第四章药物定量分析与分析方法验证 (2)课件.ppt

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1、第四章药物定量分析与分析方法验证第1页，此课件共54页哦基本要求基本要求一、熟悉定量分析样品的前处理方法。二、掌握定量分析方法验证的效能指标。第2页，此课件共54页哦 一、概述 为什么要对定量分析的样品进行前处理？含卤素有机药物 R-X（F，Cl,Br,I）金属有机药物 R-O-Me（有机酸或酚的 含金属有机药物 金属盐；结合不牢固）有机金属药物 R-Me（结合牢固）Pretreatment of sample used in quantitative analysis第3页，此课件共54页哦含卤素药物CX乙烯型卤和芳卤CH2CH XX烯丙型卤和苄卤CH2XCH2CH CH2X卤代烷型CH2C

2、H(CH2)nX n2卤素活泼性IBrClF分子中所含卤原子的个数越多，活泼性越强；同一碳上含多个卤原子或一个苯环上含多个卤原子时，活泼性增强更加明显第4页，此课件共54页哦CCH3OHCH3CCl3CCl3Cl3C三氯叔丁醇六氯对二甲苯COOHIIINHCOCH3CH3CONH泛影酸COOHIIICONHCH3CH3CONH碘他拉酸第5页，此课件共54页哦水解后测定不经有机破坏经有机破坏直接测定配位滴定法氧化还原滴定法碱水解酸水解经还原分解后测定湿法破坏凯氏定氮法干法破坏高温灼烧法氧瓶燃烧法二、常用样品处理方法第6页，此课件共54页哦(一)、直接测定法 葡萄糖酸钙 EDTA配位滴定 富马酸亚

3、铁 邻二氮菲-硫酸铈滴定 葡萄酸锑钠 间接碘量法适用范围：金属原子不直接于碳原子相连或某些C-M键结合不牢固的有机金属药物。CHCHCCOO0Fe第7页，此课件共54页哦1、碱水解法344332334)(NONHAgSCNSCNNHAgNO NaNOAgClAgNONaCl O2HHCOONa3NaClCO)(CHNaOHOHCHCCCl3223 回回流流三氯叔丁醇银量法返滴定适用范围：含卤素有机药物结构中卤素原子结合不牢固的药物。(二)、经水解后测定法第8页，此课件共54页哦2、酸水解法、酸水解法十一烯酸氯化锌十一烯酸锌稀盐酸EDTA配位滴定第9页，此课件共54页哦(三)经氧化还原后测定适用

4、范围：碘原子直接与芳环连接的含碘有机化合物。COOHIIINHCOCH3CH3CONHCOOHH2NNH2+11NaOH +3Zn+3NaI+2CH3COONa+3NaZnO2+3H2O NaI+AgNO3 AgI +NaNO3 1.碱性还原后测定 例如：泛影酸的含量测定2.酸性还原后测定 例如：碘番酸的含量测定 Zn还原 后银量法第10页，此课件共54页哦 3.利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量 （1）含锑药物 例如：葡萄糖酸锑的含量测定 Sb5+2KI Sb3+2K+I2 I2 +2Na2S2O3 2NaI +Na2S4O6 （2）含铁药物 2Fe3+2KI 2Fe2+2K+I2

5、I2 +2Na2S2O3 2NaI +Na2S4O6H+第11页，此课件共54页哦 三、经有机破坏的分析方法 湿法破坏 药物分析中常用的有机破坏的方法有 干法破坏 HNO3-HClO4法 氧瓶燃烧法 湿法破坏 HNO3-H2SO4法 H2SO4-硫酸盐法 HNO3-H2SO4-HClO4法；H2SO4-H2O2；H2SO4-KMnO4 干法破坏 加Na2CO3或MgO以助灰化；温度控制在420 第12页，此课件共54页哦含氮、硫、硫化汞、氯化钠的生物制品、含氮有机合成药物测定的前处理和生物制品中金属元素测定时生物基质的去除。u H2SO4-HNO3u H2SO4-HClO4u H2SO4-H2

6、SO4u HNO3-KMnO4分解剂/消化剂辅助分解剂凯氏定氮法测定含有氨基和酰胺结构的药物结构(一)湿法破坏第13页，此课件共54页哦凯氏定氮法原理 将含氮药物与硫酸在凯氏烧瓶中共热，药物分子中有机结构被“消化”成CO2和H2O，有机结合的氮转化为无机氮，与过量的硫酸结合为硫酸氢铵和硫酸铵，经碱化后释放出氨气，随水蒸气馏出，用硼酸溶液或定量的酸滴定液吸收后，再用酸或碱滴定液滴定。n 常量法含氮量 2530mgn 半微量法含氮量 1.02.0mg第14页，此课件共54页哦凯氏烧瓶K2SO4(提高消解温度)CuSO4(加快消解速度)硫酸碱液硼酸(吸收液)甲基红-溴甲酚绿指示剂硫酸滴定空白校正第1

