细胞周期的调控与检测讲稿.ppt

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1、关于细胞周期的调控与检测第一页，讲稿共四十五页哦 生命是如何生长、生存、繁衍和死亡？在每一个生命个体中都存在一个精密的生命是如何生长、生存、繁衍和死亡？在每一个生命个体中都存在一个精密的程序，或生物钟。生物钟决定着细胞是否、何时生长、分裂、或死亡。这就是细胞程序，或生物钟。生物钟决定着细胞是否、何时生长、分裂、或死亡。这就是细胞周期调控机制，它在相关基因的控制下，依据一定的规则和节奏运行着，调控细胞周期调控机制，它在相关基因的控制下，依据一定的规则和节奏运行着，调控细胞的生长、分裂和死亡。在胚胎细胞，细胞周期保持快速运行，在一些成年细胞中其的生长、分裂和死亡。在胚胎细胞，细胞周期保持快速运行，

2、在一些成年细胞中其运行慢得多，而在神经元细胞周期几乎完全不运行。在生长过程中的细胞，如果细运行慢得多，而在神经元细胞周期几乎完全不运行。在生长过程中的细胞，如果细胞周期不能运行，结果是死亡。而在成熟细胞，细胞周期不正确的运行，结果则是胞周期不能运行，结果是死亡。而在成熟细胞，细胞周期不正确的运行，结果则是肿瘤的发生。肿瘤的发生。细胞周期细胞周期(cell cycle)细胞周期调控细胞周期调控(cell cycle regulation)“细胞周期细胞周期”也称也称“细胞分裂周期细胞分裂周期”，是指一个细胞经生长、分裂而增殖成两个所经历，是指一个细胞经生长、分裂而增殖成两个所经历的全过程，通常可

3、分为若干阶段，即的全过程，通常可分为若干阶段，即G1期、期、S期、期、G2期和期和M期。细胞在期。细胞在G1期完成必要的期完成必要的生长和物质准备，在生长和物质准备，在S期完成其遗传物质期完成其遗传物质染色体染色体DNA的复制，在的复制，在G2期进行必要的期进行必要的检查及修复以保证检查及修复以保证DNA复制的准确性，然后在复制的准确性，然后在M期完成遗传物质到子细胞中的均等期完成遗传物质到子细胞中的均等分配，并使细胞一分为二。分配，并使细胞一分为二。一、基本概念介绍一、基本概念介绍第二页，讲稿共四十五页哦2001 Nobel PrizeLeland H.Hartwell 1970s“Chec

4、kpoint”Yeast genetics100 CDC genesStart geneTim Hunt 1980sCyclinsSea UrchinsPaul M.Nurse1970sCDKsyeast 二、历史回顾二、历史回顾第三页，讲稿共四十五页哦生命复制之谜的揭开生命复制之谜的揭开 （1）1858年建立细胞理论：年建立细胞理论：生命的基本形式是细胞，机体由细胞构成，细胞的生长复制形成了生物体的生命的基本形式是细胞，机体由细胞构成，细胞的生长复制形成了生物体的生长繁衍，细胞的异常或死亡导致机体的疾病或死亡。生长繁衍，细胞的异常或死亡导致机体的疾病或死亡。（2 2）19511951年发现了

5、细胞分裂周期：年发现了细胞分裂周期：G1 S G2 M G0G1 S G2 M G0 细胞生长中有两种形式细胞生长中有两种形式-有丝分裂期和细胞间期有丝分裂期和细胞间期M期）期）DNA合成前期（合成前期（）DNA合成期（合成期（）DNA合成后期（合成后期（）前期前期中期中期后期后期末期末期第四页，讲稿共四十五页哦（3 3）随着成熟刺激因子（）随着成熟刺激因子（maturation promoting factor,MPF），），细胞周期素细胞周期素（cyclin），），细胞周期素依赖性蛋白激酶细胞周期素依赖性蛋白激酶(cyclin dependent kinasedependent kinas

6、e，CDK)CDK)的发的发现使对细胞周期及与肿瘤的发生发展关系的研究有了很大进展。现使对细胞周期及与肿瘤的发生发展关系的研究有了很大进展。第五页，讲稿共四十五页哦三、细胞周期各时相的动态变化三、细胞周期各时相的动态变化、G1期（期（DNA合成前期，指合成前期，指有丝分裂完成到有丝分裂完成到DNA合成之前合成之前的一段时间）的一段时间）RNA在此期大量合成，导致蛋白质量明显增加。在此期大量合成，导致蛋白质量明显增加。S期所需的期所需的DNA复制复制相关的酶系，如相关的酶系，如DNA聚合酶，聚合酶，G1期向期向S期转变相关的蛋白质如触发蛋白、钙调期转变相关的蛋白质如触发蛋白、钙调蛋白、细胞周期蛋

