液相色谱法讲稿.ppt

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1、关于液相色谱法第一页，讲稿共三十七页哦第十章第十章 高效液相色谱法高效液相色谱法High Performance Liquid Chromatography,HPLC一、一、HPLC概述概述二、高效液相色谱仪二、高效液相色谱仪三、高效液相色谱法的类型三、高效液相色谱法的类型第二页，讲稿共三十七页哦一、高效液相色谱法概述一、高效液相色谱法概述n气相色谱：气相色谱：流动相为气体流动相为气体n液相色谱：液相色谱：流动相为液体，流动相为液体，70年代以后，在高压下输送流动相，称之为年代以后，在高压下输送流动相，称之为高效液相色谱（高压液相色谱），简称为高效液相色谱（高压液相色谱），简称为HPLC。主要

2、差别：主要差别：n分析对象差别分析对象差别GC（20）：）：能气化、热稳定性好且沸点较低的样品，能气化、热稳定性好且沸点较低的样品，HPLC（80）：）：溶解后能制成溶液的样品，分子量大、难气化、热稳定性溶解后能制成溶液的样品，分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测差及高分子和离子型样品均可检测n流动相差别流动相差别 GC：流动相为惰性气体；组分与流动相无作用力，只与固定相作用流动相为惰性气体；组分与流动相无作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体（种类多，另可选用不同比例的多种液体作为流动相）；流动相与流动相为液体（种类多，另可选用不同比例的多种液体作为流动相）；流动

3、相与组分间有亲合作用力，柱选择性好、分离效果佳组分间有亲合作用力，柱选择性好、分离效果佳n操作条件差别操作条件差别 GC：加温操作加温操作 HPLC：室温；高压室温；高压第三页，讲稿共三十七页哦二、高效液相色谱仪二、高效液相色谱仪高效液相色谱仪简单流程图第四页，讲稿共三十七页哦2.1 高压输液系统高压输液系统n贮液器：贮液器：贮存流动相，由玻璃、不锈钢或氟塑料作成（贮存流动相，由玻璃、不锈钢或氟塑料作成（0.52L）n高压泵高压泵：作用：将贮液器中的流动相以作用：将贮液器中的流动相以高压（高压（150350105 Pa）形式连续不断形式连续不断地送入柱系统地送入柱系统 性能：高压、恒流、压力变

4、化小、流量范围可调、耐腐蚀、密封性好性能：高压、恒流、压力变化小、流量范围可调、耐腐蚀、密封性好 主要类型：往复式柱塞泵（恒流）主要类型：往复式柱塞泵（恒流）当柱塞推入缸体时，泵头出口（上部）的单向阀打开，同时，流动相进入的单向阀（下部）关闭，这时就输出少量的流体。反之，当柱塞向外拉时，流动相入口的单向阀打开，出口的单向阀同时关闭，一定量的流动相就由其储液器吸入缸体中。第五页，讲稿共三十七页哦（内梯度）（外梯度）n梯度洗脱置（程序升温装置）：梯度洗脱置（程序升温装置）：概念：在分离过程中使用两种或两种以上的不同极性概念：在分离过程中使用两种或两种以上的不同极性的溶液为流动相，通过不断改变它们之

5、间的比例，从而使的溶液为流动相，通过不断改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、流动相的强度、极性、pH或离子强度相应的改变，从而或离子强度相应的改变，从而使各组分以它们的最佳使各组分以它们的最佳k值通过色谱柱，值通过色谱柱，达到高的分离达到高的分离效果。效果。分类：内梯度和分类：内梯度和外梯度外梯度第六页，讲稿共三十七页哦 LC梯度洗脱与GC程序升温的比较a、弱溶剂时，k大的组分未流出；b、强溶剂时，k小的组分分不开；c、中等强度溶剂时，k小的组分1，2分不开；d、梯度洗脱，各组分得到良好的分离第七页，讲稿共三十七页哦2.2 进样系统进样系统n作用：作用：把分析试样有效地送入色谱柱把分

