法医病理学组织切片制作.ppt

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1、法医病理学组织切片制作现在学习的是第1页，共39页HE染色切片染色切片现在学习的是第2页，共39页一、目的要求一、目的要求 掌握取材、固定、水洗、脱水、透明、浸蜡与掌握取材、固定、水洗、脱水、透明、浸蜡与包埋，切片制作。包埋，切片制作。（一）取材（一）取材1.1.取材快，新鲜，防止组织腐败。取材快，新鲜，防止组织腐败。2.2.取材刀锋利，垂直地切取，严禁挤压或用钳镊钳夹，以取材刀锋利，垂直地切取，严禁挤压或用钳镊钳夹，以免使组织或细胞变形造成人为的破坏。免使组织或细胞变形造成人为的破坏。3.3.取材大小，取材大小，lcmlcm3cm3cm1cm1cm2cm2cm0.3cm0.3cm0.5cm0

2、.5cm。材。材料过大在短时间内不易固定透，影响效果。料过大在短时间内不易固定透，影响效果。现在学习的是第3页，共39页（二）方法：（二）方法：1.1.实质器官实质器官心脏：心脏：心房、瓣膜、心室。可分别取病变部位带正常组织。可心房、瓣膜、心室。可分别取病变部位带正常组织。可单独取心室肌，乳头肌，单独取心室肌，乳头肌，3 35 5块。块。肺脏：肺脏：左右两肺（五个肺叶）；可根据病变需要决定取材块数左右两肺（五个肺叶）；可根据病变需要决定取材块数，特殊情况下为区别在不同肺叶上取材，可用形状做标志在，特殊情况下为区别在不同肺叶上取材，可用形状做标志在记录时记清楚，记录时记清楚，5 57 7块。块。

3、肾脏：肾脏：取材包括被膜、皮质、髓质和肾盂，应区别左右取材包括被膜、皮质、髓质和肾盂，应区别左右肾，肾，2 24 4块。块。胰腺：胰腺：取胰体部，必要时加取胰头、胰尾，取胰体部，必要时加取胰头、胰尾，2 2块。块。肝脏：肝脏：取长方形或三角形，取长方形或三角形，2 23 3块。块。脾脏：脾脏：取材带被膜，取材带被膜，2 23 3块。块。现在学习的是第4页，共39页 脑：脑：全脑（桥脑、延脑、小脑）、脊髓颈全脑（桥脑、延脑、小脑）、脊髓颈段及脉络丛，十一块，或根据具体情况决定段及脉络丛，十一块，或根据具体情况决定：额极；前后中央回；海马；内囊额极；前后中央回；海马；内囊；丘脑；枕叶；脉络丛；桥脑

4、；丘脑；枕叶；脉络丛；桥脑；延髓；中脑；延髓；中脑；小脑。取材时要带上软小脑。取材时要带上软脑膜、脑室膜或软脊膜因此刀要锋利。需要脑膜、脑室膜或软脊膜因此刀要锋利。需要时取脊髓。时取脊髓。垂体：垂体：前、中、后叶和垂体柄，从前向后前、中、后叶和垂体柄，从前向后横切。横切。现在学习的是第5页，共39页 2 2管腔脏器：管腔脏器：取材时注意方向，取管腔脏器的全层构造。取材时注意方向，取管腔脏器的全层构造。大肠、小肠：大肠、小肠：应考虑环行皱襞，沿肠管的长轴取（纵切）。应考虑环行皱襞，沿肠管的长轴取（纵切）。食管、气管：食管、气管：横切面为宜。横切面为宜。胃：胃：常规取胃底。常规取胃底。取材后应将被

5、膜面铺在滤纸上，然后入固定液内，取材后应将被膜面铺在滤纸上，然后入固定液内，防止或减少组织受压变形与收缩。防止或减少组织受压变形与收缩。有病变的部位，应附带周围正常组织取材。有病变的部位，应附带周围正常组织取材。现在学习的是第6页，共39页二、固定二、固定 （一）意义：（一）意义：是做好切片的重要步骤之一，如果首次组是做好切片的重要步骤之一，如果首次组织固定不良，再重新固定效果不佳。织固定不良，再重新固定效果不佳。检材固定的关键：取材后尽可能地及时地将所检材固定的关键：取材后尽可能地及时地将所取的材料进行固定，以防止其取的材料进行固定，以防止其“死后死后”变化的进展，变化的进展，尽力使组织接近

6、于生前状态。为了防止组织结构及成份的尽力使组织接近于生前状态。为了防止组织结构及成份的破坏和溶解消失，需要使其转变为不溶性物质，有利于组破坏和溶解消失，需要使其转变为不溶性物质，有利于组织结构保存织结构保存-固定的基本意义。固定的基本意义。现在学习的是第7页，共39页固定的目的：固定的目的：1.1.阻止死后变化，防止组织的自溶与腐败。阻止死后变化，防止组织的自溶与腐败。2 2保存组织的结构及成份。保存组织的结构及成份。3 3媒染作用，使不同的组织成份对染料有不同媒染作用，使不同的组织成份对染料有不同 亲和力，使细胞各部易于受色。亲和力，使细胞各部易于受色。4 4能使组织硬化，为制作薄切片奠定基

