第九讲凝胶电泳技术.ppt

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1、第九讲凝胶电泳技术现在学习的是第1页，共46页 凝胶电泳凝胶电泳(gel electrophoresis)技术技术现在学习的是第2页，共46页 核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术现在学习的是第3页，共46页 蛋白分子杂交技术蛋白分子杂交技术现在学习的是第4页，共46页 细胞转化（原核）细胞转化（原核）/转染（真核）转染（真核）现在学习的是第5页，共46页 PCR PCR扩增扩增现在学习的是第6页，共46页 DNA DNA测序测序DNA测序仪现在学习的是第7页，共46页 蛋白测序蛋白测序现在学习的是第8页，共46页 文库构建文库构建现在学习的是第9页，共46页 酵母双杂交酵母双杂交现在学习的是第1

2、0页，共46页RNARNA干扰干扰(RNAi):):转录后基因沉默技术转录后基因沉默技术现在学习的是第11页，共46页 第一节第一节 凝胶电泳技术凝胶电泳技术 凝胶电泳（凝胶电泳（Gel electrophoresis）是以凝胶为载体，以电流为驱动，用于分离不同大小、形状、等电点是以凝胶为载体，以电流为驱动，用于分离不同大小、形状、等电点等分子的技术。凝胶电泳通常用于分析用途。但也可以作为制备技术，如等分子的技术。凝胶电泳通常用于分析用途。但也可以作为制备技术，如在使用质谱在使用质谱(MS)、PCR、克隆、克隆、DNA测序、免疫印迹等检测之前用测序、免疫印迹等检测之前用于提纯分子。于提纯分子。

3、现在学习的是第12页，共46页一、核酸的凝胶电泳一、核酸的凝胶电泳 基本原理基本原理 在在buffer为为PH8.0时，带有时，带有负电荷的负电荷的 DNA或或RNA核苷酸链，核苷酸链，依靠无反应活性的稳定介质（依靠无反应活性的稳定介质（琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶或或聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶凝胶）和缓冲液，和缓冲液，在电场中以一定的迁移率在电场中以一定的迁移率从负极移向正极从负极移向正极。根据核。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。现在

4、学习的是第13页，共46页电泳槽电泳槽电泳仪电泳仪梳子梳子电泳槽电泳槽制胶板制胶板正极电源正极电源插孔插孔负极电负极电源插孔源插孔电源线电源线电泳槽电泳槽现在学习的是第14页，共46页现在学习的是第15页，共46页现在学习的是第16页，共46页 电泳的迁移率取决于核酸分子本身的电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大小大小和和构型构型 分子量较小的分子量较小的DNA分子比分子量较大的分子比分子量较大的DNA分子迁移率分子迁移率要快要快；同等分子量的不同构型的核酸分子，同等分子量的不同构型的核酸分子，构型紧密的比线性构型紧密的比线性DNA分子要快分子要快，线性线性DNA分子比开环分子比开环DNA分子要

5、快。分子要快。现在学习的是第17页，共46页图2 线性DNA电泳图现在学习的是第18页，共46页 凝胶电泳的分辨力：凝胶电泳的分辨力：与凝胶的类型类型和密度密度相关 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶的分辨力在0.250Kb之间;聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺的分辨力在11000bp之间现在学习的是第19页，共46页聚丙烯酰胺凝胶电泳图（高分聚丙烯酰胺凝胶电泳图（高分辨率，辨率，1bp1bp差异可区分）差异可区分）琼脂糖凝胶电泳图琼脂糖凝胶电泳图现在学习的是第20页，共46页（一）琼脂糖凝胶电泳（一）琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。分为常熔点的琼脂糖常熔点的琼脂糖和低熔点（低熔点（LM

6、P）琼）琼脂糖脂糖。现在学习的是第21页，共46页 LMP琼脂糖琼脂糖 熔点：熔点：6265 熔解后，在熔解后，在37 可保持液态数小时；可保持液态数小时；在在25 可保持液态约可保持液态约10min 应用：应用：直接酶切，回收直接酶切，回收DNA分子；分子；在在65 下将下将LMP琼脂糖凝胶熔化；琼脂糖凝胶熔化；加入过量的酚抽提加入过量的酚抽提DNA；离心获得含离心获得含DNA分子的上清液。分子的上清液。现在学习的是第22页，共46页琼脂糖凝胶电泳图琼脂糖凝胶电泳图现在学习的是第23页，共46页 琼脂糖凝胶电泳的参数：琼脂糖凝胶电泳的参数：缓冲液：缓冲液：1 TAE或或TBE 凝胶的含量：根

