜细胞凋亡现象；HE染色，光镜观察肾脏组织病理形态学改变。观察中药复方慢肾蛋白停对模型大鼠尿蛋白、尿EGF

5、、血清Cr、血清BUN及系膜细胞凋亡的影响。 结果结果：1.模型组大鼠出现尿道口红肿，皮下水肿，眼睑浮肿，蛋白尿，尿量减少等病理表现，具有湿热证的特征；24小时尿蛋白定量、血尿素氮、肌酐、尿EGF含量均增高，与正常组、蛋白停组比较有显著性差异(P0.05)。 2.通过慢肾蛋白停治疗，模型大鼠系膜细胞凋亡率增高，尿EGF水平下降，与正常组、模型组比较差异具有显著性(P0.05)。 3. 慢肾蛋白停组24小时尿蛋白定量、系膜细胞凋亡率与肾炎四味片组比较有显著差异（p0.05）。 结论：结论：采用改良法建立的系膜增生性肾炎动物模型，具有与人类系膜增生性肾小球肾炎湿热证类似的病理特征，模型复制成功。慢

6、肾蛋白停是治疗系膜增生性肾小球肾炎的有效方药。该方可以调节肾内EGF的异常分泌状态，显著降低尿蛋白，有效改善肾功能，抑制系膜细胞增生和基质的增多, 明显减轻肾脏组织的病理损害。调控系膜细胞凋亡与调节肾内EGF的异常分泌状态可能是慢肾蛋白停治疗湿热型系膜增生性肾炎多靶点效应的部分机制。 关键词关键词：系膜增生性肾炎 表皮生长因子 细胞凋亡 湿热证 慢性肾炎湿热证系膜细胞凋亡及尿表皮生长因子变化的实验研究 2ABSTRACT Objective To investigate the change of the apoptosis ratio of mesangial cells and the l

7、evel of urinary EGF in damp-heat syndrome of mesangial proliferative glomerulonephritis and observe the protective effect of the recipe of Manshendanbaiting (DBT) on damp-heat syndrome of mesangial proliferative glomerulonephritis in rats model; And to explore the corresponding mechanism of treatmen

8、t effect of DBT. Methods Damp-heat syndrome of mesangial proliferative glomerulonephritis was induced by being cut one side kidney and injection of BSA and complete Freunds adjuvant. A total of 40 male SD rats were randomly divided into four groups(model control group,normal control group, shenyansi

9、weipian group, DBT group). Quantity of 24 hour urinary protein excretion、EGF，the level of serum Cr、Bun,and pathological changes of kidney were examined at the end of the experiment. pathological changes of kidney stained by HE was observed by light microscopy. Apoptosis of mesangial cell was confirm

10、ed by TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling)method. Results 1. Quantity of 24 hour urinary protein excretion, the level of serum Cr and Bun ，the level of urinary EGF were increased in model group, the difference was obvious compared with normal and DBT group. 2.

11、The apoptosis ratio of mesangial cells was increased in DBT and shenyansiweipian group,compared with model and normal group,the difference was significant(P0.05). 3.The apoptosis ratio of mesangial cells in DBT group was higher than that in shenyansiweipian group and quantity of 24 hour urinary prot

12、ein 慢性肾炎湿热证系膜细胞凋亡及尿表皮生长因子变化的实验研究 3excretion in DBT group was less than that in shenyansiweipian group(P0.05) conclusion DBT can obviously suppress MC proliferative and maxtrix accumulation ,decrease quantity of 24 hour urinary protein excretion ,improve renal function and pathological changes in dam

13、p-heat syndrome of MsPGN of rats. DBT has a obviously protective effect on damp-heat syndrome of MsPGN in rats.The probably mechanism is through promoting MC apoptosis and regulating the excretion of cytokines in renal . Keywords MsPGN EGF Apoptosis Dampness-heat syndrome 慢性肾炎湿热证系膜细胞凋亡及尿表皮生长因子变化的实验研

14、究 5前言前言 系膜增生性肾炎(MsPGN)是一组病理上以弥漫性肾小球系膜细胞增生及不同程度系膜基质增多为主要特征的肾小球疾病。 系膜增生性肾小球肾炎(含 IgA介导的 MsPGN)是我国肾小球疾病中常见的病理类型。成人约占 57-69.9，小儿约占 36.4，超过 30%的 IgA 介导的 MsPGN 患者将进展到终末肾功能衰竭1。MsPGN 作为病理形态学诊断，其临床类型涉及范围广，发病率高，最终导致肾小球硬化、肾功能衰竭，是严重危害人民健康的主要肾脏疾病。目前临床上治疗 MsPGN 除激素、细胞毒药物外尚无特效的治疗方法，此类药物并非对所有病人都有效，且长期应用具有一定的毒副作用。因此寻

