普通生物学实验讲义(XXXX物理).docx

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1、编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第19页 共20页普通生物学实验讲义（2011年版）绍兴文理学院生命科学学院普通生物学课程组编移液器的使用方法按照下列步骤可以用移液器正确而准确地移取液体：1. 选择一支量程合适的移液器。大多数可调式移液器只能在特定量程范围内准确移取液体，不能移取低于说明书上最低的液体。一定不要试图移取超过最大量程的液体，否则会损坏移液器。常用移液器有三种量程：100ml1ml，10ml100ml，0.5 ml10ml。2. 设置移液量。通过旋钮设置刻度：刻度一般由三-四个数字组成，从上往下读或从左往右读，用黑色的调节轮调节容积（图2-4）。这

2、三个数字是容积的前三位数，由移液器的最大容积（标在推动按钮上面）决定。3. 将新的一次性枪头装在吸液杆上。二者要相匹配，并且安装正确。用力推动，并轻轻旋转枪头使之套紧，否则，移取的液体体积将少于设定的体积，溶液也会从枪头上往下滴。枪头通常装在盒子里，使用方便。如果需要无菌条件，则整个过程都要按无菌操作进行。4. 检验移液量。用移液器吸取一定体积的去离子水，放在天平上称重，假设1mg水体积为1ul （1mm3），测量误差应在1%的范围内。对于微量液体，可多次移取，如移取20次50ul的去离子水，质量应为100mg。如果移液器不准，吸液量显著多于或少于设定体积，可改用校准的移液器，或将移液刻度相应

3、地调大或调小，进行校准（实际移液量比移液器的显示值更重要）。如果移液器不精确，每次移取的体积变化更大，就要进行维修，校准。5. 吸取一定体积的液体。手握移液器，按下推动按钮，直到遇到一个阻力（第一止点），观察所吸液体页面，将枪头垂直浸入液体中（注意不能过深以致液体沾到移液器），缓慢平稳地松开拇指，同时观察吸入液体有无气泡，停1S左右，待液体吸入后，取出移液器。枪头外壁不应附有液滴。6. 目测吸入枪头的液体体积是否合理。如100ul体积约占P20型枪头容积的一半。如果移液器保持竽握取， 枪头安装正确，则不应有液滴滴下。7. 释放液体。将枪头头部靠在器壁上，约成1020倾角。慢慢按下推动按钮直到终

4、点，完全排出液体，保持推动按钮至终点的状态取出移液器。8. 退下枪头。按下卸枪头按钮（有的移液器不带卸枪头器），退下枪头。如果枪头被污染了，可直接退到盛有消毒液功废液的容器里。如果不重复取液，更换新的枪头，重复上面的第（5）（8）步。移液器必须卸掉枪头后才能放在移液器架上。实验一 普通光学显微镜的构造、使用方法及观察【实验目的】1. 了解显微镜的构造和各部分的作用，掌握显微镜的使用技术和保养措施2. 学会简易临时玻片的制作方法和生物绘图方法【实验原理】（一）显微镜的主要构造普通光学显微镜的构造主要分为三部分：机械部分、照明部分和光学部分。1.机械部分（1）镜座：是显微镜的底座，用以支持整个镜体

5、。（2）镜柱：是镜座上面直立的部分，用以连接镜座和镜臂。（3）镜臂：一端连于镜柱，一端连于镜筒，是取放显微镜时手握部位。（4）镜筒：连在镜臂的前上方，镜筒上端装有目镜，下端装有物镜转换器。（5）物镜转换器(旋转器)：接于棱镜壳的下方，可自由转动，盘上有34个圆孔，是安装物镜部位，转动转换器，可以调换不同倍数的物镜，当听到碰叩声时，方可进行观察，此时物镜光轴恰好对准通光孔中心，光路接通。（6）镜台(载物台)：在镜筒下方，形状有方、圆两种，用以放置玻片标本，中央有一通光孔，我们所用的显微镜其镜台上装有玻片标本推进器(推片器)，推进器左侧有弹簧夹，用以夹持玻片标本，镜台下有推进器调节轮，可使玻片标本