7、白等均在此期合成。蛋白、细胞周期蛋白等均在此期合成。蛋白质的磷酸化作用在蛋白质的磷酸化作用在G1期开始增加，这将有利于期开始增加，这将有利于G1晚期染色体结构成晚期染色体结构成分的重排。非组蛋白、一些蛋白激酶在分的重排。非组蛋白、一些蛋白激酶在G1期也可发生磷酸化，已知大多数蛋期也可发生磷酸化，已知大多数蛋白激酶磷酸化发生于其丝氨酸或苏氨酸、酪氨酸部位。白激酶磷酸化发生于其丝氨酸或苏氨酸、酪氨酸部位。第六页，讲稿共四十五页哦 触发蛋白触发蛋白是一种不稳定蛋白，它对细胞从是一种不稳定蛋白，它对细胞从G1期进入期进入S期是必期是必须的。只有当其含量积累到临界值，细胞周期才能朝须的。只有当其含量积累

8、到临界值，细胞周期才能朝DNA合成方向进行。合成方向进行。钙调蛋白钙调蛋白是真核细胞内重要的钙受体，它调节细胞内钙的水平，是真核细胞内重要的钙受体，它调节细胞内钙的水平，钙调蛋白的含量，在钙调蛋白的含量，在G1晚期可达峰值，用抗钙调蛋白药物处理细晚期可达峰值，用抗钙调蛋白药物处理细胞，可延缓其从胞，可延缓其从G1期到期到S期的进程。期的进程。G1期蛋白质量的增加，可能与蛋白质合成增强有关，而期蛋白质量的增加，可能与蛋白质合成增强有关，而另一原因则可能使其降解的减弱。另一原因则可能使其降解的减弱。第七页，讲稿共四十五页哦、S期（期（DNA合成期，合成期，从从DNA合成开始到合成开始到DNA合成结

9、束的全过程，合成结束的全过程，是细胞增殖周期的关键阶段）是细胞增殖周期的关键阶段）S期是细胞进行大量期是细胞进行大量DNA复制的阶段，组蛋白及非组蛋白也在此期大量合成，复制的阶段，组蛋白及非组蛋白也在此期大量合成，最后完成染色体的复制最后完成染色体的复制（）（）DNA复制需要多种酶的参与复制需要多种酶的参与 包括包括DNA聚合酶、聚合酶、DNA连接酶、胸腺嘧啶核苷酸激酶、核苷酸还原连接酶、胸腺嘧啶核苷酸激酶、核苷酸还原酶等。随着细胞由酶等。随着细胞由G1期进入期进入S期，这些酶的含量或活性可显著增高期，这些酶的含量或活性可显著增高（）（）DNA复制具有严格的时间顺序复制具有严格的时间顺序 通常

10、，通常，GC含量较高的含量较高的DNA序列在早序列在早S期复制，晚期复制，晚S期复制的主要为含期复制的主要为含量高的量高的DNA序列；就染色体而言，常染色体的复制较异染色体要早，典型序列；就染色体而言，常染色体的复制较异染色体要早，典型的例子如人类女性的细胞中，当其它染色体都被复制完以后，才开始进行的例子如人类女性的细胞中，当其它染色体都被复制完以后，才开始进行纯化的纯化的X染色体复制。染色体复制。第八页，讲稿共四十五页哦（）（）S期是细胞合成的主要时相期是细胞合成的主要时相 此时细胞质中可出现大量的组蛋白此时细胞质中可出现大量的组蛋白mRNA，新合成的组蛋白从胞质进入新合成的组蛋白从胞质进入

11、胞核，与复制后的胞核，与复制后的DNA迅速结合，绕成核小体，进而形成具有两条单体迅速结合，绕成核小体，进而形成具有两条单体的染色体。除了蛋白质合成以外，在的染色体。除了蛋白质合成以外，在S期细胞中不断进行着组蛋白的持续期细胞中不断进行着组蛋白的持续磷酸化。磷酸化。（）中心粒的复制也在（）中心粒的复制也在S期完成期完成 原本垂直的一对中心粒发生分离，各自在其垂直方向形成一个子中原本垂直的一对中心粒发生分离，各自在其垂直方向形成一个子中心粒，由此形成的两对中心粒在以后的细胞周期进程中，将发挥微管组心粒，由此形成的两对中心粒在以后的细胞周期进程中，将发挥微管组织中心的作用，纺锤体微管，星体微管的形成