15、找一种疗效佳，毒副作用小的治疗方案是当今医学界的重要课题。中医药长期以来在治疗系膜增生性肾小球肾炎方面表现出其独特优势，随着肾活检穿刺技术的广泛开展，中医对MsPGN 的临床和实验研究得到快速发展，筛选出许多有一定疗效的单味中药和中药复方，它们均能通过不同的作用机制减轻肾脏病理损害，改善肾功能。 大量的研究都发现细胞凋亡在肾小球肾炎、肾小管疾病以及继发性肾脏疾病等肾脏疾病发病机制中有重要作用，并且参与许多肾脏疾病的发展2。细胞凋亡是增殖性肾小球肾炎中肾小球细胞增多的主要缓解机制3。临床研究和实践显示，调控凋亡可能是多种治疗药物发挥有效治疗作用的主要机制；中医药在整体观和辨证论治思想的指导下，以

16、其复方多靶点综合调节的优势在防治肾小球疾病方面发挥重要作用。 慢性肾炎是一种自身免疫性疾病,其发病机理甚为复杂, 近年来的研究证实,免疫细胞及肾小球细胞产生的细胞因子积极参与了肾炎病变过程。 在肾炎病变中,除疾病状况下浸润的白细胞外,几乎所有肾脏固有细胞,包括肾小球系膜细胞、上皮细胞、内皮细胞等,均具有产生细胞因子的能力,同时肾组织细胞又是细胞因子生物学作用的靶细胞,使肾小球病理变化加剧,引起肾小球组织结构及功能异常。探讨细胞因子与慢性肾炎的发生、发展及预后的关系一直都是医学界的研究热点。表皮生长因子(EGF)是细胞因子网络中的众多重要因子之一。目前相关的研究尚少，有必要深入探讨其在肾小球疾病

17、的发生、发展及预慢性肾炎湿热证系膜细胞凋亡及尿表皮生长因子变化的实验研究 6后中发挥的重要作用。 “证”是一个具中医学特色的概念。中医证的相关研究一直都是中医药研究的热点，同时也是研究的难点。现代病证结合的研究方法和思路为证的研究注入新的内容，使证的研究得到深入和发展。病证结合动物模型的建立为研究提供了重要工具。本研究借鉴前人的经验复制系膜增生性肾小球肾炎湿热证病证结合动物模型，从病证结合的角度研究慢性肾炎湿热证在系膜细胞凋亡与表皮生长因子方面的中医证候特点。 既往研究显示中药复方慢肾蛋白停具有清化湿热、益气活血通络的功效, 能减少尿蛋白 ,提高白细胞表面 Fc 受体表达,促进免疫复合物的清除

18、并改善相关指标,能减缓肾组织病理变化、阻止病情发展。另外,它能提高实验家兔血清SOD 活性、降低 TG、MDA 水平，升高 HDL 水平4。慢肾蛋白停通过调节机体的免疫功能状态,减少肾损害,显示了其对慢性肾炎湿热证的良好防治作用，有必要进一步探讨其作用机制。 本课题通过研究系膜增生性肾小球肾炎湿热证病证结合动物模型的系膜细胞凋亡和尿表皮生长因子的病理变化特点，探讨细胞凋亡和 EGF 在系膜增生性肾小球肾炎湿热证发病机制中的重要作用。同时给予复方中药慢肾蛋白停预防性治疗，探讨慢肾蛋白停在防治系膜增生性肾炎湿热证方面的作用机制及其优势。 慢性肾炎湿热证系膜细胞凋亡及尿表皮生长因子变化的实验研究 7

19、实验部分 实验部分 1 实验材料 1 实验材料 1.1 实验动物1.1 实验动物 SD 大鼠 50 只，雄性，6-8 周龄，体重(180 士 20)g，由安徽医科大学实验动物中心提供。 1.2 药物与试剂 1.2 药物与试剂 1.2.1 药物 1.2.1 药物 慢肾蛋白停：由黄芪、粉防己（不含马兜铃酸）、石韦、山楂、桃仁、乌蛇等12味中药组成。饮片购自百姓缘大药房，水煎煮，过滤，连续两次，合并滤液浓缩制备成含生药浓度为2.7g/ml煎剂，4冰箱保存。 肾炎四味片： 湖北亿雄祥瑞药业有限公司生产， 批准文号： 国药准字 Z42021945 1.2.2 试剂 1.2.2 试剂 尿蛋白定量试剂盒 南