6、作左右、前后方向的移动。（7）调节器：是装在镜柱上的大小两种螺旋，调节时使镜台作上下方向的移动。粗调节器(粗螺旋)：大螺旋称粗调节器，移动时可使镜台作快速和较大辐度的升降，所以能迅速调节物镜和标本之间的距离使物象呈现于视野中，通常在使用低倍镜时，先用粗调节器迅速找到物象。细调节器(细螺旋)：小螺旋称细调节器，移动时可使镜台缓慢地升降，多在运用高倍镜时使用，从而得到更清晰的物象，并借以观察标本的不同层次和不同深度的结构。2照明部分装在镜台下方，包括反光镜，集光器。（1）反光镜：装在镜座上面，可向任意方向转动，它有平、凹两面，其作用是将光源光线反射到聚光器上，再经通光孔照明标本，凹面镜聚光作用强，

7、适于光线较弱的时候使用，平面镜聚光作用弱，适于光线较强时使用。（2）集光器(聚光器)位于镜台下方的集光器架上，由聚光镜和光圈组成，其作用是把光线集中到所要观察的标本上。聚光镜：由一片或数片透镜组成，起汇聚光线的作用，加强对标本的照明，并使光线射入物镜内，镜柱旁有一调节螺旋，转动它可升降聚光器，以调节视野中光亮度的强弱。光圈(虹彩光圈)：在聚光镜下方，由十几张金属薄片组成，其外侧伸出一柄，推动它可调节其开孔的大小，以调节光量。3.光学部分（1）目镜：装在镜筒的上端，通常备有23个，上面刻有5、10或15符号以表示其放大倍数，一般装的是10的目镜。（2）物镜：装在镜筒下端的旋转器上，一般有34个物

8、镜，其中最短的刻有“10”符号的为低倍镜，较长的刻有“40”符号的为高倍镜，最长的刻有“100”符号的为油镜，此外，在高倍镜和油镜上还常加有一圈不同颜色的线，以示区别。在物镜上，还有镜口率(N.A.)的标志，它反应该镜头分辨力的大小，其数字越大，表示分辨率越高，各物镜的镜口率如下表：物镜 镜口率(N.A.) 工作距离(mm)10 0.25 5.4040 0.65 0.39100 1.30 0.11表中的工作距离是指显微镜处于工作状态(物象调节清楚)时物镜的下表面与盖玻片(盖玻片的厚度一般为0.17mm)上表面之间的距离，物镜的放大倍数愈大，它的工作距离愈小。显微镜的放大倍数是物镜的放大倍数与目

9、镜的放大倍数的乘积，如物镜为10，目镜为10，其放大倍数就为1010=100。（二）显微镜的使用方法1低倍镜的使用方法（1）取镜和放置：显微镜平时存放在柜或箱中，用时从柜中取出，右手紧握镜臂，左一手托住镜座,将显微镜放在自己左肩前方的实验台上，镜座后端距桌边12寸为宜，便于坐着操作。（2）对光：用拇指和中指移动旋转器(切忌手持物镜移动)，使低倍镜对准镜台的通光孔(当转动听到碰叩声时，说明物镜光轴已对准镜筒中心)。打开光圈，上升集光器，并将反光镜转向光源，以左眼在目镜上观察(右眼睁开),同时调节反光镜方向，直到视野内的光线均匀明亮为止。（3）放置玻片标本：取一玻片标本放在镜台上，一定使有盖玻片的