6、析试样有效地送入色谱柱n进样方式：进样方式：微量注射器；进样阀（耐高压的六通阀：微量注射器；进样阀（耐高压的六通阀：自动化进样、重现性好）自动化进样、重现性好）第八页，讲稿共三十七页哦2.3 分离系统（色谱柱）分离系统（色谱柱）n作用：作用：实现组分的分离实现组分的分离n性能：性能：直形（由不锈钢制成）；内径：直形（由不锈钢制成）；内径：26mm；长度：；长度：1050cm2.3 检测系统n作用：作用：检测并收集各组分检测并收集各组分n类型：类型：溶质型检测器和总体检测器两种溶质型检测器和总体检测器两种溶质型检测器：溶质型检测器：对被分离组分的物理或物理化学性质有响应，例：对被分离组分的物理或

7、物理化学性质有响应，例：紫外、紫外、DAD、荧光、电化学检测器等荧光、电化学检测器等总体检测器：总体检测器：对试样和洗脱液总的物理或物理化学性质有响应，例对试样和洗脱液总的物理或物理化学性质有响应，例：示差折光、介电常数检测器等：示差折光、介电常数检测器等第九页，讲稿共三十七页哦n 紫外检测器：应用最广，可用于梯度洗脱，对大部分有机化合物有响应 光源：低压汞灯，254或280nm（固定波长）；氢灯、氘灯，200-400nm（可调波长）检测池：很小，（1mm 10mm，容积 小于10L）；接收元件：光电倍增管n 二极管阵列检测器（DAD)：可得到所有波长上的色谱信号第十页，讲稿共三十七页哦 紫外

8、检测器的重要进展；紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：光电二极管阵列检测器：计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。第十一页，讲稿共三十七页哦第十二页，讲稿共三十七页哦美国惠普公司1100型液相色谱仪第十三页，讲稿共三十七页哦三、三、HPLC的主要类型及分离原理的主要类型及分离原理流动相要求：流动相要求：n 流动相纯度高流动相纯度高 n 不使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂不使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 n 能溶解样品，但不与样品发生反应能溶解样品，但不与样品发生反应n 粘度小，以此提高柱效粘度小，以此提高柱效n 与所选用的检测器匹配与所选用的检测器匹配固定相分类：固定相

9、分类：n 承受压力：刚性固体（可承受高压，以二氧化硅为基质，表面键合各种承受压力：刚性固体（可承受高压，以二氧化硅为基质，表面键合各种官能团，成化学键合固定相）；硬胶（承受压力低，由聚苯乙烯和二乙基官能团，成化学键合固定相）；硬胶（承受压力低，由聚苯乙烯和二乙基苯交连而成）苯交连而成）n 孔隙深度：表面多孔型和全多孔型孔隙深度：表面多孔型和全多孔型第十四页，讲稿共三十七页哦液固色谱液固色谱（LSC,liquid-solid adsorption chromatography）固固 定定 相相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是使用的是510m的硅

10、胶吸附剂。的硅胶吸附剂。流流 动动 相相：各种不同极性的一元或多元溶剂。：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；第十五页，讲稿共三十七页哦应用：用于分离相对分子量中等的油溶性物质，另用于分离不同官能团的化合物和异构体。缺点：非线性等温吸附常引起峰的拖尾现象 （2）应用和缺点脲的取代物与氨基甲酸酯的高速分离第十六页，讲稿共三十七页哦硝基苯胺异构体在10m氧化铝上的LSC分离第十七页，讲稿共三十七页哦液液分配色谱（LLPC)固定相与流动相均为液体（互不相溶）；固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理基本原理：组分在

11、固定相和流动相上的分配；：组分在固定相和流动相上的分配；流流 动动 相相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极 性小于固定液的极性（性小于固定液的极性（正相正相 normal phase），反之，流），反之，流 动相的极性大于固定液的极性（动相的极性大于固定液的极性（反相反相 reverse phase）。）。正相与反相的出峰顺序相反；正相与反相的出峰顺序相反；固固 定定 相相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；化学键合固定相化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶：（将各种

