苹果多酚类物质的提取分离及活性研究.docx

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1、 分 类 号 . 密 级 , 里 份 代 码 1 0 6 9 7 学 号 20022397 硕 士 学 位 论 文 题目： 苹果多酚类物质的提取分离及活性研究 作 者 ： 任 静 指 异 敦 师 李 多 伟 专、 1 卩枋术职务 副教授 学科 (专业 ) 植物堂 答 辩 日 期 2005-6-8 学 位 授 予 日 期 2 0 0 5 年 6 月 Study on Extraction & Isolation and Activity of Polyphenol in Apple By Jing Ren Thesis Submitted to Northwest University in P

2、artial Fulfillment of the Requirement for the Master Degree Supervised by: Professor: Duowei Li College of Life Science Northwest University Xi， An, 710069, P.RChina June 2005 / 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读学位期间 论文工 作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构 送交论文的复 印件和电子版。本人允许论文被査阅和借阅。学校可以将本学位

3、论 文的全部或部分内容 编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存和汇编本学位论 文 “ 同时，本人保证，毕业后结合学位论文研究课题 再撰写的文章一律注明作者单位为 西北大学。 保密论文待解密后适用本声明。 学 位 论 文 作 者 签 名 ： 指 导 教 师 签 名 : w 年 6 月 日 M 年 月 / I 日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文 不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其 它教育机构的学位或证书而使用过

4、 的材料。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示谢意。 学位论文作者签名： 2 打 | 年 月 汐 日 目 录 . 1 Abstract . 2 第一章文献综述 . 4 1.1 植物多酚类物质研究概述 . 4 1.1.1 植物多酚的概念 . 4 1.1.2 植物多酚的结构及分类 . 4 1.1.3 部分水果中的酚类化合物 . 5 1.1.4 苹果中的主要多酿类物质 . 10 1.1.5 苹果中多酿类物质的作用 . 12 1.1.6 苹果中多勘物质及其在果实发育过程中的变化 . 14 1.1.7 紛类物质的测定方法 . 14 1.2 原花青素的研究概况 .

5、15 1.2.1 原花青素分子结构特点 . 15 1.2.2 原花青素的植物资源 . 16 1.2.3 原花青素的提取分离工艺研究 . 17 1.2.4 原花青素的生物学活性研究 . 18 1.2.5 原花青素的应用研究 . 20 1.3 论文研究的意义和内容 . 21 第二章苹果中活性物质提取条件的研究 . 23 2.1 实验仪器、材料和试剂 . 23 2.2 实验方法 . 23 2.2.1 原料预处理 . 23 2.2.2 苹果中总酿含量的测定 . 23 2.2.3 苹果中原花青素含量的测定 . 25 2.2.4 样品提取率的计算 . 27 2.2.5 溶剂选择试验 . 27 2.2.6

6、不同成熟度的苹果及苹果不同部位中总酚及原花青素含量的测定 . . 28 西北大学硕士学位论文 2.2.7 果渣中多酚类物质提取条件的研究 . 29 2.2.8 正交试验确定提取的最佳条件 . 33 2.2.9 最佳提取工艺的验证 . 35 2.3 .35 第三章苹果渣中原花青素的分离纯化 .36 3.1 不同分离纯化方法比较 . 36 3.1.1 溶剂萃取法 . 36 3.1.2 聚酰胺柱层析法 . 38 3.2 结果与讨论 . 40 第四章苹果多酚的薄层与髙效液相色谱分析 . 41 4.1 实验仪器、样品与试剂 . 41 4.2 薄层法的初步鉴别 . 41 4.2.1 展开剂的选取 . 41

7、 4.2.2 薄层层析组分的定性实验 . 41 4.3 高效液相色谱法 . 43 4.4 .45 第五章活性研究 . 46 5.1 油脂抗氧化性实验的研究 . 46 5.1.1 样品与试剂 . 46 5.1.2 苹果多酚抗氧化性的研究方法 . 46 5.1.3 测定果渣、幼果、新鲜果皮、果肉中多酚 抗氧化性大小 . 47 5.1.4 果渣多酚与其它抗氧化剂抗氧化活性的比较研究 . 49 5 丄 5 果渣多酚抗氧化性的量效关系 . 51 5.1.6 增效剂 . 52 5.1.7 结果与讨论 . 53 5.2 原花青素清除自由基的体外实验研究 . 55 5.2.1 样品与试剂 . 55 5.2.2