20、京建成生物工程研究所提供 批号：20051118 尿素氮测定试剂盒 南京建成生物工程研究所提供 批号：20051028 肌酐测定试剂盒 南京建成生物工程研究所提供 批号：20051107 EGF放射免疫检测试剂盒 北京北方生物技术研究所提供 批号：20051130 细胞凋亡检测试剂盒 武汉博士德生物工程有限公司 批号：20051205 慢性肾炎湿热证系膜细胞凋亡及尿表皮生长因子变化的实验研究 8弗氏完全佐剂 Sigma公司提供 批号：20050925 牛血清白蛋白 ROCH公司提供 批号：20050830 大肠杆菌内毒素 Sigma公司提供 批号：20050930 尿蛋白定性试纸 桂林中星生物

21、技术发展有限公司 批号：20040315 1.3 主要实验仪器 1.3 主要实验仪器 751紫外可见分光光度计 上海分析仪器厂生产 TGL-168离心沉淀器 上海安亭科学仪器厂 HH-S电热恒温水浴箱 上海医用恒温设备厂 Olympus光学显微镜 日本Olympus公司生产 FM-157全自动放免仪 中国科大中佳公司生产 Leitz1512型切片机 德国生产 慢性肾炎湿热证系膜细胞凋亡及尿表皮生长因子变化的实验研究 92 实验方法2 实验方法 2.1 动物分组 2.1 动物分组 从50只大鼠中随机分出10只作为正常对照组；其余40只施行手术切除左侧肾脏，术后有10只大鼠死亡。将30只术后成活大

22、鼠随机分为：模型组（10只） ； 肾炎四味片治疗组（10只） ；蛋白停组（10只） 。 2.2 动物模型的建立 2.2 动物模型的建立 参考贾慧等的改进造模方法5，选用牛血清白蛋白（BSA）作为异种抗原，大肠杆菌内毒素（LPS）作为致热原免疫动物。取160200 g雄性SD大鼠50只，适应性喂养1周，经测尿蛋白为阴性，腹腔注射戊巴比妥钠（2030 mgkg）麻醉，常规消毒后经背部切除左侧肾脏，休养1周。 预免疫：实验鼠足垫皮下注射完全弗氏佐剂0.1ml加BSA3mg，于1周末、2周末加强2次。3周末，腹腔连续4次注射BSA，间隔时间lh，注射剂量分别为每只05 mg、l.0 mg、 1.5 m

23、g、3.0 mg；次日晨加强 1次（2.0mg/只） 。 免疫：之后每日腹腔注射BsA，剂量从每只0.5 mg开始，每日增加0.5 mg至5.0 mg，继续每周加量 lmg。至10mg为止。 致热免疫：两周末腹腔注射大肠杆菌内毒素20mg/只，连续四天。 2.3 给药方法 2.3 给药方法 从造模开始时起，给予蛋白停组含蛋白停生药浓度为2.7g/ml的煎剂10ml/kg/d灌胃，肾炎四味片组给予肾炎四味片溶液(3mg/ml)10ml/kg/d灌胃，(按临床用药剂量的10倍给药)连续10周。正常对照组和模型组灌服等量生理盐水。 2.4 检测指标及方法 2.4 检测指标及方法 慢性肾炎湿热证系膜细

24、胞凋亡及尿表皮生长因子变化的实验研究 102.4.1 尿蛋白定性检测 2.4.1 尿蛋白定性检测 免疫后每周检测，尿蛋白试纸比色法检测。 2.4.2 24小时尿蛋白定量 2.4.2 24小时尿蛋白定量 实验末检测，于动物处死前1天，用代谢笼收集24小时尿液，二甲苯防腐，记录尿量，用考马斯亮蓝微量法测定尿蛋白浓度，计算24小时尿蛋白排泄量。 2.4.3 血清尿素氮、肌酐检测 2.4.3 血清尿素氮、肌酐检测 实验末处死动物前心脏取血，751紫外可见分光光度计测定。 2.4.4 尿EGF检测 2.4.4 尿EGF检测 实验末，处死前，代谢笼收集24小时尿，二甲苯防腐，取1ml20 0C保存备用，放

