棘球蚴病防控技术研究与应用.pdf

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1、贾万忠 （中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 兰州 730046） 棘球蚴病防控技术研究与应用 摘要： 棘球蚴病 （echinococcosis） 俗称包虫病 （hydatid disease） ， 是由 棘球属 （Echinococcus） 绦虫幼虫 （中绦期） - 棘球蚴 （包虫） 寄生于 人和动物肝、 肺等器官所引起的一类人兽共患寄生虫病。本文从病 原学、 诊断技术、 流行病学调查情况和防控技术四个方面进行介绍， 以期给包虫病防控工作者提供一些借鉴和指导。 关键词： 包虫病； 人畜共患病； 流行病学； 防控； 疫苗 1病原学 棘球属 （Echinococcus

2、） 在分类学上属于动物界， 扁形动物门， 绦虫纲， 圆叶目， 带科， 就全球范围来 说， 目前已经确认的种类有细粒棘球绦虫 （E. granu- losus） 、 多房棘球绦虫 （E. multilocularis） 、 石渠棘球绦 虫 （E. shiquicus） 、 少节棘球绦虫 （E. oligarthra） 、 伏氏 棘球绦虫 （E. vogeli） 和其他从细粒棘球绦虫种里面 新分出来的种。 细粒棘球绦虫种内变异现象突出， 最初根据线 粒体 cox1 和 nad1 基因核苷酸序列的差异可将细粒 棘球绦虫分为 10 个基因型 （G1G10） 以及狮株。在 分子生物学方法广泛使用之前，

3、人们把细粒棘球绦 虫种内的变异体称为虫株 （strain） 。 虽然虫株的概念 在分类学属非正式术语， 但是它在实际工作中经常 被人们所采用。不同虫株其形态学特征、 宿主特异 性、 流行范围、 致病性等不尽相同。不同虫株和基因 型之间非常吻合， 并且把 G1G10， 再加上狮株统 称为细粒棘球绦虫广义种 （E. granulosus sensu lato） 。 G1 和 G6 的 nad1 基因核苷酸序列比较表明，差异 性超过 10%， 差异明显。根据线粒体基因组序列构 建的棘球属绦虫分子种系系统发生树 （图 1） 来看， 公认的种至少有 9 个，其中还有可能从加拿大棘球 绦虫 （E. can

4、adensis 包括 G6G10） 中再划分出 12 新种，这是目前为止棘球属绦虫最为完整的分类学 情况。因此，有必要对棘球属绦虫现有的分类地位 进行修正或修订，即建议将细粒棘球绦虫 G1G3 （分别为普通绵羊株、塔斯马尼亚绵羊株和水牛株） 称为细粒棘球绦虫狭义种 （E. granulosus sensu stric- to） ， G4 （马株） 新设为马棘球绦虫 （E. equinus） ， G5 （牛株）新设为奥氏棘球绦虫（E. ortleppi） ， G6G10 （分别为骆驼株、 猪株、 鹿株、 波兰株和 芬诺斯堪迪 亚鹿株） 新设为加拿大棘球绦虫， 狮株新设为猫或狮 棘球绦虫 （E.

5、felidis） 1-3。 2诊断技术 2.1中间宿主棘球蚴感染的诊断 主要是针对中间宿主棘球绦虫幼虫的诊 断。目前对患棘球蚴病的中间宿主的生前诊断尚无 行之有效的方法， 现普遍采用国际公认的剖检法， 对 doi:10.3969/j.issn.1008-4754.2017.07.011 热点关注 家畜宰后进行棘球蚴感染的调查， 该法取得的调查 结果为 “金标准” ， 但对可疑病灶或包囊、 一种宿主 可感染多种棘球蚴等情况下有时无法做出准确鉴 定。生前诊断方法包括影像学 （如 X 线透视 /B 超） 和免疫学方法（如皮试、 ELISA 和 IHA 等血清学方 法） ，其中影像学技术在筛选实验动物