7、础。能使组织硬化，为制作薄切片奠定基础。注意：注意：材料块不能过大，固定器皿不易过小，固定液量不材料块不能过大，固定器皿不易过小，固定液量不易过少，应是固定材料体积的易过少，应是固定材料体积的2020一一3030倍。倍。现在学习的是第8页，共39页（二）固定液：（二）固定液：根据检验目的不同选择不同种类固定液，如糖原检查：不含水的固定液；电镜检查：根据检验目的不同选择不同种类固定液，如糖原检查：不含水的固定液；电镜检查：锇酸固定液等；锇酸固定液等；HEHE染色：甲醛。染色：甲醛。固定液：固定液：用以固定组织的药剂。用以固定组织的药剂。固定液分类固定液分类：单纯固定液，由一种药剂组成；混合固定液

8、（或复合），由二种以：单纯固定液，由一种药剂组成；混合固定液（或复合），由二种以上的药剂组成。上的药剂组成。1 1选择固定液的标准：选择固定液的标准：具有强的穿透力，固定均匀，能迅速渗透到组织内部使组织细胞结构保持具有强的穿透力，固定均匀，能迅速渗透到组织内部使组织细胞结构保持生活状态。生活状态。不使组织过度收缩与膨胀而变形。不使组织过度收缩与膨胀而变形。能迅速使组织中的蛋白质、糖、脂肪等物质凝固成为不溶性物质。能迅速使组织中的蛋白质、糖、脂肪等物质凝固成为不溶性物质。使组织达到一定的硬度便于切片制作。使组织达到一定的硬度便于切片制作。价格便宜，易价格便宜，易购购买，配制方便。买，配制方便。现

9、在学习的是第9页，共39页2单纯固定液单纯固定液 乙醇（酒精）、甲醛（福尔马林）、重铬酸钾、苦味酸、锇酸、丙酮、冰醋酸乙醇（酒精）、甲醛（福尔马林）、重铬酸钾、苦味酸、锇酸、丙酮、冰醋酸（1 1）乙醇（酒精）（）乙醇（酒精）（alcoholalcohol）优点：优点：价格低，易购买，易溶于水，使用方便，价格低，易购买，易溶于水，使用方便，9595浓度，无水乙醇浓度，无水乙醇100100；市售有两种：市售有两种：100%100%；95%95%；能硬化组织起固定作用；能硬化组织起固定作用；也是一种最常用的脱水剂。也是一种最常用的脱水剂。固定用浓度在固定用浓度在70708080，酒精浓度愈大组织收缩

10、愈严重，浓度过低起不到固定作用，酒精浓度愈大组织收缩愈严重，浓度过低起不到固定作用。缺点：缺点：穿透力小，由于被固定的组织表面硬化，固定液不容易渗透到组织中去，所以用乙醇固穿透力小，由于被固定的组织表面硬化，固定液不容易渗透到组织中去，所以用乙醇固定的组织材料要小。定的组织材料要小。使组织严重收缩。使组织严重收缩。由于酒精能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，核蛋白的沉淀物易溶于水，使细胞核核色不佳。由于酒精能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，核蛋白的沉淀物易溶于水，使细胞核核色不佳。溶解脂肪、血红蛋白和多种色素，脂肪染色必须制作冰冻切片。溶解脂肪、血红蛋白和多种色素，脂肪染色必须制作冰冻切片。现在学习的是

11、第10页，共39页2 2甲醛：（福尔马林）（甲醛：（福尔马林）（formalinformalin）最常用的固定液最常用的固定液，一种还原剂，无色透明极易挥发有强烈刺激性气，一种还原剂，无色透明极易挥发有强烈刺激性气味的液体，不能与氧化剂混使用。可应用于组织学、组织化学、免疫组味的液体，不能与氧化剂混使用。可应用于组织学、组织化学、免疫组织化学等染色，最好用时现配。织化学等染色，最好用时现配。商品甲醛：商品甲醛：37374040甲醛水溶液。甲醛水溶液。固定液的浓度：固定液的浓度：4 48 8（习惯上称为（习惯上称为1010或或2020的福尔马林）。的福尔马林）。固定时间：固定时间：常温下固定常温