7、5页，此课件共54页哦(二)干法破坏1.高温灼烧法用于含卤素、含磷药物和药物中砷盐的检查。常加入无水碳酸钠、硝酸镁、氢氧化钙、氧化锌等辅助灰化。2.氧瓶燃烧法 系指将含有待测元素的有机药物置于充满氧气的密闭的燃烧瓶中充分燃烧，使有机结构部分彻底分解为CO2和H2O，待测元素根据电负性的不同转化为不同价态的氧化物，被吸收于适当的吸收液中，再根据其性质和存在方式选择方法进行分析。第16页，此课件共54页哦 1.仪器装置 500ml,1000ml,2000ml,磨口、硬质玻璃锥形瓶 2.称样 固体样；液体样 3.燃烧分解操作法 4.吸收液的选择 用于X、S、Se等的鉴别、检查、含量测定时 多数是H2

8、O或H2O-NaOH；少数为H2O-NaOH-H2O2.第17页，此课件共54页哦第18页，此课件共54页哦有机药物含P吸收液测定方法茜素氟蓝分光光度法(pH4.3 HAc-NaAc Buffer)H2O含F含Br银量法；分光法银量法；汞量法；分光法NaOH溶液含Cl磷钼蓝比色法银量法；碘量法；汞量法；分光法NaOH-硫酸肼饱和液含IH2O2NaOH溶液NaOH-硫酸肼饱和液H2O第19页，此课件共54页哦第二节第二节 定量分析方法特点定量分析方法特点 一、容量分析法 （一）容量分析法的特点 操作简单、快速；比较准确（RSD0.2%）；仪器普通易得。第20页，此课件共54页哦（二）滴定度每1m

9、l规定浓度的滴定液所相当的被测药物浓度。dDcCbBaA被测药物滴定液ABABBAMbanMbMWWABBMbaVmMbam)ml/mg(T第21页，此课件共54页哦%100WFTV(%)含量规定摩尔浓度实际摩尔浓度F%100WFT)VV(%)0含量第22页，此课件共54页哦（一）紫外-可见分光光度法（200nm760nm)灵敏度高，可达10-4g/ml 10-7g/ml 1.特点：准确度高，SRD（%）为2%5%仪器价格低廉，操作简单，易普及，应用范围广。2.朗伯-比耳定律 A=ECL E1%1cm=10/M二、光谱分析法第23页，此课件共54页哦 波长校正用汞灯中较强谱线237.38,25

10、3.65,275.28,296.73,313.16,334.15,365.02,404.66,425.83,546.07nm与576.96nm 或用仪器中氘灯的486.02nm与656.10nm进行校正。吸收度的检定：用K2CrO7(60mg)+0.005mol/LH2SO4液至1000ml 波长(nm)235(最小)257(最大)313(最小)350(最大)E1%1cm 124.5 144.0 48.62 106.6 杂散光检查：试剂 浓度(g/ml)测定波长 透光率(%)NaI 1.00 220nm 0.8 NaNO2 5.00 340nm 0.83.仪器校正和检定第24页，此课件共54页

11、哦 4.对溶剂的要求:220240nm 241250nm 251300nm 300nm以上 溶剂+吸收池A 0.41 0.20 0.10 0.05 5.测定方法 要求供试品溶液的A应在0.3 0.7 第25页，此课件共54页哦（1）对照品比较法RRxxCAAC%100WDVC%100(%)X称样量测得量含量原料药制剂%100(%)标示量称样量平均装量测得量含量%100BWWDVCX第26页，此课件共54页哦2.吸收系数法100EAC%1cm1xx第27页，此课件共54页哦 灵敏度高，可达10-10g/ml 10-12g/ml 在低浓度进行测定，防止F与C不成正比及自熄灭作用 1.特点 用基准物