25、射免疫法测定。 2.4.5 肾脏组织病理形态观察 2.4.5 肾脏组织病理形态观察 实验末， 戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉， 取血后， 迅速摘除右侧肾脏，10%甲醛溶液4过夜固定，常规切片，HE染色。光镜(X400)下观察肾小球、肾小球囊腔、系膜及系膜基质的病理组织形态改变。 2.4.5 肾小球系膜细胞凋亡的检测 2.4.5 肾小球系膜细胞凋亡的检测 实验末，取各组大鼠肾组织10甲醛溶液4过夜固定，石蜡包埋，常规切片。 TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling).慢性肾炎湿热

26、证系膜细胞凋亡及尿表皮生长因子变化的实验研究 11法检测系膜细胞凋亡现象。 工作原理：细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和地高辛形成的衍生物标记到DNA的3-OH末端，通过生物标记的抗地高辛抗体反应后，再结合链酶亲和素-过氧化物酶（SABC） ，然后加入显色底物DAB予以显示。凋亡细胞的核呈黄色，可在显微镜下观察到着色的凋亡细胞 。 操作步骤： （1）切片常规脱腊入水。 （2）新鲜配制3H2O2 ，室温处理10分钟。蒸馏水洗涤2分钟，3次。（3）标本片加0.01M TBS1:200新鲜稀释蛋

27、白酶K37消化10分钟，0.01M TBS洗涤2分钟，3次。（4）标本片加标记缓冲液20ul/片，保持切片湿润。按每张切片取TdT和地高辛标记的脱氧核糖核苷酸（DIG-dUTP） 各1ul, 加入18ul标记缓冲液中， 混匀。 甩去切片上多余液体后加标记液， 20ul/片。置样品于湿盒中，37标记2小时。（5）0.01M TBS洗涤2分钟，3次。（6）加封闭液50ul/片，室温30分钟，甩掉封闭液，不洗。 （7）用抗体稀释液1：100稀释生物素化抗地高辛抗体，混匀后50ul/片加至标本片上。置样品于湿盒中，37反应30分钟。0.01M TBS洗涤2分钟，3次。（8）用抗体稀释液1：100稀释S

28、ABC， 混匀后50ul/片加至标本片上。 置样品于湿盒中， 37反应30分钟。 0.01M TBS洗涤5分钟，4次。(9)DAB显色：取1ml蒸馏水，分别加入DAB试剂盒中A、B、C试剂各一滴，混匀后加至标本片上，显微镜下观察显色。水洗。（10）苏木素轻度复染。0.01M TBS洗涤，蒸馏水洗涤。脱水，透明，封片。显微镜观察。结果判定：细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。光镜下计数200个肾小球系膜区细胞和阳性细胞（细胞核皱缩，内有棕色颗粒）计算阳性细胞比率。 2.5 统计学处理 2.5 统计学处理 计量资料以均数士标准差(XS)表示，两组间均数比较用t检验,组间均数比较用单因素方

29、差分析。数据均用Spss11.0统计软件处理。P0.05为有显著性差异。 慢性肾炎湿热证系膜细胞凋亡及尿表皮生长因子变化的实验研究 12 3 结果 3 结果 3.1 一般情况 3.1 一般情况 先将大鼠适应性饲养一周， 一周后， 腹腔注射戊巴比妥钠 （2030 mgkg）麻醉，常规消毒后经背部切除左侧肾脏，手术中因结扎失败死亡4只，术后大鼠又死亡6只，可能因为结扎不牢固及创伤过大。免疫造模过程无动物死亡；药物灌胃时，因操作不熟练，灌胃时肾炎四味片组死亡1只。造模后期 ，模型组大鼠出现明显的饮食、饮水及活动减少，毛色无光泽，尿道口红肿，皮下水肿，眼睑浮肿，蛋白尿，尿量减少具有肾炎湿热证候表现。蛋

30、白停组和肾炎四味片组与模型组比较有明显改善，饮食、饮水及活动如常，毛色有光泽，尿量基本如常。 3.2 尿蛋白定性 3.2 尿蛋白定性 免疫3周后，造模全部大鼠尿蛋白定性均呈阳性，程度从+ - +不等。正常组大鼠尿蛋白定性为阴性。结果提示造模基本成功。 3.3 各组大鼠24小时尿蛋白定量的变化 3.3 各组大鼠24小时尿蛋白定量的变化 如表 1 所示，模型组与正常组相比，24小时尿蛋白量增加，有显著性差异(P0.05)；各治疗组与模型组相比，24小时尿蛋白量减少，均有显著差异(P0.05)； 蛋白停组尿蛋白低于与肾炎四味片组， 差异有统计学意义(p0.05)。 慢性肾炎湿热证系膜细胞凋亡及尿表皮