12、均与此相关。织中心的作用，纺锤体微管，星体微管的形成均与此相关。第九页，讲稿共四十五页哦、G2期（期（DNA合成后期，合成后期，从从DNA复制完成到有丝分裂开始前的时期，为有丝复制完成到有丝分裂开始前的时期，为有丝分裂分裂 进行物质条件进行物质条件）为细胞分裂准备期，细胞中合成一些与为细胞分裂准备期，细胞中合成一些与M期结构功能相关的蛋白质，与核膜期结构功能相关的蛋白质，与核膜破裂，染色体凝集相关的成熟促进因子在此期合成。破裂，染色体凝集相关的成熟促进因子在此期合成。微管蛋白微管蛋白G期合成达高峰，为期合成达高峰，为M期纺锤体微管的形成提供了丰富的来源。期纺锤体微管的形成提供了丰富的来源。已经

13、复制的中心粒在已经复制的中心粒在G2期逐渐长大，并开始向细胞两极分离。期逐渐长大，并开始向细胞两极分离。、M期（有丝分裂期，细胞经过分裂将染色体平均分配到两个子细胞中）期（有丝分裂期，细胞经过分裂将染色体平均分配到两个子细胞中）在此期细胞中，染色体凝集后发生姊妹染色单体的分离，核膜核仁破在此期细胞中，染色体凝集后发生姊妹染色单体的分离，核膜核仁破裂后再重建，胞质中有纺锤体收缩环出现，随着两个子核的形成，胞质也裂后再重建，胞质中有纺锤体收缩环出现，随着两个子核的形成，胞质也一分为二，由此完成细胞分裂。一分为二，由此完成细胞分裂。第十页，讲稿共四十五页哦G1期：为期：为DNADNA合成准备所需要的

14、合成准备所需要的RNARNA、蛋白质、脂类、糖类等蛋白质、脂类、糖类等G1早期：细胞的生长早期：细胞的生长G1晚期：为晚期：为S S期的期的DNADNA合成做准备合成做准备S S期（期（DNADNA合成期）合成期）DNADNA合成合成(复制复制)染色体蛋白的合成：组蛋白、非染色体蛋白的合成：组蛋白、非组蛋白等组蛋白等中心粒的复制中心粒的复制G2G2期（期（DNADNA合成后期）合成后期）有活跃的有活跃的RNARNA和蛋白质合成和蛋白质合成微管蛋白，促有丝分裂因子（微管蛋白，促有丝分裂因子（MPFMPF）中心粒向两极移动中心粒向两极移动M M期（有丝分裂期）期（有丝分裂期）DNADNA、RNAR

15、NA、蛋白质合成停止。蛋白质合成停止。细胞发生一系列形态变化、结构建成。细胞发生一系列形态变化、结构建成。将加倍的将加倍的DNADNA平均分配到两个子细胞中平均分配到两个子细胞中第十一页，讲稿共四十五页哦细胞周期调控研究过程的重要事件细胞周期调控研究过程的重要事件-MPF的发现：的发现：最早发现，最早发现，MPF是一种在是一种在MPF由调节亚单位细胞周期素（由调节亚单位细胞周期素（cyclin）和催化亚单位细）和催化亚单位细胞周期素依赖性蛋白激酶（胞周期素依赖性蛋白激酶（CDK）组成。组成。1、细胞周期调控蛋白（细胞周期调控蛋白（cell cycle-regulating protein)四、

16、细胞周期的调控四、细胞周期的调控第十二页，讲稿共四十五页哦2）细胞周期调控蛋白的种类）细胞周期调控蛋白的种类A、CDK类蛋白激酶：类蛋白激酶：CDK与细胞周期素结合才具有激酶的活性，故名细胞周期素依赖性蛋与细胞周期素结合才具有激酶的活性，故名细胞周期素依赖性蛋白激酶白激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)。作用：作用：CDK可将特定蛋白磷酸化，促进细胞周期运行。可将特定蛋白磷酸化，促进细胞周期运行。在动物中已知在动物中已知7种种CDK，CDK1-7。B、细胞周期素细胞周期素（cyclin)特点：在细胞周期中呈周期性变化。特点：在细胞周期中呈周期性变化。作用：能与作用：能

17、与CDK结合，激活结合，激活CDK，间接调节细胞周期运行。间接调节细胞周期运行。已知已知30余种，在脊椎动物中为余种，在脊椎动物中为cyclinA1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等。等。第十三页，讲稿共四十五页哦脊椎动物 芽殖酵母 激酶复合体 Cyclin CDK Cyclin CDK G1-CDK Cyclin D*CDK4、6 Cln 3 CDK1(CDC28)G1/S-CDK Cyclin E CDK2 Cln 1、2 CDK1(CDC28)S-CDK Cyclin A CDK2 Clb 5、6 CDK1(CDC28)M-CDK Cyclin B CDK1(CDC2)