6、或针对特别 珍贵的动物时才使用。剖检法包括宰后肉眼观察、 实验室诊断（如镜检和 PCR、 RFLP-PCR、 RPA 等分 子生物学方法） 。 针对中间宿主棘球蚴感染的诊断，笔者所在 的研究小组已分离筛选到棘球蚴囊液中极具应用 价值的抗原成分，并制备了相应包虫病检测试剂 盒。检测表明， 试剂盒对 200 份经剖检和分子生物 学确认的包虫病羊血清检测时，阳性检出率为 83%；检测 840 份阴性羊血清时，阴性检出率为 97.2%。 期望该试剂盒能用于羊棘球蚴感染的生前 诊断和流行病学调查。 2.2终末宿主棘球绦虫感染的诊断 主要是针对终末宿主（犬科动物） 棘球绦 虫成虫的诊断。生前诊断方法包括从

7、小肠或粪便中 查出成虫、 虫卵与节片的显微镜检测法和槟榔碱泻 下法 （抽样调查） ， 以及粪 DNA 检测法 （LAMP、 RPA、 PCR 等） 、 粪抗原 ELISA 法。 剖检法用于抽样调查和 作为评价其他方法的 “金标准” 。对于终末宿主即犬 科动物的检测， 现在国际上仍普遍采用氢溴酸槟榔 碱泻法和剖检法。 粪抗原 ELISA 方法有其优点与不 足， 优点是检测简便， 可以进行批量检测； 不足之处 是敏感性低， 目前市面上的试剂盒只针对细粒棘球 绦虫 （狭义种） 的感染， 而不能对多房棘球绦虫感染 进行检测或诊断， 另外， 对样品新鲜度要求较 高。 中华人民共和国农业行业标准动物棘 球

8、蚴病诊断技术 （修订） ， 增加了一些较为成 熟的分子生物学方法与技术，例如 PCR、 PCR-RFLP、 基因型分析等， 为棘球绦虫虫种 与虫株 （基因型） 、 可疑包囊的准确鉴定、 检测 或诊断等提供了新的工具。增加了终末宿主 棘球绦虫感染剖检方法、 粪便检查方法、 粪抗 原检测和粪 DNA 检测等方法， 为传染源 犬等终末宿主流行病学调查与控制效果评价 等提供了重要手段。 3流行病学调查 笔者开展了 CE （囊型、 单房型） 流行病学调查和 AE （泡型、 多房型） 流行病学调查。 3.1棘球蚴的宿主分布 细粒棘球绦虫的终末宿主是犬、狼和豺等食 肉动物； 中间宿主是羊、 牛、 骆驼、 猪

9、和鹿等偶蹄类 动物， 偶可感染马、 袋鼠、 某些啮齿类、 灵长类和 人。多房棘球蚴常见的终末宿主是狐， 其次是狗、 狼、 獾和猫等。多房棘球蚴主要寄生在野生啮齿类 动物如田鼠、 麝鼠、 旅鼠、 仓鼠、 大沙鼠、 小家鼠以 及褐家鼠体内。石渠棘球绦虫的终末宿主是藏狐， 中间宿主主要为高原鼠兔， 到目前为止， 还未在藏 狐和高原鼠兔以外的动物体内发现有石渠棘球绦 虫 （蚴） 的寄生。 3.2广义细粒棘球绦虫在中国流行情况 G1 分布广泛， 家畜和人均可以感染； 少量 G3、 G6、 G7、 G10 人体病例分布在四川、 新疆、 黑龙江等 地。少量 G3、 G6、 G10 病例也存在于青藏高原的牦

10、牛和绵羊中。 3.3野生动物棘球蚴感染调查结果 野生动物多房棘球蚴感染调查结果显示， 中间 宿主为田鼠，久治县的感染率为 43.6% （41/94） ， 达 日县的感染率为 3.3% （5/151） 。野生动物石渠棘球 蚴感染调查结果显示， 中间宿主为鼠兔， 久治县的 感染率为 7.5% （3/40） ，达日县的感染率为 14.3% （20/140） 。某些区域野生动物棘球蚴感染率超过 10%， 说明棘球蚴的流行严重， 与这些区域人棘球蚴 病感染率高相吻合， 因此， 野生动物棘球蚴感染率 热点关注 图 1 棘球属绦虫分子种系发生树 43 可以作为人棘球蚴病感染状况的一个生物指标， 或 者说野生