8、 清除活性氧的研究方法 . 55 5.2.3 超氧阴离子自由基 A _的生成与清除实验 . 56 5.2.4 羟基自由基（ “ OH)的产生与清除 . 58 5.2.5 讨论与分析 . 60 胃 六 章 賊 . 62 6.1 關 . 62 6.1.1 总酚和原花青素含量测佘方法的建立及最佳提取工艺的研究 . 62 6.1.2 确立原花青素分离方法 . 62 6.1.3 对油脂抗氧化活性的研究 . 63 6.1.4 原花青素清除自由基的研究 . 63 6.2 存在的问题和建议 . 64 参考文献 . 65 致谢 . 72 西北大学硕士学位论文 中文摘要 为了充分利用废弃苹果渣，开发多酚物质原花青

9、素的植物资源，我们主要 以苹果 渣为材料，确立了苹果渣中原花青素的提取条件及分离方法，同时测定 了苹果不同部位 及不同成熟度时总酚和原花青素的含量。在活性研究中以苹果 多酚为样品与常用抗氧化 剂作对比，测定其对猪油的抗氧化性的大小；以从果 渣中分离出的原花青素为样品与常用清除剂作对比，测定其对自由基的清除率 大小。为 苹果多酚作为抗氧化剂应用于食品、药品及化妆品等行业提供了理论 依据。 1. 确定了苹果中总酚和原花青素含量测定的方法，测定出总酚含量的高低为：幼果 鲜 果果皮 干果渔 鲜果肉，原花青素含量的高低为：鲜果果皮 干果渣 鲜果肉 幼果。 2. 以干果渣为原料， 60%丙酮为提取溶剂，用

10、正交试验的方法确定出原花青素 的最佳提 取工艺为 10 倍量 60%丙酮 4(TC 热回流提取 3 次，每次 4 小时。 3. 采用溶剂萃取法和聚酰胺柱层析法分离原花青素，结果前者得率为 0.0342%， 其纯 度为 34.2%;聚酰胺层析法原花青素的得率为 0.0225%，纯度为 43.95%。 虽然聚酰胺 层析法得率较低，但纯度较高，有利于进一步的分离纯化 4. 对于苹果各部位多酚的抗氧化活性研究表明其抗氧化性大小为：干果渣 鲜 果果皮 幼果 鲜果肉。 5. 同其它抗氧化剂相比，其抗氧化性大小为： TBHQ果渣多酚 茶多酚 BHT =VE 6. 果渣多酚的添加量不是越多越好，它存在一个抗氧

11、化一助氧化的平衡浓度 0. 08%,低于此浓度，果渣多酚表现抗氧化性，高于此平衡浓度时表现出助 氧化性。 7. 在抗氧化性实验中果渣多酚配合 Vc 起使用，能起到一定的增效作用。 8. 在原花青素对自由基的清除研究中发现 :果渣中原花青素的浓度与清除 率之间量效关系显著，半清除率浓度 SC5D 约为 6ug/ml。 9. 在原花青素对 “ OH 自由基的清除研究中发现：其清除效果也与其浓度有一 定的关系，但清除效果没有对的清除效果好， SC5()约为 0. 5mg/ml。 关键词：苹果渣；多酚；原花青素：提取分离；抗氧化性；自由基 1 任静 苹果多酚类物质的提取分离和活性研究 2005 年 6

12、 月 Abstract In order to making use of apple pomace enough and developing the plant resources of proanthocyanidins, Apple pomace is used as raw material mainly to establish the method of extraction and separation proanthocyanidins. Meanwhile, total phenolics and proanthocyanidins in different part an

13、d different mature degree in apple are determined. In activity research,use polyphenol of apple pomace to contrast with usual antioxidant to determine the effects on antioxidation to fats. Use proanthocyanidins of apple pomace to contrast with usual scavenger to test the clearance of free radical. A

14、ll of these had provided scientific basis for fiirther research on food industry, pharmacy, cosmetics field. 1. The determination method of total phenolics and proanthocyanidins content in apple are establiahed. The order of total phenolics content is: unmature applepeel of mature apple dry pomace p