18、Clb 1-4 CDK1(CDC28)Cyclins与与CDKs结合后，结合后，CDKs才具有活性，它们两者的结合才具有活性，它们两者的结合使细胞周期有序进行。具体结合方式如下：使细胞周期有序进行。具体结合方式如下：第十四页，讲稿共四十五页哦C、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CKI)CKI对细胞周期起负调控作用，分为：对细胞周期起负调控作用，分为：Ink4:P16ink4a,P15ink4b,P18ink4c,P19ink4d。特异性抑制特异性抑制cdk4-cyclin D1,cdk6-cyclin D1。Kip：P21cip1、P27kip1、P57kip2，

19、抑制大多数抑制大多数CDK的激酶活的激酶活性。性。P21cip1还能与还能与DNA聚合酶聚合酶的辅助因子的辅助因子PCNA结合，直接结合，直接抑制抑制DNA的合成。的合成。作用机制：未完全清楚，大多数作用机制：未完全清楚，大多数CKI是通过直接与是通过直接与Thr160/161磷酸化后的磷酸化后的CDK-cyclin复合物密切结合，直接抑制其蛋白激酶活性。复合物密切结合，直接抑制其蛋白激酶活性。现较为肯定的是现较为肯定的是p21，其调控水平在基因转录的层面，当其调控水平在基因转录的层面，当DNA损伤和细胞衰老损伤和细胞衰老时，具有转录因子作用的时，具有转录因子作用的p53增高，抑制其蛋白激酶活

20、性，阻滞细胞周期的进行。增高，抑制其蛋白激酶活性，阻滞细胞周期的进行。第十五页，讲稿共四十五页哦CDK activating第十六页，讲稿共四十五页哦第十七页，讲稿共四十五页哦由于某些环境因素的作用细胞周期出现故障或差错，由于某些环境因素的作用细胞周期出现故障或差错，这些信号可是细胞停留在某些点上，称为限制点。这些信号可是细胞停留在某些点上，称为限制点。主要检验点：主要检验点：G1/S限制点：限制点：DNA是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？积是否足够大？在酵母中称在酵母中称start点，在哺乳动物中称点，在哺乳动物中称R点点(restrict

21、ion point)。S期限制点：期限制点：DNA复制是否完成？复制是否完成？G2/M限制点：限制点：DNA是否损伤？细胞体积是否足够大？是否损伤？细胞体积是否足够大？中中-后期限制点：纺锤体组装限制点后期限制点：纺锤体组装限制点。2、细胞周期限制点（、细胞周期限制点（check point）第十八页，讲稿共四十五页哦Four checkpoints第十九页，讲稿共四十五页哦3、调控细胞周期的内、外源信号系统、调控细胞周期的内、外源信号系统单细胞生物的增殖取决于营养，多细胞生物细胞的增殖与信号途径有关。单细胞生物的增殖取决于营养，多细胞生物细胞的增殖与信号途径有关。A、生长因子：生长因子：是与

22、细胞增殖有关的信号物质，已知几十种，多数能促进细是与细胞增殖有关的信号物质，已知几十种，多数能促进细胞增殖，又称有丝分裂原（胞增殖，又称有丝分裂原（mitogen），），如如EGF、NGF。作用方式：旁分泌。作用方式：旁分泌。信号通路：信号通路：ras途径，途径，cAMP途径、磷脂酰肌醇途径。途径、磷脂酰肌醇途径。B、抑素（抑素（chalone)是一种由细胞自身产生、分泌的，对细胞增殖起抑制作用是一种由细胞自身产生、分泌的，对细胞增殖起抑制作用的糖蛋白，与膜上的受体结合，引起信号转换及在胞内传递，影响细胞周的糖蛋白，与膜上的受体结合，引起信号转换及在胞内传递，影响细胞周期相关的蛋白的表达。期相

23、关的蛋白的表达。具有严格的组织特异性和细胞周期阶段特异性。具有严格的组织特异性和细胞周期阶段特异性。作用于作用于G1期的抑素可阻止细胞进入期的抑素可阻止细胞进入S期，称期，称S因子。因子。作用于作用于G2期的抑素可阻止细胞进入期的抑素可阻止细胞进入M期，称期，称M因子。因子。第二十页，讲稿共四十五页哦五、五、细胞周期得以进行的两大机制细胞周期得以进行的两大机制 细胞周期得以进行的核心机制是在一系列细胞周期得以进行的核心机制是在一系列cyclin时相起伏时相起伏的调控下，相应的的调控下，相应的CDK依次激活，驱使细胞通过依次激活，驱使细胞通过G1,S,G2期，达期，达到到M期，细胞一分为二，实现

