DB 37T 4030 苹果品种鉴定方法 微卫星方法.doc
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1、ICS07.080B 30/39DB37山东省地方标准DB37/T 40302020苹果品种鉴定方法微卫星方法Molecule identification method for apple strain2020 - 07 - 09发布2020 - 08 - 09实施山东省市场监督管理局发布DB37/T 40302020前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由青岛海关提出、归口并组织实施。本标准起草单位：青岛海关技术中心、临沂大学、中国农业科学院果树研究所、中国科学院海洋研究所。本标准主要起草人：高宏伟、刘云国、陈新疆、王强、王鸿霞、陈盛盛、孙雯娴、孙敏、魏晓棠。本标准系
2、首次发布。7苹果品种鉴定方法微卫星方法1 范围本标准规定了苹果品种的分子鉴定方法。本标准适用于由苹果的种苗、砧木、枝叶、果实等组织鉴定苹果品种。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 19557.1植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则NY/T 24242013植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南苹果3 术语和缩略语3.1 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1.1 品种cultivar在一定的生态和经济条件下，经自然或人工选择形成的
3、动、植物群体。在植物学里，品种是在植物界的22个分类等级之下，具有相对的遗传稳定性和生物学及经济学上的一致性，并可以用普通的繁殖方法保持其恒久性。 3.1.2PCR多聚酶链式反应polymerase chain reaction以拟扩增的DNA分子为模板，以末端互补的寡核苷酸片段为引物（primer），在耐热DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA分子合成。重复这一过程，即可使目的DNA片段得以大量扩增。是常规分子生物学技术之一，用于扩增特定的DNA片段。3.1.3基因座位（或位点）genetic locus基因在染色体上占有的特定位置叫基因位点。3.1.4微
4、卫星序列microsatellite又称为短串联重复序列(short tandem repeats,STRs)或简单重复序列（simple sequence repeats），是均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列，由26个核苷酸的串联重复片段构成，由于重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富，因此微卫星标记的应用非常广泛。微卫星位点通常通过PCR扩增，扩增产物通过电泳分析并根据大小分离等位基因进行检测。3.1.5等位基因allele指位于一对同源染色体相同位置上控制同一性状不同形态的基因。3.2 缩略语下列缩略语适用于本文件。bp：碱基对（base pair） CTAB：十六烷
5、基三甲基溴化铵（Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleic acid）EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylene Dia mine Tetraacetic Acid）Tris：三羟甲基氨基甲烷（2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol）4 原理不同苹果品种间SSR基因座位的等位基因存在序列长度多态性，即苹果品种间微卫星序列（SSR）依苹果品种不同，等位变异的数量可能不同。针对特定SSR两侧序列高度保守的核酸序列，设计序列特异性引物，利用PCR技术对重复序列进行扩增，并对P
6、CR扩增引物进行硝酸银染色或者荧光染料标记定量区分片段大小（bp），根据该等位变异的扩增片段大小鉴定苹果品种，在苹果品种鉴定的数据库中进行比对，从而鉴定苹果品种。5 设备和材料5.1 设备5.1.1 天平：感量0.01 g。5.1.2 均质器。5.1.3 水浴锅（0 100 ，感量0.1 ）。5.1.4 振荡器。5.1.5 研钵或其他粉碎装置。5.1.6 高速台式冷冻离心机。5.1.7 梯度PCR仪。5.1.8 微量可调移液器及配套吸头（50 L、100 L、200 L）。5.1.9 微量离心管（1.5 mL和2 mL）。5.1.10 毛细管电泳仪或者DNA分析仪。5.2 试剂5.2.1 CT