7、据检测的凝胶的含量：根据检测的DNA大小大小 加加DNA样品：样品：1g，指示剂，指示剂 电泳条件：大片断低电压长时间，小片段高电压短时间电泳条件：大片断低电压长时间，小片段高电压短时间 染色和观察：染色和观察：溴化乙锭（溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色）染色，在在300nm波长的紫外下观察（波长的紫外下观察（凝胶成像仪凝胶成像仪）。能看到）。能看到0.05 g的微量的微量DNA DNA的片断大小与荧光强度成正比的片断大小与荧光强度成正比 现在学习的是第24页，共46页 TAE:电泳大于电泳大于13kb的片段时用的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果。缓冲液将取得更好

8、的分离效果。TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。TBE:缓冲能力强，长时间电泳时可选用缓冲能力强，长时间电泳时可选用TBE，并且当用于电泳小，并且当用于电泳小于于1kb的片段时分离效果更好的片段时分离效果更好（常用）（常用）。TPE的缓冲能力也较强，但由于磷酸盐易在乙醇沉淀过程中析出，所以也的缓冲能力也较强，但由于磷酸盐易在乙醇沉淀过程中析出，所以也不宜在回收不宜在回收DNA片段的电泳中使用。片段的电泳中使用。电泳反冲液电泳反冲液现在学习的是第25页

9、，共46页Separation Range Vs.%Agarose Low Geling Agarose 4-6 0.02-0.4现在学习的是第26页，共46页注意：注意：EB（Ethidium bromide，溴化乙锭）为强致癌物！，溴化乙锭）为强致癌物！现在学习的是第27页，共46页Agarose gel electrophoresis现在学习的是第28页，共46页现在学习的是第29页，共46页现在学习的是第30页，共46页现在学习的是第31页，共46页凝胶成像仪凝胶成像仪现在学习的是第32页，共46页 用已知分子量的标准用已知分子量的标准DNA对对DNA片断大小的估算片断大小的估算 现在

10、学习的是第33页，共46页二、琼脂糖凝胶电泳的的影响因素二、琼脂糖凝胶电泳的的影响因素琼脂糖主要在琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质制备电泳中作为一种固体支持基质,其密其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性在中性pH值下带负电荷值下带负电荷的的DNA向阳极迁移向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定其迁移速率由下列多种因素决定:1、DNA的分子大小的分子大小:线状双链线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也

11、越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。现在学习的是第34页，共46页2、琼脂糖浓度琼脂糖浓度一个给定大小的线状一个给定大小的线状DNA分子分子,其迁移速度在不同浓度的其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于分子的大小。分离小于0.5kb的的DNA片段所需胶浓度是片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于分离大于10kb的的DNA分分子所需胶浓度为子所需胶浓度为0.3-0.7%,D

12、NA片段大小间于两者之间则所需胶片段大小间于两者之间则所需胶浓度为浓度为0.8-1.0%。现在学习的是第35页，共46页3、DNA分子的构象分子的构象 当当DNA分子处于不同构象时分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子它在电场中移动距离不仅和分子量有关量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋超螺旋DNA移动快移动快,而线状双链而线状双链DNA移动要慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上移动要慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条有数条DN

13、A带难以确定是质粒带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有不同构象引起还是因为含有其他其他DNA引起时引起时,可从琼脂糖凝胶上将可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收带逐个回收,用同一用同一种限制性内切酶分别水解种限制性内切酶分别水解,然后电泳然后电泳,如在凝胶上出现相同的如在凝胶上出现相同的DNA图谱图谱,则为同一种则为同一种DNA。现在学习的是第36页，共46页4、电源电压电源电压 在低电压时在低电压时,线状线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正片段的迁移速率与所加电压成正比。比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁片段的迁移率将以不同的

14、幅度增长移率将以不同的幅度增长,片段越大片段越大,因场强升高引起的迁因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于范围将缩小。要使大于2kb的的DNA片段的分辨率达到最大片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过所加电压不得超过5v/cm。现在学习的是第37页，共46页5、嵌入染料的存在、嵌入染料的存在 荧光染料荧光染料溴化乙啶溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使，