24、忠于亲代的细胞复制。期，细胞一分为二，实现忠于亲代的细胞复制。这一过程的顺利完成取决于这一过程的顺利完成取决于是否启动（启动机制）是否启动（启动机制）和和能能否忠于运行（监控机制）否忠于运行（监控机制），达到忠实复制，是细胞周期调控的，达到忠实复制，是细胞周期调控的两大生物学机制。两大生物学机制。第二十一页，讲稿共四十五页哦1、细胞周期的启动机制、细胞周期的启动机制 细胞周期能否启动进行细胞增殖，主要的调控点在细胞周期能否启动进行细胞增殖，主要的调控点在G1期，它决定细胞是否通过期，它决定细胞是否通过G1期进期进入入S期。期。这一调控点首先在芽殖酵母的研究中被认识，人们称其为这一调控点首先在芽

25、殖酵母的研究中被认识，人们称其为“起始点起始点”（START）。）。一旦细胞通过一旦细胞通过start,它们势必进入它们势必进入S期，完成整个细胞分裂周期。期，完成整个细胞分裂周期。因此因此start有人称之为酵母细胞周期的有人称之为酵母细胞周期的“决定点决定点”。在人体细胞增殖中，在在人体细胞增殖中，在G1期存在相似的调控机制。在期存在相似的调控机制。在G1期较晚时，也有一期较晚时，也有一个决定点，称为个决定点，称为“限制点限制点”（restriction point），），与酵母的与酵母的START功能类似，功能类似，不同的是，人类细胞是否通过不同的是，人类细胞是否通过“限制点限制点”，进

26、入细胞周期，主要受与细胞增殖有关的，进入细胞周期，主要受与细胞增殖有关的细胞外生长因子的调控，而不是营养素。只要有相应的生长因子存在，细胞就能通过细胞外生长因子的调控，而不是营养素。只要有相应的生长因子存在，细胞就能通过R点进入点进入S期，完成整个细胞周期。回到期，完成整个细胞周期。回到G0/1期。相反，如果细胞在期。相反，如果细胞在G1期就期就缺乏相应的生长因子，细胞周期的运行将停止在缺乏相应的生长因子，细胞周期的运行将停止在R点，此时细胞进入点，此时细胞进入“安静安静状态，称之为状态，称之为G0期。期。第二十二页，讲稿共四十五页哦连接信号转导与细胞周期有两条途径，一是连接信号转导与细胞周期

27、有两条途径，一是cyclinD/CDK4，二是二是cyclinE/CDK2。二二者都是者都是G1期进行的限速步骤，即期进行的限速步骤，即cyclinD或或cyclinE的过度表达，均能缩短的过度表达，均能缩短G1期期时间或加速时间或加速G1期进行期进行第二十三页，讲稿共四十五页哦2、细胞周期的监控机制、细胞周期的监控机制 DNA损伤检测点损伤检测点 抑癌基因抑癌基因p53在人类细胞周期在人类细胞周期G1期检测点起着关键性期检测点起着关键性作用。还存在作用。还存在G2期检测点。期检测点。时相次序监测点时相次序监测点 MPF(有丝分裂促进因子有丝分裂促进因子)，可以诱导所有细胞周，可以诱导所有细胞

28、周期时相的细胞核发生染色体凝集。期时相的细胞核发生染色体凝集。B.SPF(S期促进因子期促进因子)，只能诱发，只能诱发G1期细胞进入期细胞进入S期期而不能使而不能使G2期细胞进入期细胞进入M期。期。第二十四页，讲稿共四十五页哦六、细胞周期的界面机制六、细胞周期的界面机制1、细胞周期与、细胞周期与DNA修复修复 所有的真核细胞中都高度保守者这一整套完整的精密机制，承担着所有的真核细胞中都高度保守者这一整套完整的精密机制，承担着DNA损伤、损伤、错误地发现，并将其信号传递给相应的机制，去阻滞细胞周期的运行，并错误地发现，并将其信号传递给相应的机制，去阻滞细胞周期的运行，并同时进行同时进行DNA损伤

29、的修复。然后视修复情况，细胞基因的突变。决定继续分裂或损伤的修复。然后视修复情况，细胞基因的突变。决定继续分裂或死亡，执行一系列细胞的重要生命活动。死亡，执行一系列细胞的重要生命活动。DNA修复方式修复方式 切除修复切除修复 错配修复错配修复:将局部一段错配的寡核苷酸链切除，重新合成之将局部一段错配的寡核苷酸链切除，重新合成之碱基切除修复碱基切除修复核苷酸切除修复核苷酸切除修复全基因组切除修复全基因组切除修复转录切除修复转录切除修复第二十五页，讲稿共四十五页哦2、细胞周期与细胞凋亡、细胞周期与细胞凋亡 细胞凋亡存在有细胞周期特异性，不同因素诱导的细胞凋亡发生细胞凋亡存在有细胞周期特异性，不同因