31、生长因子变化的实验研究 13 表1. 各组大鼠24小时尿蛋白定量(XS) 组别 动物数() 尿Pr(mg/24h) 正常组 10 5.960.76 模型组 10 13.00.95* 肾炎四味片组 9 8.100.80# 蛋白停组 10 6.700.79# 注： 与正常组比较*p0.05； 与模型组比较#p0.05； 与肾炎四味片组比较p0.05 3.4 各组大鼠血清BUN、Cr浓度变化 3.4 各组大鼠血清BUN、Cr浓度变化 如表2 所示，模型组血清尿素氮(BuN)、肌酐 (Scr)较正常组明显增高，有显著差异(P0.05)； 各治疗组BuN和Scr值显著低于与模型组 (P0.05)。 表2

32、. 各组大鼠血清BUN、Cr浓度(XS) 组别 动物数() BUN(mmol/L) Cr(umol/L) 正常组 10 5.811.07 128.532.57 模型组 10 8.190.38 151.0711.57* 肾炎四味片组 9 6.860.69 124.4415.53# 蛋白停组 10 6.121.31 124.7110.63# 注：与正常组比较*p0.05；与模型组比较#p0.05 3.5 各组大鼠尿EGF浓度变化 3.5 各组大鼠尿EGF浓度变化 如表3 所示，模型组、肾炎四味片组尿EGF均高于正常组（P0.05） ；蛋白停组与正常组比无显著性差异。蛋白停组尿EGF低于与模型组和肾

33、炎四味片组慢性肾炎湿热证系膜细胞凋亡及尿表皮生长因子变化的实验研究 14（P0.05） 。 表3. 各组大鼠尿EGF浓度变化(XS) 组别 动物数() EGF(g/L) 正常组 10 2.440.16 模型组 10 3.500.36* 肾炎四味片组 9 3.200.78* 蛋白停组 10 1.960.55 # 注： 与正常组比较*p0.05； 与模型组比较#p0.05； 与肾炎四味片组比较p0.05 3.6 各组大鼠肾小球系膜细胞凋亡率改变 3.6 各组大鼠肾小球系膜细胞凋亡率改变 如表4 ，图2、4、6、8显示：各治疗组肾小球系膜区系膜细胞核均可见深棕色颗粒形成,细胞核皱缩,其细胞凋亡率与模

34、型组相比均显著性增加(0.05),其中以蛋白停组细胞凋亡最为明显,与肾炎四味片组相比差异有显著性(0.05)。 表4. 各实验组细胞凋亡率比较(XS) 组 别 动物数() 细胞凋亡率(%) 正常组 10 5.240.78 模型组 10 2.311.04 肾炎四味片组 9 14.692.50# 蛋白停组 10 20.523.16# 注：与模型组比较#p0.05；与肾炎四味片组比较p0.05 3.7 各组大鼠肾脏组织病理形态变化 3.7 各组大鼠肾脏组织病理形态变化 正常组正常组:肾小球结构基本正常,系膜细胞及基质无增生,毛细血管袢结构清晰。 模型组模型组:肾小球弥漫性增大,系膜细胞及基质弥漫性中

35、重度增生。部分肾小球囊慢性肾炎湿热证系膜细胞凋亡及尿表皮生长因子变化的实验研究 15腔粘连,肾小球毛细血管受压,病变以级为主。 治疗组:治疗组:蛋白停组与肾炎四味片组病理改变相近，肾小球轻度增大,系膜区细胞及基质局灶性节段性轻中度增生,肾小球毛细血管轻度受压,病变以、级为主。 （见图1、3、5、7.） 慢性肾炎湿热证系膜细胞凋亡及尿表皮生长因子变化的实验研究 16 4 讨论 4 讨论 4.1 MsPGN的发病机制 4.1 MsPGN的发病机制 原发性系膜增生性肾炎的病因和发病机制至今仍未明确，大多学者认为可能存在多种发病机制。总体来说可归结为免疫性发病机理及非免疫性发病机理二类。其中免疫性发病