11、动物可作为棘球蚴病流行病学调查的 “哨 兵” 动物而使用。 3.4疫区犬粪样品检测结果 对疫区犬粪样品用 LAMP 进行棘球绦虫感染 检测， 结果显示： 从细粒棘球绦虫感染检测结果 来看， 达日县的感染率为 12.7%， 久治县的感染率为 20.0%； 从多房棘球绦虫感染检测结果来看， 达日 县的感染率为 12.7%， 久治县的感染率为 33.3%。 4防控技术 4.1切断传播途径 切断病原在犬家畜之间的传播链， 对动物进 行驱虫和使用疫苗免疫， 禁止荷有包虫的动物脏器 随意抛弃和喂犬，在屠宰场实行严格检疫制度， 对 废弃脏器进行无害化处理。 4.2疫苗技术与应用 预防犬的棘球绦虫感染疫苗研究

12、尚处于初期 阶段， 需要进一步加大研发力度。预防羊和牛棘球 蚴病的疫苗已取得突破性成就，并进入推广应用 阶段。 4.3中国国家包虫病免疫计划 我国对包虫病免疫计划的进程经历了以下几 个阶段： 农业部文件 （农医发201410 号） ， 常见动 物疫病免疫推荐方案 （试行） 首次将包虫病列为免 疫病种之一； 农业部文件 （农医发201610 号） ， 国 家动物疫病强制免疫计划： 在包虫病重疫区， 由省 级畜牧兽医主管部门会同有关部门根据监测情况 自主选择免疫的策略； 农业部文件 （农医发2017 8 号） ， 国家动物疫病强制免疫计划， 在包虫病流行 区对新补栏羊进行包虫病免疫， 群体免疫密度

13、常年 保持在 90%以上， 应免疫动物免疫一度达到 100%。 5基因工程技术生产 EG95 重组抗原疫苗 基因工程技术生产 EG95 疫苗抗原的技术路线 主要有两种表达系统： 大肠杆菌表达系统； 毕 赤酵母表达系统。两种表达系统生产重组抗原方面 的比较如下： 现有的基因工程疫苗， 利用大肠杆 菌表达系统生产 EG95 保护性抗原，产物为融合蛋 白， 呈包涵体形式表达， 重组抗原不溶， 需要复性， 抗原难以维持天然蛋白构像，无糖基化修饰作用， 免疫效果较好， 但目的蛋白不易纯化， 制苗工艺复 杂； 正在研制的新型基因工程疫苗， 利用毕赤酵 母表达系统生产 EG95 保护性抗原，产物呈分泌性 表

14、达， 重组抗原可溶， 抗原能维持天然蛋白构象， 有 糖基化修饰作用， 预期免疫效果更好， 培养上清中 蛋白表达量可达 2g/L，目的蛋白纯度在 90%以上， 无需纯化， 制苗工艺简单3。 已有大量文献报道， 基因工程亚单位重组疫苗 （EG95）在绵羊和牛进行二免后可使免疫动物产生 坚强的抵抗棘球蚴感染的保护力 （80%以上） ， 基因 工程亚单位重组疫苗 （EG95） 已在中国、 阿根廷等国 家推广使用。Gauci 等4报道， 小鼠试验证明， 抵抗多 房棘球 蚴原 发感 染的免 疫 保护力 为 78.5% 和 82.9%。李建秋5对小鼠进行 His-EM95+ 常规免疫， 结果表明抵抗多房棘球

15、蚴继发感染的免疫保护力 为 60.52%67.38%。 6人用疫苗研发 包虫病流行区约 6,000 万人口受到被感染的危 险， 数百万人至近千万人为高危人群， 因此应该考 虑在高危人群使用疫苗进行预防。疫苗需要符合人 用质量标准， 通过筛选适宜佐剂、 优化 EG95 蛋白纯 化 工 艺 和 糖 基 化 表 达 条 件 即 可 实 现 。 研 究 EG95+EM95 双价疫苗最为理想。 7小结 科技部和卫计委于 2017 年 6 月 6 日联合下发 了 “十三五” 重点研发项目申报指南， 其中把包虫病 人用疫苗的开发已列入研发内容， 这无疑对推动棘 球蚴病疫苗的深入研发注入了新活力。笔者所在研