30、素诱导的细胞凋亡发生在细胞周期不同的时相在细胞周期不同的时相 3、细胞周期与细胞分化、细胞周期与细胞分化 细胞周期不仅与细胞增殖、细胞凋亡有关，还调控着细胞分化细胞周期不仅与细胞增殖、细胞凋亡有关，还调控着细胞分化第二十六页，讲稿共四十五页哦第二十七页，讲稿共四十五页哦1、细胞周期与肿瘤的关系、细胞周期与肿瘤的关系目前从多方面对肿瘤进行了深入研究（流行病学、病因学、遗传），肿瘤是多因素，目前从多方面对肿瘤进行了深入研究（流行病学、病因学、遗传），肿瘤是多因素，多步骤，多阶段的。但是肿瘤的恶性增生从生物学角度看，主要表现在两方面：一多步骤，多阶段的。但是肿瘤的恶性增生从生物学角度看，主要表现在两

31、方面：一是肿瘤细胞的不灭性，即细胞凋亡障碍；二是细胞增殖失控，程序发生紊乱，只是是肿瘤细胞的不灭性，即细胞凋亡障碍；二是细胞增殖失控，程序发生紊乱，只是增殖超常加快。这两方面均已成为肿瘤发生发展研究的热点。增殖超常加快。这两方面均已成为肿瘤发生发展研究的热点。A.通过研究发现了通过研究发现了1.存在于正常细胞内的原癌基因发生错误转变为癌基因存在于正常细胞内的原癌基因发生错误转变为癌基因2.一些基因一些基因失活后正常细胞转变为癌细胞失活后正常细胞转变为癌细胞抑癌基因。经过抑癌基因。经过70年代的癌基因时代，年代的癌基因时代，80年代的抑年代的抑癌基因时代癌基因时代90年代的多基因时代或癌基因蛋白

32、网络时代，提出了一系列的理论：肿年代的多基因时代或癌基因蛋白网络时代，提出了一系列的理论：肿瘤多步骤里论、瘤多步骤里论、DNA修复理论、细胞凋亡理论，进一步阐明细胞周期核心机制、修复理论、细胞凋亡理论，进一步阐明细胞周期核心机制、细胞周期启动机制、细胞周期检测点机制。细胞周期启动机制、细胞周期检测点机制。七、肿瘤与细胞周期七、肿瘤与细胞周期第二十八页，讲稿共四十五页哦2、肿瘤细胞中细胞周期检控机制的破坏肿瘤细胞中细胞周期检控机制的破坏细胞周期中检测细胞周期中检测DNA损伤的检测点至少有两处：损伤的检测点至少有两处：一处在一处在G1-S过渡期：控制进入过渡期：控制进入S期的检测点，防止期的检测点

33、，防止DNA受损细胞进入受损细胞进入S期的期的DNA复制。复制。另一处在另一处在G2-M过渡期：控制进入过渡期：控制进入M期的检测点，防止受损的期的检测点，防止受损的DNA和未完成和未完成复制的复制的DNA进入有丝分裂。进入有丝分裂。A.这些这些DNA损伤检测点的主要机制有二：一是损伤检测点的主要机制有二：一是p53依赖性机制，另一是依赖性机制，另一是p53非依赖性机制每一个完整的检测点应由四部分组成，即发现或传感器非依赖性机制每一个完整的检测点应由四部分组成，即发现或传感器（detect或或sensor）、）、制动或拘留（制动或拘留（stop or arrest）、）、修复（修复（repai

34、r）、）、决决定（定（decision，divide or death）。）。理论上说监测点的任何一部分出理论上说监测点的任何一部分出了问题，都会导致功能的异常，结果是遗传不稳定，基因受损的细了问题，都会导致功能的异常，结果是遗传不稳定，基因受损的细胞存活和复制或细胞遗传物质的改变，如此细胞多步骤进化，最终胞存活和复制或细胞遗传物质的改变，如此细胞多步骤进化，最终成为失控性生长的肿瘤细胞。成为失控性生长的肿瘤细胞。第二十九页，讲稿共四十五页哦3、肿瘤细胞中细胞周期驱动机制的破坏、肿瘤细胞中细胞周期驱动机制的破坏 细胞周期监测点功能的减弱，导致突变基因的累积和正常细胞的进化，只有当这些细胞周期监