36、机理包括复合物及补体对系膜细胞的直接作用；外来因子对T细胞的作用导致B细胞的活跃、细胞因子的异常分泌及由此而引起的系膜细胞及细胞因子的相互作用；免疫遗传学的异常，尤其是人类白细胞相关抗原(HLA)亚群的异常分布可能是系膜细胞异常增殖的一个潜在因素。 非免疫性因素如高血压、 高灌注状态及血小板功能异常等也可能对系膜病变的进程有影响6。 肾小球系膜由系膜细胞(glomerular mesangialcells, MC)及胞外基质(ECM)组成，肾小球系膜的病理改变包括细胞的增殖、肥大和细胞外基质堆积，是最终导致肾小球硬化，促使肾功能衰竭的基础。系膜细胞是肾小球的固有细胞，由于在体内处于特定的解剖位

37、置，因此，它是多种有害刺激的靶细胞。正常情况下，系膜细胞处于刺激与抑制(即增生与凋亡)相平衡的状态。当这种平衡状态遭到破坏， 可释放出多种炎症介质及基质成分， 并导致炎症;同时它又可作为效应细胞，通过自分泌或旁分泌的方式分泌多种生物活性物质影响自身或周围细胞的功能。系膜细胞增殖是肾小球对多种有害刺激反应的共同结果，主要通过以下几方面损害肾小球:(1)将影响大分子物质通过系膜区，导致大分子物质在系膜区局部沉积:(2)通过对肾小球毛细血管壁的挤压作用，引起毛细血管腔的机械阻塞，降低肾小球滤过率(GFR); (3)影响其分泌细胞外基质的质和量，改变其合成和降解细胞外基质的速率，导致细胞外基质堆积;(

38、4)影响炎性介质的产生，通过自分泌或旁分泌效应扩大细胞因子和多肽生长因子的产生，进一步损害肾小球，并逐步向肾小球硬化发展。因此如果能抑制系膜增殖、诱导增生的细胞凋亡、阻断相关细胞因子异常分泌、纠正脂质代谢紊乱等，则对以上诸环节必将产生一定的影响，起到保护肾脏的作用。 慢性肾炎湿热证系膜细胞凋亡及尿表皮生长因子变化的实验研究 17 4.2 系膜细胞凋亡与MsPGN的关系 4.2 系膜细胞凋亡与MsPGN的关系 细胞凋亡（apoptosis）也称程序化细胞死亡(Programmed Cell Death), 细胞凋亡一词是由病理学家kerr等在1972年正式提出的，kerr等人在光学和电子显微镜下

39、发现，生理性细胞死亡的形态学特征与病理性死亡的细胞坏死不同，并把前者称为凋亡。凋亡原意是指秋天树叶从树上落下的现象。细胞凋亡是机体维持自身稳定状态的一个重要机制, 在个体生长发育及多种疾病的发生、发展过程中发挥重要作用。 4.2.1 细胞凋亡的形态和生物化学特征 4.2.1 细胞凋亡的形态和生物化学特征 在细胞凋亡初期，染色质在核膜下凝集成新月状，核仁分解，核体积变小。细胞皱缩，失去特殊的细胞表面结构如微绒毛和细胞连接，邻近组织分离细胞器聚集， 密度增加， 内质网扩张， 但线粒体形态维持正常然后细胞核崩解成碎片 细胞质向外突出呈出泡状进而细胞裂解为多个有膜包绕的致密小体-凋亡小体，其内含有核碎

40、片和保存完好的细胞器。最后这些凋亡小体被邻近的细胞或巨噬细胞吞噬而进一步降解。特殊的DNA降解类型是细胞凋亡独特的生物化学特征。细胞内Ca2+、Mg2+浓度升高,激活内源性Ca2+、Mg2+依赖性内切酶,使DNA在核小体之间断裂,因此出现180200bp及其不同整数倍的寡聚核苷酸片断(核小体片断), 在琼脂糖凝胶电泳上呈现阶梯状的DNA区带图谱（DNA ladder）。其与细胞坏死是不同的细胞死亡方式,区别在于:坏死的细胞完整性被破坏、核染色体疏松变性、细胞器肿胀、溶解、细胞也完全融解、无膜性小体形成。而凋亡则是细胞皱缩，染色质聚集碎裂形成有质膜包围的核小体，不伴有细胞的融解和周围炎症的发生。