12、不同基团通过化学反应键合到硅胶 （担体）表面的游离羟基上。（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。柱（反相柱）。第十八页，讲稿共三十七页哦固定相：固定相：将固定液化学键合于载体（硅胶）表面形成固定相将固定液化学键合于载体（硅胶）表面形成固定相固定相类型：固定相类型：n 极性固定相：正相色谱极性固定相：正相色谱 以极性有机基团如胺基（以极性有机基团如胺基（-NH2）、腈基（）、腈基（-CN）、醚基（）、醚基（-O-）等键合在硅胶）等键合在硅胶表面制成的表面制成的 n 非极性固定相：反相色谱非极性固定相：反相色谱 反相色谱法最常用的固定相是反相色谱法最常用的固定相是C18（十八烷基硅烷）、

13、（十八烷基硅烷）、C8（辛烷基）和苯（辛烷基）和苯基键合相的填料。基键合相的填料。化学键合相色谱（CBPC)固定相使用条件：固定相使用条件：为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值，但需要注意的是值，但需要注意的是，C18使用的使用的pH值通常为值通常为2.57.5。太高的太高的pH值会使硅胶溶解，太低的值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。值会使键合的烷基脱落。第十九页，讲稿共三十七页哦正相色谱法 反相色谱法 1.极性固定相 聚乙二醇、氨基与腈基键合相 2.相对非极性流动相 正已烷、环已烷 3.极性调节剂 乙醇、四氢

14、呋喃、三氯甲烷 4.分离中等极性和极性较强化合物.酚类、胺类、羰基类及氨基酸类 5.组分流出顺序 极性小先洗出 1.非极性固定相 C18（简称ODS）、C8 2.极性流动相 水或缓冲液 3.极性调节剂 甲醇、乙腈、四氢呋喃4.分离非极性和极性较弱化合物 占整个HPLC应用的80%左右 5.组分流出顺序 极性大先洗出 第二十页，讲稿共三十七页哦 IC是HPLC的一种，是分析水溶液中阴离子的最佳方法。固定相是离子交换树脂，流动相是淋洗液(强电解质)；电导检测器。常用的淋洗剂是Na2CO3-NaHCO3混合液。只要改变两种物质的浓度比，就可以得到不同淋洗能力和pH值的流动相。为消除淋洗液中强电解质背

15、景离子对电导检测器的干扰，设置了抑制柱或抑制器。离子色谱法（IC）第二十一页，讲稿共三十七页哦临时过程（1）原理：离子交换（离子价态和离子半径）第二十二页，讲稿共三十七页哦淋洗液瓶Pump保护柱分析柱抑制器装置电导池色谱工作站淋洗液输送离子交换分离抑制电导检测数据采集和仪器控制样品注射（2）离子色谱结构第二十三页，讲稿共三十七页哦检测具有电导性化合物的通用型检测器，最常用。溶液至检测池电极 检测池n 安安装装在在电电导导池池之之前前n 提提高高待待测测离离子子的的电电导导率率：提提高高灵灵敏敏度度Na+,Cl-H+,Cl-n 降降低低背背景景电电导导(淋淋洗洗液液)：减减少少噪噪音音Na+,H

16、CO3-H2CO3第二十四页，讲稿共三十七页哦极限摩尔电导值 阳离子 阴离子 198 55 46 78 71 80 80（单位：S/m 当量）350395074735360第二十五页，讲稿共三十七页哦背景：Na2CO3/NaHCO3(700S)NaF,NaCl,NaNO3Na2HPO4,Na2SO4保留时间电导NaFNaClNaNO3Na2HPO4Na2SO4背景：Na2CO3/NaHCO3(700S)保留时间电导HFHClHNO3H3PO4H2SO4保留时间背景：H2CO3(15S)电导第二十六页，讲稿共三十七页哦n 免试剂离子色谱（Reagent-Free）：传统离子色谱的问题手工配制淋洗