15、ulp; the order of proanthocyanidins content is: peel of mature apple dry pomace pulp unmature apple. 2. Using dry apple pomace as raw material, the optimal technique parameter of extracting TF and proanthocyanidins is searched by orthogonal design : 10 times liquid of 60% acetone at 40 C withdraw 3

16、times, 4 hours each time. 3. Using polyamide silica and solvent extraction to isolate PC are studied. The result is : the former withdraws rate is 0.0225% , the pure degree is 43.95%;The latter withdraws rate is 0.0342%, its pure degree is 34.2%.These shows that although the former withdraw rate is

17、lower but its purty is higher,this is good for the PC further seperation. 4. The antioxidative activity of apple polyphenol are researched， it expressed the order of antioxidation is: dry pomace peel of mature apple immature apple pulp. 5. Contrast with other antioxidant ,the activity of antioxidati

18、on is: TBHQ the polyphenol of dry pomace the tea polyphenol BHT= VE 6. The process of antioxidation exsits the equilibrium density 0.08%, lower thanthis density, helps to oxidize ; higher than density expresses to help to antioxidize. 7. In the process of antioxidation , the effect of antioxidation

19、would be increase if pomacce polyphenol match Vc uses together. 2 西北大学硕士学位论文 Q- 8. The scavenging of the free radicals of 2 : The relation of proanthocyanidins quantity and effect is remarkable ,SCs is 6 ug/ ml. 9. The scavenging of the free radicals of “ OH : The relation of proanthocyanidinsquanti

20、ty and effect have certainly, SC50 is 0.05 mg/ ml. Keyword: Apple pomace; Polyphenolics; Proanthocyanidins; Extraction and isolation; Antioxidation; Free radical 3 任静 苹果多酚类物质的提取分离和活性研究 2005 年 6 月 第一章 文献综述 U 植物多酚类物质研究概述 U.1 植物多酚的概念 人们最初研究的植物多酚是单宁， 单宁 （ Tarniin) 词来自皮革工业 , 是 Segiumyu 于 1778 年提出，它指槲树树皮中

21、使生皮成革的成分。按传统定义 单宁是指分 子量在 500 3000 之间的多酚物质，因为它们具有鞣性，或称为栲 胶和植物鞣质，而分 子量过髙或过低均不具有鞣性。对植物多酚的认识几乎与 栲胶生产同步，但由于人们最 初对多酚的性质和应用主要基于其与蛋白质的 反应特性，而单宁是体现这一特性的有效 成分，故长期以来相关科学，尤其是 葡萄、苹果加工行业习惯于用 单宁 一词来 代替 多酚 ，并一直混用至今。 二十世纪五十年代以后随着植物多酚与蛋白质、多糖、 生物碱、微生物、酶、 金属离子反应活性及抗氧化、捕捉自由基、衍生化反应等一系列 化学行为被揭 示，人们发现无论从化学、生物、药学等活性看，还是从应用角

22、度考虑， 有效 成分均不限于植物单宁，还包括其许多前体化合物，因而人们逐渐淡化了单宁 与 非 单宁的界限，而将植物中所含的单宁及与单宁有生源关系的化合物作为研 究对象，将 其成为植物多盼 （ Plant polyphenol; Plant polyphenolics)。 1.1.2 植物多酚的结构及分类 通常称植物植物多盼为次生代谢物质 (Secondary metabolic compounds )。植 物次 生代谢物质是指那些对植物整体或某一部分的存活非必需的化合物 2】 。它 们具有以下特 征：结构的多样性和综合性、来自有限的生物合成前体，较为典 型的前体有：磷酸烯醇 式丙酮酸、丙酮酸盐

23、、醋酸盐、几种氨基酸、乙酰一 CoA 和两二敢一 CoA。 植物多酚结构复杂，支链较多，可以与多种糖甙键结合，所以多酚类化合物 多种多 样（表 1)。这些酚类化合物存在于大多数果实和蔬菜中。酚类化合物组 成了具有广泛结 构和功能的主要类别的次生代谢物，但大多数是带有一个或多 个羟基取代基的芳香环。 对于多酚的分类多种多样。 K. Frendenberg 于 1920 年按照单宁的化学 结构特征 将其分为水解单宁 （ Hydrolysable tannins)和缩和单宁 （ Condensedtannins),这是传统的公 认的分类方法。除典型的水解和缩和鞣质外，还发现了 4 西北大学硕士学位论