35、测点功能的减弱，导致突变基因的累积和正常细胞的进化，只有当这些累积的突变基因破坏了细胞周期驱动机制，细胞才能进入失控性生长的境界。累积的突变基因破坏了细胞周期驱动机制，细胞才能进入失控性生长的境界。人们把细胞周期驱动机制比作一辆汽车或引擎，驱使其运行的因素好比人们把细胞周期驱动机制比作一辆汽车或引擎，驱使其运行的因素好比“油门油门”；制动器运行的机制犹如；制动器运行的机制犹如“刹车刹车”。持续地踏住。持续地踏住“油门油门”或或“刹车刹车”失灵，终将失控。这正是致变因素导致基因突变，检测点基因失灵，终将失控。这正是致变因素导致基因突变，检测点基因突变，突变基因累积，驱动机制失控的必然结果。突变，

36、突变基因累积，驱动机制失控的必然结果。肿瘤的发生发展过程中，监控机制破坏的典型例子是肿瘤的发生发展过程中，监控机制破坏的典型例子是P53基因的突变。大约基因的突变。大约50%的人类肿瘤都存在的人类肿瘤都存在P53基因的突变，说明基因的突变，说明DNA损伤检测点在肿瘤损伤检测点在肿瘤的发生、发展中，具有重要的位置。的发生、发展中，具有重要的位置。第三十页，讲稿共四十五页哦From:British J.Cancer 87:129-133第三十一页，讲稿共四十五页哦1:222-231Mutation of G1/S regulators in human cancer第三十二页，讲稿共四十五页哦八、

37、常用的细胞周期检测方法八、常用的细胞周期检测方法流式细胞术流式细胞术PI(碘化丙锭碘化丙锭),可以与细胞内可以与细胞内DNA和和RNA结合结合,采用采用RNA抑制剂将抑制剂将RNA消化后消化后,通过流式细胞术通过流式细胞术检测到的与检测到的与DNA结合的结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。含量的多少。由于细胞周期各时相的由于细胞周期各时相的DNA含量不同含量不同,因此因此,通过流式细胞术通过流式细胞术PI染色法对细胞内染色法对细胞内DNA含量进行检含量进行检测时测时,可以将细胞周期各时相区分为可以将细胞周期各时相区分为G1/G0期期,S期和期和G2/

38、M期期,并可通过特殊软件计算各时相的百并可通过特殊软件计算各时相的百分率分率:G1/G0期具有二倍体细胞的期具有二倍体细胞的DNA含量含量(2N),G2/M期具有四倍体细胞的期具有四倍体细胞的DNA含量含量(4N),S期的期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。含量介于二倍体和四倍体之间。C.值得注意的是值得注意的是,PI不能通过细胞膜完整的细胞不能通过细胞膜完整的细胞(如活细胞和早期凋亡细胞如活细胞和早期凋亡细胞),在标本制备时在标本制备时,必须先用乙必须先用乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性,才能使才能使PI进入细胞内与细胞内的核酸结合。乙醇通常为终进入细胞内

39、与细胞内的核酸结合。乙醇通常为终浓度为浓度为70%的冷乙醇。的冷乙醇。第三十三页，讲稿共四十五页哦将肿瘤细胞以将肿瘤细胞以1106接种于接种于60mm培养板，培养板，80汇合后传代。汇合后传代。2472小时后用胰酶消化收集细胞，小时后用胰酶消化收集细胞，PBS洗两遍，弃上清，加入洗两遍，弃上清，加入70预冷预冷乙醇中，吹打均匀，乙醇中，吹打均匀，4固定固定12小时以上。小时以上。PBS洗涤去乙醇，洗涤去乙醇，1000rpm,5min，洗两遍。洗两遍。0.5 ml PBS重悬细胞，加入重悬细胞，加入PI和和 RNaseA至终浓度至终浓度50g/ml，37 温浴温浴30 min。用流式细胞仪测定周

40、期。用流式细胞仪测定周期。PI：碘化丙啶，以碘化丙啶，以PBS配成配成1mg/ml，4保存。保存。RNaseA：10mg/ml D D、方法：方法：第三十四页，讲稿共四十五页哦0 200 400 600 8001000DNA contentCount Purdue University Cytometry Laboratories第三十五页，讲稿共四十五页哦G1S phaseG2MG112 1DNA content The Cell CycleDNA content by flow cytometryDeconvolution into cell cycle phasesG0/1G2/MSEv