10、一面朝上，切不可放反，用推片器弹簧夹夹住，然后旋转推片器螺旋，将所要观察的部位调到通光孔的正中。 （4）调节焦距：以左手按逆时针方向转动粗调节器，使镜台缓慢地上升至物镜距标本片约5毫米处，应注意在上升镜台时，切勿在目镜上观察。一定要从右侧看着镜台上升，以免上升过多，造成镜头或标本片的损坏。然后，两眼同时睁开，用左眼在目镜上观察，左手顺时针方向缓慢转动粗调节器，使镜台缓慢下降，直到视野中出现清晰的物象为止。如果物象不在视野中心，可调节推片器将其调到中心(注意移动玻片的方向与视野物象移动的方向是相反的)。如果视野内的亮度不合适，可通过升降集光器的位置或开闭光圈的大小来调节，如果在调节焦距时，镜台下

11、降已超过工作距离(5.40mm)而未见到物象，说明此次操作失败，则应重新操作，切不可心急而盲目地上升镜台。2高倍镜的使用方法（1）选好目标：一定要先在低倍镜下把需进一步观察的部位调到中心，同时把物象调节到最清晰的程度，才能进行高倍镜的观察。（2）转动转换器，调换上高倍镜头，转换高倍镜时转动速度要慢，并从侧面进行观察(防止高倍镜头碰撞玻片)，如高倍镜头碰到玻片，说明低倍镜的焦距没有调好，应重新操作。（3）调节焦距：转换好高倍镜后，用左眼在目镜上观察，此时一般能见到一个不太清楚的物象，可将细调节器的螺旋逆时针移动约0.51圈，即可获得清晰的物象(切勿用粗调节器!)如果视野的亮度不合适，可用集光器和

12、光圈加以调节，如果需要更换玻片标本时，必须顺时针(切勿转错方向)转动粗调节器使镜台下降，方可取下玻片标本。3油镜的使用方法（1）在使用油镜之前，必须先经低、高倍镜观察，然后将需进一步放大的部分移到视野的中心。（2）将集光器上升到最高位置，光圈开到最大。（3）转动转换器，使高倍镜头离开通光孔，在需观察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢转动油镜，在转换油镜时，从侧面水平注视镜头与玻片的距离，使镜头浸入油中而又不以压破载玻片为宜。（4）用左眼观察目镜，并慢慢转动细调节器至物象清晰为止。如果不出现物象或者目标不理想要重找，在加油区之外重找时应按：低倍高倍油镜程序。在加油区内重找应按：低倍油镜程序，不

13、得经高倍镜，以免油沾污镜头。（5）油镜使用完毕，先用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头上和标本上的香柏油擦去，然后再用干擦镜纸擦干净。（三）显微镜使用的注意事项1持镜时必须是右手握臂、左手托座的姿势，不可单手提取，以免零件脱落或碰撞到其它地方。2轻拿轻放，不可把显微镜放置在实验台的边缘，以免碰翻落地。3保持显微镜的清洁，光学和照明部分只能用擦镜纸擦拭，切忌口吹手抹或用布擦，机械部分用布擦拭。4水滴、酒精或其它药品切勿接触镜头和镜台，如果沾污应立即擦净。5放置玻片标本时要对准通光孔中央，且不能反放玻片，防止压坏玻片或碰坏物镜。6要养成两眼同时睁开的习惯，以左眼观察视野，右眼用以绘图。7不要随意取下目镜，以

14、防止尘土落入物镜，也不要任意拆卸各种零件，以防损坏。8使用完毕后，必须复原才能放回镜箱内，其步骤是：取下标本片，转动旋转器使镜头离开通光孔，下降镜台，平放反光镜，下降集光器(但不要接触反光镜)、关闭光圈，推片器回位，盖上绸布和外罩，放回实验台柜内。最后填写使用登记表。(注：反光镜通常应垂直放，但有时因集光器没提至应有高度，镜台下降时会碰坏光圈，所以这里改为平放)【仪器、材料与试剂】显微镜、擦镜纸、镊子、小剪、载玻片、盖玻片、解剖针、表面皿、吸水纸、碘液、清水、香柏油、二甲苯； 洋葱鳞茎。【实验方法】1取一片干净的载玻片，用滴管在其中央滴一滴蒸馏水。2取洋葱鳞茎，把它切成八瓣，剥下一片新鲜的肉质