41、 4.2.2 凋亡的生理意义及其调控4.2.2 凋亡的生理意义及其调控 凋亡与增生共同组成调控细胞群体大小的“阴阳”调节环。细胞凋亡一方面慢性肾炎湿热证系膜细胞凋亡及尿表皮生长因子变化的实验研究 18清除过多增生的细胞和炎症细胞，有利于机体发育及损伤、炎症组织的修复，另一方面介导正常细胞死亡而导致许多疾病。例如细胞凋亡异常增多可导致艾滋病、神经系统退行性疾病、缺血性损伤、病毒感染性疾病等疾患。而正常的细胞凋亡被抑制，则可能是各种肿瘤、自身免疫性疾病的重要发病机制。但究其机制目前尚不完全清楚。现代研究表明细胞凋亡是受基因编码调控的；同时细胞因子及一些其他因素如抗癌药、甾体类激素等也参与对凋亡的调

42、控8。许多基因参与凋亡的调控, 按其表达产物对凋亡过程的作用可分为两类：一类是促进细胞凋亡的基因,如Bcl-XS，Bax，Ced-3，Ced-4，TNFR-1，Fas/Apo-1， ，P53， c-myc等为促凋亡基因；另一类是抑制细胞凋亡的基因，如Bcl-2，Bcl-XL，Ced-9，P35等为抗凋亡基因。凋亡是否发生取决于两者综合作用的最后结果。 4.2.3 肾小球系膜细胞的凋亡 4.2.3 肾小球系膜细胞的凋亡 肾细胞数量异常增加或减少是肾小球疾病的常见特征,肾小球系膜细胞过度增生出现于肾小球肾炎并可导致疾病的进展。细胞凋亡是肾脏发生、发育以及维持自身稳定状态必不可少的环节,同时也参与了

43、病理情况下肾细胞的损伤和修复过程。这种现象贯穿于肾脏正常生理及疾病发生的全过程7。既往认为MC较难发生凋亡，原因是MC自身可合成一些生长因子，并且只需有少量生长因子存在，MC就可以在体外长时间存活。实际上MC可发生凋亡，而且MC凋亡对肾小球疾病进展有重要意义。在链球菌感染后肾小球肾炎恢复期以及抗Thy-1肾炎模型中均可见增殖的MC逐渐消散，并已证明此现象系凋亡所致。Baker等发现体外培养的MC可出现典型的凋亡形态学改变，提取的DNA电泳亦可见特征性 “梯形结构”，电镜证实有凋亡小体存在。在狼疮性肾炎及IgA肾炎均可见MC凋亡存在。完全去除生长因子以及使用放线菌酮均可明显增加MC凋亡。由此推测

44、MC可能合成一些抗凋亡蛋白，使自身及相邻MC得以存活，而放线菌酮抑制蛋白质合成，解除了这些蛋白作用，使凋亡易于发生。既往未观察到MC凋亡的原因可能在于未完全去除生长因子作用。在抗Thy-1肾炎模型中存在MC凋亡，且与MC的有丝分裂比例和肾小球MC数相关。由于肾小球增殖细胞 （85）多表达 Thy-1.1抗原，而且凋亡多发慢性肾炎湿热证系膜细胞凋亡及尿表皮生长因子变化的实验研究 19生在系膜区，故凋亡细胞多为MC。综上所述MC不仅可以发生凋亡，而且其凋亡可能是MsPGN增殖的MC消散的重要机制3。 钱桐荪等通过临床肾活检对照研究发现非增生性肾炎肾小球细胞增殖数与凋亡细胞数均显著低于增生性肾炎;增

45、生性肾炎肾小球凋亡细胞数显著低于伴肾小球硬化的增生性肾炎;伴肾小球硬化的增生性肾炎肾小球增殖细胞数低于凋亡细胞数11。可见在增生性肾炎中细胞增殖的同时，启动了细胞凋亡机制,以维持小球细胞数平衡,不致无限制增生，而发挥一定的积极作用；还可能参与了肾小球硬化过程中的进行性肾小球细胞缺失过程。 4.2.4 肾小球系膜细胞凋亡的调控 4.2.4 肾小球系膜细胞凋亡的调控 参与MC凋亡的调节因素很多，凋亡发生与否涉及到多种因素的综合与平衡。 近年对 Bcl-2， Fas的研究较多， Takemura观察了不同病理类型的肾脏组织 Bcl-2和Fas的表达，发现正常人肾小球很少表达Bcl-2和Fas，但肾小