12、下固定24h24h48h48h。快速固定，可加温到。快速固定，可加温到70708080或者或者加温煮沸加温煮沸10min10min即可。快速固定，组织块不宜过厚或过大，缺点是即可。快速固定，组织块不宜过厚或过大，缺点是组织收缩较严重。组织收缩较严重。固定液配制：固定液配制：甲醛甲醛1 1份与份与9 9份自来水混合即为份自来水混合即为1010（4%4%）浓度的甲醛）浓度的甲醛固定液。固定液。现在学习的是第11页，共39页 优点：优点：渗透力较强；组织收缩小；细胞核染色较好。渗透力较强；组织收缩小；细胞核染色较好。缺点：缺点：质量较差的质量较差的formalinformalin在低温下久存容易产生

13、一种白色的沉淀物称在低温下久存容易产生一种白色的沉淀物称“三三聚甲醛聚甲醛”（付醛），经氧化成为甲酸而使溶液呈酸性，影响细胞（付醛），经氧化成为甲酸而使溶液呈酸性，影响细胞核染色。可在备用甲醛溶液中放入适量的碳酸钙或碳酸镁，简便的核染色。可在备用甲醛溶液中放入适量的碳酸钙或碳酸镁，简便的办法可在溶液中投入适量的大理石或者白色粉笔作为中和剂。办法可在溶液中投入适量的大理石或者白色粉笔作为中和剂。酸性福尔马林固定的组织多易产生一种褐色或黑色细颗粒状物，称酸性福尔马林固定的组织多易产生一种褐色或黑色细颗粒状物，称为福尔马林色素，在切片上形成黑色小颗粒，不溶于水和酒精，影响为福尔马林色素，在切片上形成

14、黑色小颗粒，不溶于水和酒精，影响染色效果和切片的观察。染色效果和切片的观察。现在学习的是第12页，共39页去掉福尔马林色素颗粒方法：去掉福尔马林色素颗粒方法：Schridde法法 25氨水氨水 l ml 75酒精酒精 200 ml 切片脱蜡经切片脱蜡经70酒精时，用上液浸泡半小时或稍长一些时酒精时，用上液浸泡半小时或稍长一些时间，然后水洗再行染色。间，然后水洗再行染色。Verocay法法 l氢氧化钾水溶液氢氧化钾水溶液 l ml 70酒精酒精 100 ml 切片脱蜡经酒精切片脱蜡经酒精80时入上液处理时入上液处理10分钟，经分钟，经70酒精入水酒精入水后即可染色。后即可染色。现在学习的是第13

15、页，共39页（三）水洗（三）水洗 1.1.用水道流水洗涤，彻底清除组织块中的固定液。用水道流水洗涤，彻底清除组织块中的固定液。2.2.水洗时间数小时至水洗时间数小时至2424小时。小时。3.3.根据材料多少、大小可灵活掌握水洗工具，可用水洗根据材料多少、大小可灵活掌握水洗工具，可用水洗 筐或用纱布包裹，防止水流过大将组织块冲掉或丢失。筐或用纱布包裹，防止水流过大将组织块冲掉或丢失。(四四)脱水脱水 组织块固定后虽然已经硬化，但达不到切薄片的硬度，必须制成石组织块固定后虽然已经硬化，但达不到切薄片的硬度，必须制成石蜡组织块，脱水是继固定后的重要步骤。蜡组织块，脱水是继固定后的重要步骤。经固定和水

16、洗后的组织含大量水分，在这种情况下首先必须除去经固定和水洗后的组织含大量水分，在这种情况下首先必须除去组织内部的水分，这种除水的过程叫做脱水，脱水使用的药剂称为脱组织内部的水分，这种除水的过程叫做脱水，脱水使用的药剂称为脱水剂。水剂。脱水必须逐渐依次从低浓度酒开始到高浓度酒，否则引起组织强烈脱水必须逐渐依次从低浓度酒开始到高浓度酒，否则引起组织强烈收缩，变脆不利制片。脱水不彻底也很难浸进石蜡。收缩，变脆不利制片。脱水不彻底也很难浸进石蜡。现在学习的是第14页，共39页 常用脱水剂：常用脱水剂：溶于水和透明剂的试剂，如酒精、丙酮、正丁醇等。溶于水和透明剂的试剂，如酒精、丙酮、正丁醇等。（1 1）

17、酒精）酒精步骤：步骤：7070 8080 9090 9595 100100 100100，一般数小时到，一般数小时到1212小时，更换一次酒精。小时，更换一次酒精。配低浓度酒精时，可用市售配低浓度酒精时，可用市售9595酒精配制。酒精配制。7070酒精：酒精：9595酒精酒精70ml70ml加蒸馏水加蒸馏水25ml25ml至至95ml95ml；8080酒精：酒精：9595酒精酒精80ml80ml加蒸馏水至加蒸馏水至95ml95ml，依次类推。，依次类推。（2 2）丙酮）丙酮 脱水作用与酒精相似，虽其脱水作用比酒精强，但可引起组织块的收脱水作用与酒精相似，虽其脱水作用比酒精强，但可引起组织块的收