15、使其刚性更强其刚性更强,还会还会使线状使线状DNA迁移率降低迁移率降低15。现在学习的是第38页，共46页6、离子强度影响离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。的电泳迁移率。在在没有离子存在时没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小，电导率最小，DNA几乎不移动几乎不移动，在，在高离子强度的缓冲液中高离子强度的缓冲液中(如误加如误加10电电泳缓冲液泳缓冲液),则则电导很高并明显产热电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化严重时会引起凝胶熔化或或DNA变性变性。现在学习的是第39页，共46页第二节第二节 分

16、子杂交分子杂交 一一 Southern杂交杂交二二 Northern杂交杂交三三 菌落原位杂交菌落原位杂交四四 Western杂交杂交现在学习的是第40页，共46页分子杂交分子杂交(molecule hybridization)【分子杂交分子杂交】是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用已知标记的已知标记的核酸分子核酸分子或或蛋白质分子蛋白质分子检测混合样品中未知核酸分子或检测混合样品中未知核酸分子或蛋白质分子，以及其相对分子量大小蛋白质分子，以及其相对分子量大小。根据其检测对象的不同可分为根据其检测对象的不同可分为 Southern 杂交、

17、杂交、Northern 杂交和杂交和 Western 杂交杂交，及由此演化的及由此演化的斑点杂交和菌落杂交等。斑点杂交和菌落杂交等。现在学习的是第41页，共46页分子杂交可在分子杂交可在DNA与与DNA、RNA与与RNA或或RNA与与DNA的二条的二条单链之间进行，也可能在蛋白质与蛋白质之间进行。单链之间进行，也可能在蛋白质与蛋白质之间进行。【核酸分子杂交核酸分子杂交】是指核酸分子是指核酸分子(DNA或或RNA)在变性以后，在在变性以后，在复性的过程中两个不同来源的且同源的核酸分子形成杂合双链的过复性的过程中两个不同来源的且同源的核酸分子形成杂合双链的过程。程。通过各种方法将核酸分子固定在固相

18、支持物上，然后用放射性标记通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或或RNA分分子所处的位置。子所处的位置。现在学习的是第42页，共46页现在学习的是第43页，共46页探针标记方法探针标记方法体内体内(in vivo)标记标记是将放射性标记的化合物作为代谢底物加到活细胞是将放射性标记的化合物作为代谢底物加到活细胞培养体系中去，经细胞的合成代谢而使核素掺入到新合成的核酸分子培养体系中去，经细胞的合成代谢而使核素掺入到新合成的核酸分子中去。中去。体外标记法体外标记法分为化学法和酶法：分为

19、化学法和酶法：化学法化学法。最常用的是。最常用的是125I标记和光敏生物素标记和光敏生物素(photobiotin)标记。标记。酶法酶法也叫酶促标记法，将标记物预先标记到核苷酸也叫酶促标记法，将标记物预先标记到核苷酸(NTP或或dNTP)分分子上，然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子掺人到探针分子中子上，然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子掺人到探针分子中去，或将核苷酸分子上的标记基因交换到探针分子上。去，或将核苷酸分子上的标记基因交换到探针分子上。现在学习的是第44页，共46页(1)缺口平移法：缺口平移法：DNaseI是在两条链的不同部位随机打开缺口，从而使两条链都被核素均匀地标是在两条链的不同

20、部位随机打开缺口，从而使两条链都被核素均匀地标记，使得标记的记，使得标记的DNA具有较高的放射比活性。具有较高的放射比活性。3种三磷酸脱氧核糖核苷酸如种三磷酸脱氧核糖核苷酸如dATP、dTTP、dGTP，一种核素标记的核苷酸一种核素标记的核苷酸32PdCTP，待标记，待标记DNA片段。片段。在极微量在极微量DNA聚合酶的作用下，在双链聚合酶的作用下，在双链DNA分子的一条链上随机切开若干个缺分子的一条链上随机切开若干个缺口而不是切断口而不是切断DNA或将其降解，然后，大肠杆菌或将其降解，然后，大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I在切口的在切口的3OH端端逐个加入新的核苷酸，同时由于该酶具有逐个加入新的核苷酸，同时由于该酶具有5，3外切酶的活性，它同时切除外切酶的活性，它同时切除5，端游离的核苷酸，端游离的核苷酸，3端核苷酸的加入和端核苷酸的加入和5，端核苷酸的切除同时进行导致切口沿，端核苷酸的切除同时进行导致切口沿着着DNA链移动。链移动。现在学习的是第45页，共46页现在学习的是第46页，共46页