12、溶液校正仪器灵敏度，防止样品液荧光衰减 灵敏度高，但干扰因素多。制备荧光衍生物，可提高其灵敏度和选择性。用样品量少，操作简单，方法快速，应用范围较广。（二）荧光分光光度法第28页，此课件共54页哦2.荧光分析仪 有二个单色光器激发单色光器与发射单色光 器；且激发光源、样品池和检测器成直角。3.含量测定 常用的方法对照品比较法 Ch.P收载地高辛片、利血平片、洋地黄毒苷片。rbrrxbxxCRRRRC第29页，此课件共54页哦 按分离原理分为：吸附；分配；离子交换；排阻色谱 按分离方法分为：PC；TLC；柱色谱；GC；HPLC。（一）HPLC法 1.对HPLC仪器一般要求 色谱柱、流动相按品种项

13、下要求。色谱柱的理论板数：n=5.54(tR/Wh/2)2 2.系统性试验 分离度：R=2（tR1 tR2)/(W1+W2);要大于1.5 拖尾因子：T=W0.05h/2d1 应在0.9 1.05 三、色谱分析法第30页，此课件共54页哦 内标法加校正因子测定供试品中主成分含量3.测定方法 标准曲线法 外标法测定供试品中主成分含量 外标一点法 应用示例：RP-HPLC法测定盐酸黄酮哌酯片含量，用标准曲线法 如头孢拉丁；头孢羟氨苄；头孢唑啉钠用外标一点法第31页，此课件共54页哦 （二）GC法 1.对GC仪器一般要求 载气为氮气；色谱柱为填充或毛细管柱 色谱柱的理论板数：n=5.54(tR/Wh

14、/2)2 2.系统性试验 分离度：R=2（tR1 tR2)/(W1+W2);要大于1.5 拖尾因子：T=W0.05h/2d1 应在0.9 1.05 第32页，此课件共54页哦 内标法加校正因子测定供试品中主成分含量 3.测定方法 标准曲线法 外标法测定供试品中主成分含量 外标一点法 应用示例：Ch.P(2000)收载的月桂卓酮、维生素E及其片剂、注 射剂、甲酚皂溶液等均采用GC法中的内标法加校正 因子测定含量。第33页，此课件共54页哦目的：证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求效能指标：评价分析方法的尺度效能指标包括:精密度,准确度,检测限,定量限,选择性,线性与范围,耐用性第34页，此课

15、件共54页哦一、准确度（accuracy）系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度。%100(%)%100(%)加入量本底量测得量回收率加入量测得量回收率用回收率(Recovery)表示回收试验加样回收试验第35页，此课件共54页哦1.原料药 可用已知纯度对照品或样品进行测定；或与已建准确度的另一方法测定的结果进行比较。制剂 要考察辅料对回收率的影响。采用在空白辅料中加入原料对照品的方法作回收率试验，然后计算RSD。回收率的RSD2%；用UV和HPLC法时，一般回收率可达98%102%；容量法可达99.7%100.3%第36页，此课件共54页哦（二）数据要求 回收率%=（测定平均值 空

16、白值）/加入量100%要求制备高、中、低三浓度的样品，各测定3次。应报告已知加入量的回收率，或测定结果平均值与真实值之差及其可信限。33，至少9个测定结果第37页，此课件共54页哦二、精密度(Precision)系指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之接近的程度。表示：偏差(d)、标准偏差(s),相对标准偏差(RSD)重复性:同一实验室,同一人多次测定的精密度中间精密度:同一实验室，不同人，不同仪器测定的精密度 重现性:不同实验室，不同人测定的精密度第38页，此课件共54页哦 （一）精密度表示方法 1.偏差(deviation,d)d=测得值-平均值=Xi-X 2.标

17、准偏差（standard deviation,SD或S）S=(Xi X)2/(n-1)1/2 3.相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)也称变异系数 (coefficient of variation,CV)RSD=标准偏差/平均值100%=S/X 100%第39页，此课件共54页哦（二）数据要求 应报告S或SD、RSD和可信限。用统计学的可信性分析(t或f）。第40页，此课件共54页哦三、专属性是指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等)可能存在下，采用的方法能准确测定出被测物的特性。鉴别反应、杂质检查、含量测定方法，均应考察其专属性。（一）鉴别反应 应

18、能与其它共存的物质或相似化合物区分，不含被测组分 的样品均应呈现负反应。第41页，此课件共54页哦 （二）含量测定和杂质测定 色谱法和其他分离法，应附代表性的图谱，以说明专属性。图中应注明各组分的位置，色谱法中分离度应符合要求。在能 获得杂质的情况下，可加到试样中，考察对结果的干扰。在杂 质和降解物不能获得的情况下，可用以验证方法和药典方法进 行对照；也可用对试样加速破坏的方法，比较两种方法。第42页，此课件共54页哦 是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量，是限度检验指 标。它无需测定，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。（一）常用的方法 1.非仪器分析目视法 用已知浓度被测物，试验出