18、缩较，价钱较贵，故不宜用于一般组织脱水，它即有脱水作用又有透明作缩较，价钱较贵，故不宜用于一般组织脱水，它即有脱水作用又有透明作用，用丙酮固定的材料要小，脱水用，用丙酮固定的材料要小，脱水1 18 8小时即可。小时即可。现在学习的是第15页，共39页（五）透明（五）透明目的：目的：因为酒精与蜡不能相交换需要借助石蜡诱导剂的媒介作用。石因为酒精与蜡不能相交换需要借助石蜡诱导剂的媒介作用。石蜡诱导剂渗入之后组织块往往呈现透明状态，习惯上将石蜡诱导剂渗蜡诱导剂渗入之后组织块往往呈现透明状态，习惯上将石蜡诱导剂渗入组织内的过程叫透明，用于透明的试剂称为透明剂。入组织内的过程叫透明，用于透明的试剂称为透

19、明剂。透明时间：透明时间：根据组织块的大小而定，根据组织块的大小而定，一般一般2020分钟至分钟至1 1小时小时。组织块过大。组织块过大可延长透明时间，透明好的材料如同油炸的感觉呈透明状。可延长透明时间，透明好的材料如同油炸的感觉呈透明状。透明剂：透明剂：二甲苯、氯仿、甲苯、香柏油等。二甲苯、氯仿、甲苯、香柏油等。最常用二甲苯最常用二甲苯。二甲苯：二甲苯：无色透明有机溶媒，有很强的刺激气味，易挥发，长期接触无色透明有机溶媒，有很强的刺激气味，易挥发，长期接触对粘膜有刺激作用，透明作用很强，可使组织收缩变形，透明时间不宜过对粘膜有刺激作用，透明作用很强，可使组织收缩变形，透明时间不宜过长。如遇到

20、组织块内部或某一个部位呈白色混浊状态时说明脱水不彻底，长。如遇到组织块内部或某一个部位呈白色混浊状态时说明脱水不彻底，如果造成透明不彻底应退回到如果造成透明不彻底应退回到100100酒精中重新透明。酒精中重新透明。现在学习的是第16页，共39页六、浸蜡与包理：六、浸蜡与包理：浸蜡的目的：浸蜡的目的：为了能制作薄切片做准备，将透明好的为了能制作薄切片做准备，将透明好的组织块浸到融化的石蜡中，使石蜡渗透到组织细胞内组织块浸到融化的石蜡中，使石蜡渗透到组织细胞内，将组织细胞内的二甲苯完全彻底地取代出来，再用，将组织细胞内的二甲苯完全彻底地取代出来，再用石蜡将组织包埋，冷却后，切成小块，修整好切面，石

21、蜡将组织包埋，冷却后，切成小块，修整好切面，这一过程为浸蜡与包埋。这一过程为浸蜡与包埋。现在学习的是第17页，共39页具体操作：具体操作：（一）浸蜡（一）浸蜡石蜡箱温度石蜡箱温度5860左右，内有标明左右，内有标明、的蜡杯或蜡缸的蜡杯或蜡缸，从透明的二甲苯，从透明的二甲苯取出组织块，放入取出组织块，放入号蜡杯中号蜡杯中2h3h，再将，再将组织块移入组织块移入号蜡杯（纯蜡）号蜡杯（纯蜡）2h4h，再移入，再移入号蜡杯中（纯蜡号蜡杯中（纯蜡）半天或者稍降蜡箱温度过夜，最后用融化的纯蜡作为包埋用）半天或者稍降蜡箱温度过夜，最后用融化的纯蜡作为包埋用的蜡。的蜡。注意：注意：浸蜡时蜡杯不要颠倒顺序使用，

22、以免脱二甲苯不彻底浸蜡时蜡杯不要颠倒顺序使用，以免脱二甲苯不彻底。如遇特殊情况需要延长浸蜡时间时可降低蜡箱温度或关闭蜡箱，。如遇特殊情况需要延长浸蜡时间时可降低蜡箱温度或关闭蜡箱，需要时再开。温度越高，时间越长组织块收缩越严重，而且材料脆需要时再开。温度越高，时间越长组织块收缩越严重，而且材料脆而不易制作切片。而不易制作切片。现在学习的是第18页，共39页（二）包埋：（二）包埋：包埋方法：包埋方法：石蜡包埋法、火棉胶包埋法、炭蜡包埋法、明胶包埋法石蜡包埋法、火棉胶包埋法、炭蜡包埋法、明胶包埋法、环氧树脂包埋法（电镜用）等。、环氧树脂包埋法（电镜用）等。步骤：纯石蜡溶解后（步骤：纯石蜡溶解后（6

