2022年重组质粒pRSETDNA纯化方法的比较 .pdf

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1、2008 年 8 月襄樊学院学报Aug.,2008第 29 卷第8期Journal of XiangfanUniversityVol.29 No.8重组质粒 pRSETDNA 纯化方法的比较王海燕，王启会，李玉清，刘法彬，王高芳(襄樊学院化学与生物科学系，湖北襄樊441053)摘要：分别采用柱式小量质粒抽提纯化试剂盒和聚乙二醇沉淀法纯化重组质粒pRSET DNA，琼脂糖凝胶电泳和DU800 核酸蛋白分析仪鉴定已纯化的重组质粒pRSET DNA 的纯度.结果显示，采用聚乙二醇沉淀法纯化重组质粒pRSET DNA：A260/280=1.83，试剂盒所得结果：A260/280=1.91.与试剂盒相比

2、，聚乙二醇沉淀法获得纯化质粒的纯度没有显著性差异，常规质粒纯化实验中可用此法代替昂贵的试剂盒.关键词：重组质粒pRSET DNA；纯化；比较中图分类号：Q7文献标志码：A文章编号：1009-2854(2008)08-0024-03质粒是独立于染色体外的小型环状DNA分子，是现代生物学实验中常用的载体工具，在基因工程领域应用非常广泛.常见的质粒DNA 提取方法主要有煮沸法、SDS(十二烷基磺酸钠)法、碱裂解法、SDS 碱裂解法等1-2.然而分离质粒DNA 的这些方法通常都存在一定量的RNA和大肠杆菌染色体DNA 的污染3.当对质粒的纯度有所要求时，如分子克隆中的酶学反应，转染动物细胞等，其污染必

3、须被去除或至少降到可接受的水平3.针对新构建的重组质粒pRSET DNA 的纯化问题，本实验拟分别采用操作比较简单但价格比较昂贵的试剂盒和一般实验室可操作的，成本比较低的聚乙二醇沉淀法纯化重组质粒pRSET DNA，比较两者获得质粒的纯度，以期为分子生物学实验中针对新构建的重组质粒pRSET DNA 找到一种比较理想的纯化方法.1材料与方法1.1 材料菌株及主要试剂含重组质粒 pRSET的大肠杆菌 DH5由武汉科技大学陈勇老师馈赠；RNaseA购自德国sigma公司；PEG 8000(聚乙二醇)购自 Amersco公司；琼脂糖购自基因科技(上海)有限公司.1.2 方法1.2.1 重组质粒pRS

4、ET DNA 纯化的操作步骤1.2.1.1 聚乙二醇沉淀法纯化重组质粒pRSET DNA 操作步骤3(1)将 3ml 粗制质粒转移到15mlCorex 管中，在冰浴中冷却至0.(2)加入 3ml 冰预冷的5mol/L LiCl，混匀，于4离心10000rpm，10min.(3)转移上清至30ml Corex 管中，加等体积异丙醇，混匀，室温离心回收核酸，10000rpm.10min.(4)小心倒去上清，倒置管口，使液体流干.室温下用70乙醇洗沉淀和管壁.小心将乙醇倒去，在纸巾上倒置数分钟，使无可见乙醇残留.但应使沉淀保持湿润.(5)用 500 l 含 RNaseA 的 TE(pH8.0)溶解核

5、酸沉淀.将溶液转移到微量离心管，室温放置30min.(6)将质粒-RNase A 混合物用酚：氯仿抽提一次，然后用氯仿抽提一次.(7)用标准的乙醇沉淀法回收DNA.(8)将质粒 DNA 沉淀用 1ml 灭菌水溶解，再加入0.5ml PEG-MgCl2溶液.(9)室温放置超过10min，然后于室温用微量离心机在最大速度离心20min，以回收沉淀的质粒DNA.收稿日期：3作者简介：王海燕(),女,湖北宜城人,襄樊学院化学与生物科学系讲师2008-07-01971-.名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 1 页，共 3 页 -第 29卷第 8 期襄樊学院学报2008 年第 8期5(10)

6、沉淀用 0.5ml 70%乙醇重悬去除微量PEG，用微量离心机在最大速度离心5min 回收核酸.(11)吸去乙醇，重复步骤10.第二次洗涤后，在离心管架上放置15min，使乙醇挥发.(12)湿润的质粒沉淀用500l TE(pH 8.0)溶解.(13)分装 DNA 并保存于-20.1.2.1.2 柱式小量质粒抽提纯化试剂盒操作步骤严格按照试剂盒使用说明书操作.1.2.2 质粒 DNA 纯化结果鉴定1.2.2.1 琼脂糖凝胶电泳鉴定配制 1琼脂糖凝胶，10 l/孔加样，75V 电泳 1h，结束电泳，取出并拍照.1.2.2.2用核酸蛋白分析仪DU800(美国 Beckman coulter 产品)检