41、ents第三十六页，讲稿共四十五页哦Measurement of sub G0/1 apoptotic particlesDNA contentEventsEventsG0/1G2/MSApoptosis第三十七页，讲稿共四十五页哦4 hr,control28 hr,irradiatedG1:94.1%S:1.5%G2/M:4.4%G1:94.1%S:1.1%G2/M:4.8%G1:60.6%S:34.9%G2/M:4.5%G1:96.6%S:1.6%G2/M:1.8%10%1%90%4%28 hr,control28 hr,aphidicolin 第三十八页，讲稿共四十五页哦O hr6 hr

42、12 hr18 hr24 hr93.5%86.5%58.5%21.0%2%Induction of p21 results in parallel loss of NPAT foci,down-regulation of histone gene expression and inhibition of S phase entry(1)2 hr4 hr6 hr8 hr10 hr12 hr14 hr24 hr0 hrG1:47.2%S:34.2%G2/M:18.7%G1:46.3%S:34.9%G2/M:18.8%G1:51.9%S:29.8%G2/M:18.4%G1:56.1%S:23.9%G

43、2/M:20.1%G1:57.8%S:17.8%G2/M:24.5%G1:58.5%S:12.5%G2/M:29.0%G1:60.2%S:6.8%G2/M:33.0%G1:60.0%S:3.9%G2/M:36.1%G1:62.1%S:2.4%G2/M:35.5%B.A.第三十九页，讲稿共四十五页哦2、BrdU掺入法掺入法 (S phase)A、原理：原理：在含有在含有5溴脱氧尿嘧啶核苷（溴脱氧尿嘧啶核苷（5Bromodeoxyuriding，BrdU）的培养基中，的培养基中，BrdU能取代胸腺嘧啶脱氧核糖核苷（能取代胸腺嘧啶脱氧核糖核苷（TdR）而渗入到新复制的而渗入到新复制的DNA子链中，子

44、链中，B、染色要点：短时标记染色要点：短时标记 C、主要用于检测生长中的细胞主要用于检测生长中的细胞(S期期)第四十页，讲稿共四十五页哦G0G1SG2PrometaphaseAnaphaseCell cycle-dependent change of NPAT loci in WI38 cells第四十一页，讲稿共四十五页哦3、CFSE标记法标记法A.CFSE：羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯：羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(5-or6-(N-Succinimidyloxycarbonyl)-3,6-O,O-diacetylfluorescein)B.基本原理：基本原理：CFSE能够轻易穿透细胞

45、膜，在活细胞内与胞内蛋白共价结合，水解后能够轻易穿透细胞膜，在活细胞内与胞内蛋白共价结合，水解后释放出绿色荧光。在细胞分裂增殖过程中，它的荧光强度会随着细胞的释放出绿色荧光。在细胞分裂增殖过程中，它的荧光强度会随着细胞的分裂而逐级递减，标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光分裂而逐级递减，标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半，根据这一特性，它可被用于检测细胞增殖，细强度是亲代细胞的一半，根据这一特性，它可被用于检测细胞增殖，细胞周期的估算及细胞分裂等方面。胞周期的估算及细胞分裂等方面。CFSE进入细胞后定位于细胞膜、细胞进入细胞后定位于细胞膜、细胞质和细胞

46、核，在细胞核的荧光染色最强，并证实质和细胞核，在细胞核的荧光染色最强，并证实CFSE不影响细胞的增殖能不影响细胞的增殖能力。此方法操作简单，且不用放射性同位素，不存在安全隐患。力。此方法操作简单，且不用放射性同位素，不存在安全隐患。C.另外，另外，CFSE标记的细胞用于体内观察可以长达数周之久，它常被用来做活体细胞检标记的细胞用于体内观察可以长达数周之久，它常被用来做活体细胞检测实验和用荧光电镜观察细胞长期活动的实验。测实验和用荧光电镜观察细胞长期活动的实验。第四十二页，讲稿共四十五页哦CD4+CD25-T/APC/anti-CD3CD4+CD25+Treg/CD4+CD25-T/APC/an

47、ti-CD3第四十三页，讲稿共四十五页哦九、细胞周期同步化九、细胞周期同步化1、自然同步化、自然同步化多核体：如：粘菌、疟原虫。多核体：如：粘菌、疟原虫。某些水生动物的受精卵：如海胆、海参、两栖类。某些水生动物的受精卵：如海胆、海参、两栖类。增殖抑制解除后的同步分裂：如真菌的休眠孢子移增殖抑制解除后的同步分裂：如真菌的休眠孢子移入适宜环境后，它们一起发芽，同步分裂。入适宜环境后，它们一起发芽，同步分裂。细胞同步化细胞同步化(synchronization)是指在自然过程中发生或经人是指在自然过程中发生或经人为处理造成的细胞周期同步化为处理造成的细胞周期同步化第四十四页，讲稿共四十五页哦感谢大家观看感谢大家观看第四十五页，讲稿共四十五页哦