23、0）倒入包埋框内或纸盒内，迅速将浸好的组）倒入包埋框内或纸盒内，迅速将浸好的组织块的切面向下、放平，依次摆入框内，待蜡逐渐冷却凝固后，将组织材织块的切面向下、放平，依次摆入框内，待蜡逐渐冷却凝固后，将组织材料凝结在石蜡内。然后按组织块大小切成蜡块，组织四周蜡边留料凝结在石蜡内。然后按组织块大小切成蜡块，组织四周蜡边留0.1厘米左厘米左右即可。右即可。注意：注意：如果操作不熟练或在冬天包埋时最好用酒精灯。在材料包入石蜡之如果操作不熟练或在冬天包埋时最好用酒精灯。在材料包入石蜡之前，稍在酒精灯上过一下加温，以免材料与包埋蜡温度不符造成材料与包前，稍在酒精灯上过一下加温，以免材料与包埋蜡温度不符造成

24、材料与包埋蜡间遗留缝隙，切片时产生分离现象。埋蜡间遗留缝隙，切片时产生分离现象。蜡块背面要标记例号等字样的纸片，以长期保存。切完的蜡块表面要蜡块背面要标记例号等字样的纸片，以长期保存。切完的蜡块表面要用烫片板，烫一下封闭材料面，隔离空气接触可长期保存材料不干。用烫片板，烫一下封闭材料面，隔离空气接触可长期保存材料不干。现在学习的是第19页，共39页（三）蜡的种类：（三）蜡的种类：1蜂蜡：是动物体内提取的蜡，颜色微黄故也称为黄蜡，溶蜂蜡：是动物体内提取的蜡，颜色微黄故也称为黄蜡，溶点在点在54左右。特点是润滑带有粘性，冬天用量比夏天多。左右。特点是润滑带有粘性，冬天用量比夏天多。2石蜡：是由矿物

25、质中提取，质地较疏松，色白。根据蜡的溶石蜡：是由矿物质中提取，质地较疏松，色白。根据蜡的溶点不同又可分为软蜡及硬蜡。点不同又可分为软蜡及硬蜡。软蜡：软蜡：50以下的石蜡。硬蜡：溶点在以下的石蜡。硬蜡：溶点在50以上的石蜡。两种蜡可以上的石蜡。两种蜡可以混合在一起使用。石蜡熔点有以混合在一起使用。石蜡熔点有5254，5658，5860，6062。现在学习的是第20页，共39页七、切片七、切片工具：工具：切片刀、磨刀机、切片机、水浴锅，干燥箱等；载薄片切片刀、磨刀机、切片机、水浴锅，干燥箱等；载薄片、手术刀、毛笔、弯镊子、托盘、大平皿（展片使用）、烤片、手术刀、毛笔、弯镊子、托盘、大平皿（展片使用

26、）、烤片盒、蛋白甘油等。盒、蛋白甘油等。（一）切片机种类：（一）切片机种类：轮转式切片机、滑行式切片机（滑动式）、轮转式切片机、滑行式切片机（滑动式）、冰冻切片机、超薄切片机等（电镜用）。冰冻切片机、超薄切片机等（电镜用）。（二）构造：（二）构造：由四个基本部分组成：刀台、标本台、旋转轮、控制切片由四个基本部分组成：刀台、标本台、旋转轮、控制切片厚度的微动装置（标有厚度的微动装置（标有 l25或或150的数字，每一数字代表一个微的数字，每一数字代表一个微米）。根据需要调节厚度，米）。根据需要调节厚度，一般采用一般采用5m7m。蛋白甘油：蛋白甘油：用鸡蛋清（不要鸡蛋黄）用玻璃棒充分搅拌后用数用鸡

27、蛋清（不要鸡蛋黄）用玻璃棒充分搅拌后用数层纱布过滤后加等量的甘油搅均匀加数颗麝香草酚。层纱布过滤后加等量的甘油搅均匀加数颗麝香草酚。现在学习的是第21页，共39页（三）切片制作（三）切片制作1将洁净的载薄片涂薄层蛋白甘油放人烤片盒内待用。将洁净的载薄片涂薄层蛋白甘油放人烤片盒内待用。2将切割修整好的蜡块用普通刀片先将蜡块的组织切面暴露出来将切割修整好的蜡块用普通刀片先将蜡块的组织切面暴露出来修平，固定在切片机上的标本台上并拧紧螺旋。修平，固定在切片机上的标本台上并拧紧螺旋。3蜡块先固定在标本台上切片刀固定于刀台上，拧紧固定刀的螺丝同时蜡块先固定在标本台上切片刀固定于刀台上，拧紧固定刀的螺丝同时