16、究小组的工作有幸得到了多个项目资金的大力支 持， 同时， 特别感谢青海、 宁夏、 甘肃、 新疆等省区动 物疫控部门、 疾病控制部门、 高校等同行对笔者工 作的大力支持和帮助。笔者组织国内包虫病知名专 家， 共同协作， 在 2015 年出版了 棘球蚴病 专著， 把这些年来国内外在包虫病研究和防控工作中所 取得的研究成果和经验进行了系统归纳和总结， 期 望给包虫病防控工作提供重要参考资料和强有力 支撑。 参考文献 1李立, 娄忠子, 闫鸿斌, 等. 棘球属绦虫分子种系发生研究进展 J. 中国人兽共患病学报, 2014, 30(1): 1155-1162. 热点关注 基金项目： 国家自然科学基金 （

17、编号： 31672547） 细粒棘球绦虫的中绦期幼虫（细粒棘球蚴） 寄 生于动物 （牛、 羊等） 和人的肝、 肺及其它器官内， 是 一类兽源性的人兽共患寄生虫病。动物包虫病呈世 界性分布， 每年造成的经济损失达 30 亿美元左右。 本病在 2008 年我国修订的 一、 二、 三类动物疫病 病种名录 中被列为二类动物疫病， 在我国 国家中 长期动物疫病防治规划 （20122020 年） 被列为优 先防治和重点防范的动物疫病。细粒棘球绦虫的中 间宿主为牛、 羊、 猪、 马等家畜、 野生动物和人， 其中 绵羊为最适宜的中间宿主； 终末宿主为犬、 狐、 狼等 犬科肉食动物。 1青藏高原细粒棘球绦虫的基

18、因型和种群遗传结构 细粒棘球绦虫的虫种内存在大量变异， 在不同 的宿主体内以及不同的地理环境中， 虫种的形态可 出现变异， 同时其致病性、 抗原反应等也有所差异。 根据细粒棘球绦虫线粒体相关基因序列分析， 可以 将其分为 10 个基因型 （即 G1G10） 。 Nakao 等将本 虫种的基因型分为 4 个隐藏种： Echinococcus granu- losus sensu strict（G1G3） 、 E. equinus（G4） 、 E. or- tleppi（G5）和 E. canadensis（G6-G10） 1。其中， E. canadensis 的分类地位尚存在争议2。 青藏高原

19、细粒棘球绦虫的一些生物学问题 摘要：本文探讨了青藏高原细粒棘球绦虫的一些生物学问题， 从 基因型和种群遗传结构、 起源、 可育囊和不育囊三个方面进行介绍， 以期对青藏高原细粒棘球绦虫的防控提供参考。 关键词： 青藏高原； 细粒棘球绦虫； 防控 2Thompson RC. Biology and Systematics of Echinococcus J. Adv Parasitol, 2017, 95: 65-109. 3Lymbery AJ. Phylogenetic Pattern, Evolutionary Processes and Species Delimitation in th

20、e Genus Echinococcus J. Adv Parasitol, 2017, 95: 111-145. 4贾万忠, 娄忠子, 李宏民, 等. 细粒棘球蚴 EG95 蛋白的修饰及 在酵母中的表达P. 中国专利, 102731641B, 2014-12-24. 5Gauci C, Merli M, Muller V, et al. Molecular cloning of a vaccine antigen against infection with the larval stage of Echinococcus mul- tilocularisJ. Infection and Immunity, 2002, 70(7): 3969-3972. 6李建秋. 多房棘球蚴 Em95 基因克隆、 原核表达及应用D. 中 国农业科学院, 2015. doi:10.3969/j.issn.1008-4754.2017.07.012 热点关注 45