7、AB提取缓冲液：55 mmol/L CTAB，1 400 mmol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris，用10 % 盐酸调pH至8.0，121 ，高压灭菌20 min，备用。5.2.2 CTAB沉淀液：称取1.00 g CTAB，0.50 g NaCl，用适量水溶解后，调节pH=8.0，定容至200 mL，高压灭菌。5.2.3 RANase RNA酶。5.2.4 TE缓冲液（pH 8.0）。5.2.5 NaCl溶液，1.2 mol/L。5.2.6 三氯甲烷。5.2.7 异丙醇。5.2.8 70 %乙醇。5.2.9 引物：根据附录A中表A.1的序列合成荧光
8、引物，加超纯水配制成100 pmol/L储存液，用于PCR检测的工作液浓度为10 pmol/L。荧光基团可以为FAM、HEX中的一种。5.2.10 毛细管电泳专用分子量内标。5.2.11 去离子甲酰胺。5.2.12 除特别说明外，所用试剂均为分析纯。水为无离子水。5.2.13 蛋白酶K。5.2.14 苯酚。6 制样对于种苗、枝叶、果实样品，每个样品取两个平行样，各300 mg。对于砧木样品取韧皮部部分，每个样品取两个平行样，各300 mg。7 检测方法7.1 样品DNA的提取7.1.1 称取300 mg经的样品，液氮研磨后置于2 mL离心管中，加入600 L CTAB缓冲液和40 L蛋白酶K，
9、振荡混匀，65 温浴30 min90 min，期间每隔10 min 轻柔颠倒混匀。7.1.2 2 000 g离心5 min，取上清于另一干净的2 mL离心管中，加入等体积的酚、三氯甲烷和异戊醇的混合液（25：24：1），震荡混匀。7.1.3 12 000 g离心10 min，取上清至干净的2 mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀。7.1.4 12 000 g离心10 min，弃去上清液，用预热至65 的TE缓冲液溶解DNA。7.1.5 加入5 L RNA酶溶液，37 30 min。7.1.6 加入200 L三氯甲烷：异戊醇（24：1），强烈振荡。7.1.7 12 000 g离心10 min
10、，取上清至干净的2 mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀。7.1.8 12 000 g离心10 min，弃去上清液，用4 预冷的70 %乙醇500 L，涡旋清洗沉淀。7.1.9 12 000 g离心10 min，弃去上清液，倒置晾干后加100 L TE缓冲液溶解沉淀，20 保存备用。也可以根据实际情况使用其他经过验证的试剂盒。7.2 DNA浓度与纯度测定采用紫外分光光度计法测定DNA浓度和纯度。紫外分光光度计检测的最佳范围是2 pg/mL50 pg/mL，OD值应该在0.051的区间内。将DNA液做适当的稀释，放入紫外分光光度计的龀色皿中，于260 m处测定其吸收峰，1OD260 nm=5
11、0 g/mL双链DNA或38，g/mL单链DNA。PCR级DNA溶液的OD260 nm/OD280 nm比值为1.72.0。7.3 PCR定性检测7.3.1 PCR反应引物序列表针对种常见苹果品种鉴定用的PCR扩增引物，见附录A中表A.1。15对引物分别进行PCR的扩增。7.3.2 PCR反应参数PCR扩增用引物序列信息见附录A中表A.1。7.3.3 PCR反应体系PCR反应体系见附录A中表A.2。7.3.4 质控措施检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知品种的苹果做阳性对照，用已知不含苹果成分的模板作阴性对照，用等体积的水代替模板DNA作空白对照。7.4 毛细管电泳荧光检测7.
12、4.1 样品上机按照毛细管电泳仪器使用要求更换缓冲液、灌胶和在程序中输入样品信息。将FAM荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，将HEX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释15倍，将TAMRA荧光标记的PCR产物用超纯水稀释10倍，将ROX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释5倍，混合均匀。从稀释液中取1 L上样到毛细管电泳仪专用分析板的孔中。同时加入0.1 L分子量内标和8.9 L去离子甲酰胺。将样品在PCR仪上95 变性5 min，迅速取出置于冰上，冷却10 min。离心把管内液体甩至管底后上毛细管电泳的仪器。 启动运行程序，毛细管电泳仪自动收集点用数据。7.4.2 等位数据采集由毛细管电泳的分
13、析软件，通过与标准分子量比对，读出每个扩增位点的样品等位基因扩增条带数目和条带大小的数据。若采集的等位基因扩增的数据为2个扩增条带，则该样品为二倍体苹果。若采集的等位基因扩增的数据为3个扩增条带，则该样品为三倍体苹果。若有4个扩增条带，则该样品为四倍体苹果。二倍体纯合位点的等位基因条带的大小数据记录为X/X，杂合位点等位变异大小数据记录为X/Y。其中X、Y分别为该位点上两个不同的等位变异，小片段数据在前，大片段数据在后，无效等位变异的大小记录为0/0。三倍体和四倍条带大小记录方式类推。7.5 结果判定及表述7.5.1 将获得样品的等位基因变异数据与附录A.3数据库中品种比较：a) 若为二倍体，