28、调整刀与蜡块的切片距离使刀与蜡块贴紧后再固定刀台螺丝，刀的角度调整刀与蜡块的切片距离使刀与蜡块贴紧后再固定刀台螺丝，刀的角度为为25度角。度角。4调节微动装置，调至切片所需厚度（一般为调节微动装置，调至切片所需厚度（一般为 5m7m）。）。5修材。右手握旋转轮摇把按顺时针方向均匀地摇动直到组织块修材。右手握旋转轮摇把按顺时针方向均匀地摇动直到组织块切面完整暴露为止。切面完整暴露为止。现在学习的是第22页，共39页（四）展片（四）展片 水浴锅上平皿内水温升至水浴锅上平皿内水温升至45左右，将已切好的连续薄片切分成数左右，将已切好的连续薄片切分成数片，放在水面，轻漂，水中展平，未展平时可用小弯镊子

29、轻轻展开，然片，放在水面，轻漂，水中展平，未展平时可用小弯镊子轻轻展开，然后用涂有蛋白甘油的载片在水中选择完整的切片进行捞片。后用涂有蛋白甘油的载片在水中选择完整的切片进行捞片。（五）注意事项（五）注意事项 1切片刀要锋利，否则切片有切痕或组织破碎，甚至不能制成切片切片刀要锋利，否则切片有切痕或组织破碎，甚至不能制成切片。2展切片时水温要适当，水温低，展不平切片，切片有皱折，影响效展切片时水温要适当，水温低，展不平切片，切片有皱折，影响效果；如果水温过高，切片入水后可发生溶化果；如果水温过高，切片入水后可发生溶化。现在学习的是第23页，共39页实习四法医病理学实习四法医病理学 组织切片染色组织

30、切片染色现在学习的是第24页，共39页目的要求：目的要求：掌握切片染色、封片等技术及操作过程。掌握切片染色、封片等技术及操作过程。一、染色前准备工作一、染色前准备工作1染色：准备的工具：染色缸或者染色：准备的工具：染色缸或者12个盛各种不同浓度的酒精染色筐个盛各种不同浓度的酒精染色筐广口瓶，染色缸及脱蜡、透明用的各二个二甲苯染色缸，盖片，带磨广口瓶，染色缸及脱蜡、透明用的各二个二甲苯染色缸，盖片，带磨口盖树胶瓶一个，镊子口盖树胶瓶一个，镊子1把。把。2染色需要的试剂及染色液的配制：染色需要的试剂及染色液的配制：0.51盐酸盐酸酒精：酒精：用于细胞核染色分色。用于细胞核染色分色。配制：配制：10

31、0ml的的7080酒精中加人酒精中加人0.5ml或者或者1ml的浓盐酸。的浓盐酸。苏木素（苏木素（hematoxylin）及伊红（）及伊红（eosin）苏木素：苏木素：细胞核的染料，氧化后的苏木素具有染色能力的。细胞核的染料，氧化后的苏木素具有染色能力的。苏木素的配方：二种，一是自然氧化的苏木素；二是加入氧化剂苏木素的配方：二种，一是自然氧化的苏木素；二是加入氧化剂加速氧化的。加速氧化的。现在学习的是第25页，共39页3苏木素的配方苏木素的配方自然氧化（自然氧化（Ehrlieh）苏木素：）苏木素：苏木精苏木精 2g 铵明矾铵明矾 3g 无水酒精无水酒精 100ml 甘油甘油 100ml 蒸馏水

32、蒸馏水 100ml 将上述药品配在一起后装入玻璃瓶中，瓶口罩上数层纱布将上述药品配在一起后装入玻璃瓶中，瓶口罩上数层纱布以防灰尘落入染液，暴露于阳光中或空气中自然氧化（成熟过以防灰尘落入染液，暴露于阳光中或空气中自然氧化（成熟过程），约程），约6周周8周以上，染液配制越久其染色能力越强，可周以上，染液配制越久其染色能力越强，可以一次大量配制以备用。以一次大量配制以备用。现在学习的是第26页，共39页 自然氧化（自然氧化（Delafield）苏木素：）苏木素：苏木素苏木素 4g 无水酒精无水酒精 25ml 铵明矾饱和水溶液铵明矾饱和水溶液 400ml铵明矾饱和水溶液配法：铵明矾饱和水溶液配法：1

33、0铵明矾水溶液，或铵明矾水溶液，或1份铵明矾加蒸份铵明矾加蒸馏水馏水11份。份。配制过程：配制过程：苏木素溶入酒精后，加入铵明矾液，倒入玻璃瓶中苏木素溶入酒精后，加入铵明矾液，倒入玻璃瓶中敞开瓶口，罩以数层纱布，置光线充足处敞开瓶口，罩以数层纱布，置光线充足处3 5天后过滤，再加天后过滤，再加入入甘油甘油100ml、甲醇甲醇100ml。置光线充足处经。置光线充足处经l.52个月后成熟。个月后成熟。染液可保存多年，染色时多采用蒸馏水稀释的染色液。染液可保存多年，染色时多采用蒸馏水稀释的染色液。现在学习的是第27页，共39页 加氧化剂的苏木素配制加氧化剂的苏木素配制 Harris苏木素：苏木素：液