17、液和再生液（3）离子色谱的最新发展n 离子色谱样品前处理常规样品离子分析痕量离子分析 大体积进样在线浓缩复杂基体中离子的处理 预处理小柱第二十七页，讲稿共三十七页哦n过滤：样品中有颗粒状物质过滤：样品中有颗粒状物质n基体消除：基体消除：*去除样品中所包含的，有可能损坏仪器或者影响去除样品中所包含的，有可能损坏仪器或者影响 色谱柱色谱柱/抑制器性能的成分抑制器性能的成分 重金属离子、有机大分子重金属离子、有机大分子 *去除样品中所包含的，有可能干扰目标离子测定去除样品中所包含的，有可能干扰目标离子测定 的成分的成分 高离子强度基体高离子强度基体0.22，0.45um滤膜去除颗粒状杂质C18预处理

18、小柱、On-Guard RPP柱去除有机分子On-Guard H柱去除溶液中的金属离子On-Guard Ag柱去除溶液中的Cl-离子 主要测定高氯物质中的NO2-，NO3-等离子On-Guard Ba柱去除溶液中的硫酸根第二十八页，讲稿共三十七页哦水中阴阳离子测定的样品前处理水中阴阳离子测定的样品前处理1.纯净水中阴离子测定-直接进样2.自来水地下水中阴离子的测定-0.45um滤膜过滤后直接进样分析3.地表水生活污水中阴离子测定-离心过滤后,用C18与0.45um滤膜过滤后进样分析4.工业废水-离心过滤后,用On-Guard H柱与0.45滤膜过滤进样第二十九页，讲稿共三十七页哦色谱柱：Ion

19、Pac AG9-HC,AS9-HC淋洗液：9 mmol/L Na2CO3流速：1 mL/min进样量：25 L色谱峰：1.氟离子 3mg/L 2.亚氯酸根 10 3.溴酸根20 4.氯离子6 5.亚硝酸根15 6.溴离子 25 7.氯酸根 25 8.硝酸根25 9.磷酸根40 10.硫酸根30第三十页，讲稿共三十七页哦空间排阻色谱空间排阻色谱（1）分离原理固定相：固定相：凝胶，含有许多不同尺寸的孔穴凝胶，含有许多不同尺寸的孔穴分离原理：分离原理：基于分子尺寸的大小进行分离，样品组分与固定液间不存在相互作用基于分子尺寸的大小进行分离，样品组分与固定液间不存在相互作用现象现象分离次序：分离次序：分

20、子量大的先排出，分子量小的后排出分子量大的先排出，分子量小的后排出 固定相的排阻极限：因分子量过大而不能部分地进入某一给定固定相孔内的最小的样固定相的排阻极限：因分子量过大而不能部分地进入某一给定固定相孔内的最小的样品粒子的分子量品粒子的分子量 固定相的渗透极限：因分子量过小而能完全进入某一给定固定相最小孔固定相的渗透极限：因分子量过小而能完全进入某一给定固定相最小孔内的最大的样品粒子的分子量内的最大的样品粒子的分子量第三十一页，讲稿共三十七页哦空间排斥（阻）色谱Size Exclusion ChromatographyM.W.tR第三十二页，讲稿共三十七页哦空间排斥（阻）色谱Size Exclusion ChromatographyM.W.tR第三十三页，讲稿共三十七页哦空间排斥（阻）色谱Size Exclusion ChromatographyM.W.tR第三十四页，讲稿共三十七页哦空间排斥（阻）色谱Size Exclusion ChromatographyM.W.tR第三十五页，讲稿共三十七页哦空间排斥（阻）色谱Size Exclusion ChromatographyM.W.tR第三十六页，讲稿共三十七页哦感谢大家观看第三十七页，讲稿共三十七页哦