14、品种相似度（S）按照下面的公式计算：S=2NijNi+Nj100(1)式中：S 相似度，单位为百分率（%）；Nij 品种i和j之间共有的等位基因数目；Ni 品种i中出现的等位基因数目；Nj 品种i中出现的的等位基因数目。b) 若为三倍体，品种相似度（S）按照下面的公式计算：S=3NijNi+Nj100(2)式中：S 相似度，单位为百分率（%）；Nij 品种i和j之间共有的等位基因数目；Ni 品种i中出现的等位基因数目；Nj 品种i中出现的的等位基因数目。推荐使用本标准附录B配用的苹果品种鉴定系统软件，该软件预装了附录A.3的标准样品数据库，并且按照以上公示设计计算程序，输入待测样品的微卫星数据
15、，运行程序可以直接得到品种相似度最高的相似品种信息。该软件需要在Java运行条件下安装使用。7.5.2 结果判定及表述判定方法如下：a) 品种间相似度90 %，判定为不同品种；b) 品种间相似度90 %S100 %时，判定为近似品种；c) 品种间相似度=100 %，判定为疑似品种。对于b）和c）的情况，按照GB/T 19557.1和NY/T 24242013的规定进行田间鉴定。AA附录A （规范性附录）PCR扩增用引物序列信息及参考数据库PCR扩增用引物序列信息见表A.1。表A.1 PCR扩增用引物序列信息序号名称引物方向序列（5-3）5端标记荧光基团扩增条件扩增大小bp文献来源1CH01d0
16、8Fctccgccgctataacacttc94 2 min 30 sec； 94 30 sec，52 30 sec，72 30 sec，40 cycle；72，10 min。238-2901、Gerald S. Dangl Judy Yang Deborah A. Golino Thomas Gradziel. A practical method for almond cultivar identificationand parental analysis using simple sequence repeat markersEuphytica (2009) 168:4148.2、L.
17、Gianfranceschi, N. Seglias,R. archini, M. Komjanc, C. Gessler. Simple sequence repeats for the genetic analysis of apple. Theor Appl Genet (1998) 96:1069-1076.Ractctggagggtatgtcaaag2CH01e01Fggttggagggaccaatcatt106-120Rcccactctctgtgccagatc3CH02b03bFataaggatacaaaaaccctacacag77-109Rgacatgtttggttgaaaact
18、tg4CH02b07Fccagacaagtcatcacaacactc180-202Ratgtcgatgtcgctctgttg5CH02b10Fcaaggaaatcatcaaagattcaag121-159RCaagtggcttcggatagttg6CH02b12Fggcaggctttacgattatgc101-143Rcccactaaaagttcacaggc7CH02d11Fagcgtccagagcaacagc118-148Raacaaaagcagatccgttgc8CH02f06Fccctcttcagacctgcatatg135-158Ractgtttccaagcgatcagg9CH02g0
19、9Ftcagacagaagaggaactgtatttg98-138RCaaacaaaccagtaccgcaa10CH02h11aFcgtggcatgcctatcatttg104-132Rctgtttgaaccgcttcctc11CH03d07Fcaaatcaatgcaaaactgtca186-226Rggcttctggccatgatttta12CH04d02Fcgtacgctgcttcttttgct118-146Rctatccaccacccgtcaact13CH04d10Fgagggatctgtagctccgac138-204Rtggtgagtatctgctcgctg14CH05c07Ftga
20、tgcattagggcttgtactt111-149Rgggatgcattgctaaataggat15CH05g03Fgctttgaatggatacaggaacc135-192RcctgtctcatggcattgttgPCR反应体系见表A.2。表A.2 PCR反应体系试剂名称工作液浓度25 L反应体系加样体积/ LdNTP2.5 mmol/L2 LPCR缓冲液102.5 LTaq DNA聚合酶5 U/L0.3 L上游引物10 pmol/L0.3下游引物10 pmol/L0.3DNA模板10050 ng2超纯水17.6部分苹果品种SSR基因型数据见表A.3。表A.3 部分苹果品种SSR基因型数据
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