7、测质粒 DNA 含量和纯度.2结果2.1 质粒 DNA 浓度及纯度的鉴定2.1.1 琼脂糖凝胶电泳结果图 1 两种方法纯化重组质粒的电泳图(注：1 柱式小量质粒抽提纯化试剂盒纯化重组质粒pRSET DNA；2 聚乙二醇沉淀法纯化重组质粒pRSET DNA；3 重组质粒 pRSET DNA 粗制品；4 DNA Marker)由图 1可见，重组质粒 pRSET DNA 用两种不同方法纯化后，都显示比较纯的超螺旋结构DNA 条带(对应于2000bp左右).2.1.2 采用核酸蛋白分析仪DU800测定质粒 DNA 溶液的 A260、A280、A260/A280 及浓度见表 1.表1 质粒 pRSET

8、DNA 纯度及浓度的测定纯 化 方 法A260A280A260/A280Nuc Acid(g/ml)聚乙二醇沉淀法0.4760.2601.833.93柱式小量质粒抽提纯 化 试 剂 盒0.3340.1751.916.19两组 A260/A280 数据采用 t 检验结果显示：p0.05.表明采用聚乙二醇沉淀法和试剂盒法纯化重组质粒 pRSET DNA 没有显著性差异.2名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 2 页，共 3 页 -王海燕，等：重组质粒pRSET DNA 纯化方法的比较63讨论在 20世纪 90年代，许多从事分子克隆的工作者，特别喜欢用商品化的试剂盒来纯化质粒.绝大部分原

9、因是因为试剂盒操作起来比较方便、快捷、效果比较理想4.实际上，用常规技术分离纯化质粒DNA 在很多情况下并不比试剂盒逊色5-6.相反，它还具有成本较低，配制试剂时间不受限制，剂量掌握比较方便等优势.常规纯化质粒 DNA 的方法有很多，这里从实验室常规条件考虑选择了聚乙二醇沉淀法(操作相对简便)，并将它与试剂盒纯化法相比较.结果显示，两种方法所获得纯化重组质粒pRSET DNA 的纯度没有明显差异.从而提示了用聚乙二醇沉淀法纯化质粒同样可得到比较理想的结果，采用此法在常规实验里对质粒进行纯化是完全可行的.参考文献：1 SAMBROOKJ,FRITSCHE F,MANLATIST.Molecula

10、rcl oning:a laboratory manual M.2nd ed.Cold Spring Harbor Laborat ory Press,1993:16-23.2 金冬雁.分子克隆实验指南M.北京:科学出版社,1992:16-34.3 Sambrook,Russell.分子克隆实验指南M.3版.黄培堂,译.北京:科学出版社,2002:48-50.4 EHRT S,SCHNAP PINGER D.Isolat ion of pl asmids from Ecoli by alkalinelysisJ.Methods Mol Biol,2003(235):75-78.5 LIMAYE

11、AP,TURGEONDK,COOKSONBT,et al.Pseudomembranouscolitiscaused by a toxin A(-)B(+)strain of Clostridiumdiffi cileJ.ClinMicrobiol,2000,38(4):1696-1697.6 GENTHH,SELZERJ,BUSCHC,et al.New method t o generate enzymati cally defi cient Clostridiumdifficiletoxin B as an antigen for immunizationJ.Infect Immun,2

12、000,68(3):1094-1101.Comparative Study on the Methods for Purification of the RecombinantPlasmid pRSET DNAWANG Hai-yan,WANG Qi-hui,LI Yu-qing,LIU Fa-bin,WANG Gao-fang(Department of Chemistry andBiology Science,Xiangfan University,Xiangfan 441053,China)Abstr act:To compare the purity,the recombinant p

13、lasmid DNA was sublimed through the PEG deposit methodand the DNAPurificationKit respectively.The purity of the sublimed plasmid DNA was quantified both byAgarose gel electrophoresis and UV/VisSpectrophotometer(DU800).The ratio of A260/280 of plasmid DNAsublimed by the PEG deposit method was 1.83;Wh

14、ile that of plasmid DNA sublimed by the DNA PurificationKit was 1.91.The same purity in statistics significance was acquired by both the two different methods,so thegeneral purificationcan be done by the general PEG deposit method instead of the more expensive DNAPurification Kit.Key words:The recombinant plasmid pRSET DNA;Purification;Comparison2名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 3 页，共 3 页 -