24、文 一类兼具二者结构和性质的一类揉质，称为新型錄质 （ new type tennin) 3。皮 革工业 根据其鞣性将其分为单宁和非单宁。基于代谢生源可以将其分为：那些 来源于莽草酸途 径和苯丙氨酸代谢途径的化合物，有人认为它们为 多元酚 ， 这并不合适，因为并不 是所有的化合物都是羟基衍生物。尤其是肉桂酸、莽草 酸和奎尼酸等一些化合物，尽管 它们缺乏酚基甚至没有芳香环，但考虑到代谢 途径仍称它们为酚类化合物。根据分子结 构来描述多酚时，其特征是一些组成 型碳原子与基础的酚框架结构相连（表 1)。分布最 为广泛和种类最多的化合物 是具有 C6 C3 C6 黄酮框架的类黄酮，其中在苯环间的 C3

25、 桥通常与氧环化。 少数的类黄酮结构依据 C3 部分的不饱和度和氧化程度来区分。还有的 分类则依 据与环相连的取代基的数量和类别。酚类化合物还包括了聚合木质素和缩合单 tj! 1,4,5,6】 1.1.3 部分水果中的酚类化合物 植物是多酚化合物的主要来源。植物不同器官之间、同一种的不同种群之 间，多酚 化合物的种类和数量不同。果实和蔬菜的每一部分都含有多酚化合物 , 酚类化合物种类 繁多，并且多以复杂的混合物存在，水果中已发现约有 1400 余 种，并不时有新的多酚 物质发现。 人们对水果多酚研究主要集中在果实褐变和果酒（葡萄酒和苹果酒）的风 味研究上。 褐变（ Browning)分为酶促性

26、褐变和非酶促褐变，前者有多酚氧化 酶（ PPO)参与，将多 酚氧化生成颜色深的醌类物质，而后者没有酶的参与， 主要机制包括金属离子和酚类化 合物相互作用、抗坏血酸降解和 Mallard 反应 7】 。 不同的水果中，占主要成分的多盼物质有所不同（表 3)。这些紛类化合物 或賦予 它们各自不同的特征或赋予水果更大的营养价值。如柿子涩味是由于它 含有大量的单宁； 核果坚硬的果实外壳是由于大量的木质素导致，而某些葡萄 品种中含有的一种多羟基芪 类化合物白藜芦醇是亦具有降血脂、抗血栓、增强 免疫力等生物活性；含有大量花青素 的櫻桃被用作食用色素添加剂。目前多酚 研究最为系统的水果是葡萄，其次是苹果。

27、5 任静 苹果多酚类物质的提取分离和活性研究 2005 年 6 月 表 1 植物酚类化合物的主要类别 Table 1 The main classes of plant polyphenolics 8 c6-c2 苯乙酮类 3 乙酰一 6 甲氧苯甲醛 Acetophenones 3-acetyl-6-methoxybenzaldehyde 苯乙酸类 邻羟基苯乙酸 Phenylacetic acids p-hydroxyphenlacetic 9 c6-c3 羟基肉桂酸类 咖啡酸 Caffeic acid Hydroxycinnamic acids 阿魏酸 Ferulic acid 苯丙烯类 肉

28、豆蔻油酸 Myristicin Phenylpropenes 丁香酸（丁香酿 ） Eugenol 香豆素类 7 羟基香豆素 (氧杂奈邻酮） Umbelliferone Coumarins 秦皮乙素（ 6,7-二羟基香豆 素 ） Aesculetin 色酮类 岩白菜内酯（异香豆素异构 Chromones 体 ） Bergenin 丁子香色酮 Eugenin 10 c6-c4 萘醌类 胡桃醌（ 5-羟基 -1,4-奈醌） Juglone 7 c6-c, 酚 酸 类 Phenolic acid 邻 羟 基苯 甲 酸 p-hydroxybenzoic acid 水 杨 酸 salicylic acid 碳 原 子 数 Number of 基 本 碳 架 种 类 Basic carbon Classes 举 例 Example Carbon atoms Skeleton 6 C6 简 单 酚 类 苯 邻 二酚 （ 儿茶 素 ） Catechol Simple phenol 苯 醌 类 对 苯 二酣 （ 氧 醌 ） Hydroquinone 2,6 二 甲 氧基 苯 醌 Benzowuinones 2,6 Dime