19、能被可靠地 检测出的最低浓度或量。2.仪器分析方法 UV法：LOD=f.3S空=C样/A样 3S空 Flu法：LOD=f.3S空=C样/(F样-F空)3S空 GC和HPLC法：LOD=S/N=2或3 四、检测限（limit of detection,LOD)第43页，此课件共54页哦（二）数据要求 应附测试图，说明测试过程和检测限结果。第44页，此课件共54页哦 是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应 具一定准确度和精密度。杂质和降解产物进行定量测定时，要求LOQ.常用信噪比法确定定量限，一般以S/N=10时相应的浓度进行 测定。五、定量限（limit of quantitatio

20、n,LOQ)第45页，此课件共54页哦 是指在设定的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接 呈正比关系的程度。UV法：首先制备一个标准系列，浓度点n=5;A=0.3.0.7 建立回归方程C=aA+b;r 0.9999。HPLC法：制备一个标准系列，浓度点n=5 7;以C对h或A或与 内标物的峰面积之比，建立回归方程r 0.9999。六、线性第46页，此课件共54页哦是指达到一定精密度、准确度和线性、测试方法适用的高低限度或量的区间。原料药和制剂含量测定：范围应为测试浓度的80%-120%。制剂含量均匀度检查：范围应为测试浓度的70%-130%。溶出度或释放度中的溶出量测定：范围应为限度的20%

21、。七、范围第47页，此课件共54页哦是指在测定条件下有效的变动时，测定结果不受影响的承受 程度。典型的变动因素有：被测溶液的稳定性、样品提取次数、时间等。HPLC法变动因素有：流动相组成与pH，色谱柱，柱温，流速等。GC法变动因素有：色谱柱，固定相，担体、柱温、进样口和检测器温度等。八、耐用性第48页，此课件共54页哦准确度 精密度 重复性中间精密度专属性 检测限 定量限线性/范围耐用性鉴别杂质定量杂质限度含量测定溶出量测定检验项目和验证内容已有重现性验证，不需验证中间精密度如一种方法不够专属，可用其他分析方法予以补充视具体情况予以验证第49页，此课件共54页哦各种含量测定方法对效能指标的要求

22、1.容量分析法 用原料药精制品(含量99.5%)或对照品考察方法的精密度，RSD 0.2%；回收率一般在99.7100.3%之间。2.UV法 用适当浓度的精制品进行测定，其RSD1%。制剂的测定，回收率一般应在98102之间。3.HPLC法 要求RSD2，回收率98102%之间。第50页，此课件共54页哦一、常用样品的种类、采集和贮藏(一)血样 血浆(plasma)血清(serum)全血(二)唾液(三)尿液用于药物剂量回收、尿清除率、生物利用度，药物代谢物及其代谢途径、类型、速率等的研究；临床上用于判断患者是否违反医嘱用药。第51页，此课件共54页哦二、生物样品分析前处理技术全血/血浆，组织(

23、1)蛋白沉淀(2)调节pH选择性溶剂提取RIA残渣化学衍生化(提取烃基化)碱回提酸回提HPLCUV、FLD、ECDTLC分光光度法UV、FLDGCFIDECDN/P-FIDGC-MS第52页，此课件共54页哦1.药物从蛋白结合或缀合物中释出药物从蛋白结合或缀合物中释出 蛋白变性：如应用三氯醋酸、蛋白变性：如应用三氯醋酸、HClO4、有机溶、有机溶剂剂(乙醇、丙酮、乙腈乙醇、丙酮、乙腈)使蛋白沉淀使蛋白沉淀 盐酸水解盐酸水解 酶消化法：最常使用蛋白水解酶中枯草菌溶素酶消化法：最常使用蛋白水解酶中枯草菌溶素(一种细菌性蛋白分解酶，可在一种细菌性蛋白分解酶，可在pH 7.011.0使肽键降解使肽键降解)第53页，此课件共54页哦 MS UVHPLC UV CC)CC(UV PC)TLC(.3ODS2XAD-.2.Chromatogr Column电电化化学学检检测测、荧荧光光、：、荧荧光光洗洗脱脱液液：比比色色、普普通通荧荧光光、洗洗脱脱液液：比比色色、洗洗脱脱原原位位测测定定或或测测定定、型型树树脂脂、活活性性炭炭、凝凝胶胶换换树树脂脂、氧氧化化铝铝、固固相相提提取取柱柱法法：离离子子交交剂剂溶溶剂剂提提取取加加盐盐或或其其他他试试净净化化第54页，此课件共54页哦