46、球发生病变时二者表达均有不同程度的增加。免疫电镜确认Bcl-2蛋白存在于MC的细胞器上，肾小球中Bcl-2阳性细胞的比例与肾小球PCNA阳性细胞数、MC增殖程度以及蛋白尿水平相关，提示MC过度增殖与Bcl-2过度表达有关。而Fas阳性细胞在紫癜肾和狼疮肾炎的肾小球表达的比例较高，分布于有明显细胞凋亡现象存在的系膜区和毛细血管内，提示Fas可能参与了MC凋亡。现认为Fas-FasL系统参与MC凋亡，该系统在早期的MC损伤、恢复期的MC消散以及MC进一步减少导致肾小球硬化的过程中均有重要意义。 Fas又称Apo-1,现命名为CD95分子，属TNFR/NGFR家族成员，Fas系统是肾细胞实现细胞凋亡

47、的主要机制之一,。Fas主要以膜受体的形式存在，还可以通过转录水平的不同拼接而产生可溶性Fas分子，其可能在细胞凋亡中起调节作用。Fas配体（FasL）为TNF相关的型跨膜分子， Fas与FasL结合就可以介导细胞发生凋亡；研究表明各种肾细胞Fas表达及产生细胞凋亡的途径各不相同，它们对Fas介导的细胞凋亡的敏感程度也不一样，Fas介导的细胞凋亡主要对肾小球系膜细胞的调节发挥作用 9。Gonzez等证实利用抗FasMAb可诱导活体鼠肾小球系膜细胞的凋亡,并在24小时后出现血尿和蛋白尿,并发现大量的肾小球系膜细胞凋亡,即慢性肾炎湿热证系膜细胞凋亡及尿表皮生长因子变化的实验研究 20使去除补体也不

48、能防止对肾小球的损害10。提示Fas介导的细胞凋亡可能参与肾小球损伤过程中肾小球系膜细胞的死亡。 P53与Bax亦参与MC凋亡的调节。通过其序列特异性DNA结合基因与DNA特别序列在G1晚期结合，使细胞周期减慢出现停顿，对DNA进行修复。若DNA损伤严重、P53过度表达则使细胞进入凋亡。Bax与Bcl-2的作用互相对应，二者比例决定细胞存活还是死亡，二者比例的变化参与MC凋亡的调节。 脂质代谢紊乱也调节MC增殖与凋亡。研究表明血脂水平下降可减轻MC增殖和MM积聚。肾病患者常存在脂质代谢异常，包括LDL积聚。Pratima Sharma发现LDL对MC具有双向调节作用，低浓度LDL可刺激 MC增

49、殖，但高浓度LDL则可诱导MC凋亡；OXLDL可诱导MC凋亡，而SOD可减轻LDL诱导的MC凋亡，推测LDL可能通过产生氧自由基诱导细胞凋亡发生。正常肾小球存在多种屏障，LDL难以到达系膜区与MC接触。在肾小球病变时，系膜的孔径加大，LDL得以进入系膜区。由于其分子过大，离开系膜区机会较少，因而LDL在系膜区逐渐积聚。开始时LDL浓度较低，主要刺激MC增殖，随着LDL浓度逐渐增加，对MC作用由刺激增殖转为诱导凋亡。此外MC可氧化LDL，形成OXLDL，它也可诱导MC凋亡。在高浓度LDL和OX-LDL的作用下MC逐渐减少，最后形成肾小球硬化. 此外，细胞与基质间连接结构的变化及ICE基因表达也参

50、与MC凋亡的调控；细胞因子、粘附分子、NO，O2-，及临床使用的激素、细胞毒药物均可影响MC凋亡。 4.2.5 肾小球系膜细胞凋亡的药物诱导 4.2.5 肾小球系膜细胞凋亡的药物诱导 近年来的研究认为MC凋亡减少是某些肾小球肾炎结构不能恢复，病情呈慢性进展的原因之一，因此研究药物诱导MC凋亡在肾脏病临床中有重要的意义。国外学者研究发现在大鼠抗Thy1.1肾小球肾炎中，增生的MC通过凋亡使其数目减少，系膜增生消退，肾小球结构完全恢复正常，说明凋亡在该模型的自愈过程中起着十分重要的作用。在人类的增殖性肾小球肾炎中，肾小球和小管间质的凋亡细胞越多，其愈后越佳;链球菌感染后急性肾小球肾炎更是如此。现代