34、液 苏木精苏木精 l g 无水酒精无水酒精 10 ml 液液 钾（铵）明矾钾（铵）明矾 20 g 蒸馏水蒸馏水 200 ml 氧化汞氧化汞 0.5 g 冰醋酸冰醋酸 8 ml配制方法：配制方法：先将液用玻璃棒搅拌使苏木素溶解，再将液煮沸先将液用玻璃棒搅拌使苏木素溶解，再将液煮沸溶化去火，速加入液，再加火，煮沸后去火，立即加入氧化溶化去火，速加入液，再加火，煮沸后去火，立即加入氧化汞汞0.5g，再煮沸，迅速冷却后加入冰醋酸，再煮沸，迅速冷却后加入冰醋酸8ml过滤使用，组织学常用过滤使用，组织学常用染色液。染色液。现在学习的是第28页，共39页4伊红（伊红（eosin）最常用的细胞质染料之一，外观

35、为红色粉末。分两种：最常用的细胞质染料之一，外观为红色粉末。分两种：酒溶性伊酒溶性伊红；水溶性伊红红；水溶性伊红。配法：配法：0.5水溶性伊红水溶性伊红 伊红伊红0.5g+蒸馏水蒸馏水100ml，溶解后使用。，溶解后使用。0.5酒精溶性伊红酒精溶性伊红 伊红伊红0.5g+70酒精酒精100ml，溶解后使用。，溶解后使用。一般病理组织学切片染色，染细胞核用苏木素，染细胞质用一般病理组织学切片染色，染细胞核用苏木素，染细胞质用伊红，故一般称这种染色法为伊红，故一般称这种染色法为HE染色（苏木素染色（苏木素伊红染色法）。伊红染色法）。现在学习的是第29页，共39页二、染色方法及步骤二、染色方法及步骤

36、1.脱蜡：二甲苯脱蜡：二甲苯10min20min；二甲苯；二甲苯10min 20min。2脱苯：脱苯：100无水乙醇脱苯无水乙醇脱苯2min5min；100无水乙醇无水乙醇2min5min。3水化：水化：95酒精酒精90酒精酒精80酒精酒精70酒精各数秒至酒精各数秒至 1min，水浸洗数分钟，水浸洗数分钟。4染细胞核：切片移入苏木素染液中染染细胞核：切片移入苏木素染液中染10min20min。5水洗（水洗一下将浮在表面的染液去掉）。水洗（水洗一下将浮在表面的染液去掉）。6分化：分化：l盐酸酒精分化时间数秒钟，观察切片组织材料呈粉红色。盐酸酒精分化时间数秒钟，观察切片组织材料呈粉红色。7水洗：水

37、道流水洗水洗：水道流水洗0.5数小时，切片从粉红色转变为鲜艳的蓝色（蓝化过程）。数小时，切片从粉红色转变为鲜艳的蓝色（蓝化过程）。8染细胞质：染细胞质：0.5或或l伊红溶液复染伊红溶液复染1min5min。9脱水：切片脱水由低浓度酒到高浓度酒精。将切片入脱水：切片脱水由低浓度酒到高浓度酒精。将切片入70酒精酒精809095。切片在酒精内几秒钟，时间长，伊红易脱色。应注意伊红与苏木素的对比。切片在酒精内几秒钟，时间长，伊红易脱色。应注意伊红与苏木素的对比染色的色调适合。染色的色调适合。10.脱水：脱水：100酒精酒精5min10min；100酒精酒精 5min10min11.透明：入二甲苯透明：

38、入二甲苯2min5min；二甲苯；二甲苯2min5min。现在学习的是第30页，共39页三、封片与染色结果三、封片与染色结果 用中性树胶进行封固切片，细胞核经苏木素染成鲜艳的蓝色，用中性树胶进行封固切片，细胞核经苏木素染成鲜艳的蓝色，细胞质核仁、肌纤维、胶原纤维、红细胞等呈红色。细胞质核仁、肌纤维、胶原纤维、红细胞等呈红色。HE染色简化程序：（脱蜡、水化）二甲苯染色简化程序：（脱蜡、水化）二甲苯二甲苯二甲苯无水无水酒精酒精无水酒精无水酒精95908070水洗水洗苏木素苏木素染色（染细胞核）（染色（染细胞核）（10min20min）自来水洗一下自来水洗一下1盐酸酒盐酸酒精分化精分化自来水洗（核分

39、化）自来水洗（核分化）伊红染色（染细胞质）伊红染色（染细胞质）直接脱水直接脱水70809095（各稍停片刻）（各稍停片刻）100100（彻底脱水（彻底脱水）透明，二甲苯透明，二甲苯二甲苯二甲苯，中性树胶封片。，中性树胶封片。现在学习的是第31页，共39页常规涂片染色的操作方法：常规涂片染色的操作方法：基本与石蜡切片染色程序一样。基本与石蜡切片染色程序一样。不同点：固定液不同，操作时间短。不同点：固定液不同，操作时间短。步骤：步骤：涂片自然干燥或加温干燥后甲醇固定，待固定液干燥后，涂片自然干燥或加温干燥后甲醇固定，待固定液干燥后，苏木素染色苏木素染色2min5min水洗一下去浮色水洗一下去浮色1

40、盐酸酒精分化（浸盐酸酒精分化（浸12次）次）流水洗切片（流水洗切片（5min以上）。以上）。伊红染色伊红染色2min5min脱水：脱水：70酒精酒精809095各数秒各数秒，100100各稍停片刻（彻底脱水）各稍停片刻（彻底脱水）透明：二甲苯透明：二甲苯二甲苯二甲苯，中性树胶封片。，中性树胶封片。现在学习的是第32页，共39页 四、两种常用的特殊染色方法四、两种常用的特殊染色方法 （一）（一）Mallory染色染色 配方：配方：酸性复红酸性复红 3克克 苯胺兰苯胺兰 1克克 桔黄桔黄G 3克克 磷钼酸磷钼酸 1克克 蒸馏水蒸馏水 200ml现在学习的是第33页，共39页染色方法：染色方法：1石

41、蜡切片常规脱蜡至水。石蜡切片常规脱蜡至水。2入入3重铬酸钾媒染重铬酸钾媒染12h24h，如果固定的材料含升汞可省此步，如果固定的材料含升汞可省此步骤，但需脱汞。骤，但需脱汞。3蒸馏水洗二次。蒸馏水洗二次。4入入Mallory染色液中染染色液中染5min。5.蒸馏水洗。蒸馏水洗。695酒精分化约酒精分化约3min5min，显微镜下控制染色程度。，显微镜下控制染色程度。7100、100酒精脱水。酒精脱水。8二甲苯二甲苯、二甲苯、二甲苯透明。透明。9树胶封片。树胶封片。结果：结果：胶原纤维及粘液呈深蓝色，红细胞呈红黄色，肌组胶原纤维及粘液呈深蓝色，红细胞呈红黄色，肌组织呈红色，弹力纤维呈玫瑰红色。织

42、呈红色，弹力纤维呈玫瑰红色。现在学习的是第34页，共39页Contused myocardial fibers stained by Mallorys trichrome method现在学习的是第35页，共39页 （二）（二）Weigert染色（弹力纤维染色法）染色（弹力纤维染色法）配方：配方：盐基品红盐基品红 2g 间苯二酚间苯二酚 4g 蒸蒸 馏馏 水水 200ml 配制方法：配制方法：将上述药品一起放入烧杯内，加热煮沸，再加将上述药品一起放入烧杯内，加热煮沸，再加29FeCl3水溶液水溶液25ml，用玻璃棒搅匀，继续煮沸，用玻璃棒搅匀，继续煮沸2min5min，冷却后过滤，冷却后过滤。

43、倾去滤液不用，将滤纸及沉淀物一同放入烧杯内，放在干燥箱内烘。倾去滤液不用，将滤纸及沉淀物一同放入烧杯内，放在干燥箱内烘干，取出加干，取出加 95酒精酒精200ml，加水煮至沉淀物溶尽，拿出滤纸冷却后，加水煮至沉淀物溶尽，拿出滤纸冷却后过滤并补足蒸发失去的酒精，最后加入浓盐酸过滤并补足蒸发失去的酒精，最后加入浓盐酸4ml即可，此液可保留即可，此液可保留数月。数月。现在学习的是第36页，共39页染色方法：染色方法：1切片脱蜡至酒精。切片脱蜡至酒精。2Weigert氏液染色氏液染色20min60min。3用用95酒精洗去剩余染液，在显微镜下观察结构细节，不清酒精洗去剩余染液，在显微镜下观察结构细节，

44、不清晰时可用晰时可用1盐酸酒精分化。盐酸酒精分化。4自来水洗。自来水洗。5以以l中性红做对比染色或用明矾苏木素染后，再用稀释伊红或用中性红做对比染色或用明矾苏木素染后，再用稀释伊红或用Van Gieson液染色。液染色。6用用95酒精分化，无水酒精脱水。酒精分化，无水酒精脱水。7二甲苯二甲苯、透明。透明。8树胶封片。树胶封片。结果：结果：弹力纤维显示兰黑色。用中性红做对比染色，肌组织弹力纤维显示兰黑色。用中性红做对比染色，肌组织 呈红色。呈红色。现在学习的是第37页，共39页Elastic fibers 现在学习的是第38页，共39页Collagen and elastic system in the remodelling process ofmajor types of idiopathic interstitial pneumonias(IIP)Histopathology 2005,46,413421现在学习的是第39页，共39页