15、鳞叶，用刀片在其内表面划一个边长为5mm的正方形，然后用镊子撕下正方形块内表皮，将其置于载玻片上的水滴中（注意表皮的外面应朝上） ，如果内表皮发生卷曲，应细心用解剖针将其展平3盖上盖玻片，注意加盖玻片时，应该用镊子夹住盖玻片一侧，使盖玻片另一侧边缘与水滴边缘相接触，然后慢慢放下，直到放平为止，这样可使盖玻片下的空气逐渐被水挤出，以免产生气泡，影响观察。如果水太多浸出盖玻片外，可用吸水纸将多余的水吸去。4把装好的片子放在显微镜载物台上，先用低倍接物镜观察，再换用高倍接物镜观察细胞的详细结构，并用铅笔绘制示意图。【实验结果】 绘制洋葱鳞叶内表皮细胞示意图。说明：生物绘图中绘出的图要清楚，并正确的表

16、示出形态构造的特点，绘图注意事项如下： (1) 绘图要用黑色硬铅笔，不要用软铅笔或有色铅笔，一般用 2H 铅笔为宜。 (2) 图的大小及在纸上分布的位置要适当。一般画在靠近中央稍偏左方，并向右方引出注明各部名称的线条。各引出线条要整齐平列，各部名称写在线条右边 画图时先用轻淡小点或轻线条画出轮廓，再依照轮廓一笔画出与物象相符的线条。线条要清晰，比例要准确。较长的线条要向顺手的方向运笔，或把纸转动再画。同一线条粗细相同，中间不要有断线或开叉痕迹，线条也不要涂抹。 (4) 绘出的图要正确，观察时要把混杂物、破损、重叠等现象区别清楚，不要把这些现象绘上。 (5) 图的明暗及浓淡，应用细点表示，不要采

17、用涂抹方法。点细点时，要点成圆点，不要点成小撇。 (6) 整个图要美观、整洁，还要特别注意准确性。实验二 线粒体超活染色与观察【实验目的】1. 观察活细胞内线粒体的形态、发育和分布2. 了解细胞和细胞器的超活染色技术【实验原理】詹纳斯绿可专一性地对对线粒体进行活染,这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态),呈蓝绿色。【仪器、材料与试剂】1 器材：显微镜、恒温水浴锅、剪刀、镊子、解剖刀、载玻片、盖玻片、吸管、牙签、吸水纸2 试剂：Ringer液、1/5000詹纳斯绿、1/3000中性红3 材料：人口腔上皮细胞【实验步骤】1. 在载玻片上滴1/5000詹纳斯绿

18、1-2滴2. 取口腔上皮细胞（牙签刮取），与染液混合后于恒温染色10-15min3. 显微镜下观察，并绘制示意图【实验结果】绘出人口腔上皮细胞示线粒体的形态与分布并简要分析。实验三 细胞膜的渗透性【实验目的】1了解溶血现象及其发生机制。2了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。【实验原理】细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障，是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同，有

19、的溶质可进入，有的溶质不能进入，进入红细胞的溶质能提高红细胞的渗透压，使水进入红细胞，引起溶血。由于溶质透入速度不同，溶血时间也不同，因此，发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。本实验选用红细胞作为细胞膜透性的实验材料，将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞的变化。【仪器、材料与试剂】1器材：50ml烧杯、10ml移液管、滴管、试管12支、试管架2试剂： 0.9%生理盐水；2种低渗溶液：0.017mol/L氯化钠和0.032mol/L葡萄糖；10种等渗溶液：0.17mol/L氯化钠、0.32mol/L葡萄糖、0.17mol/L氯化铵、0.17mol/L醋酸铵、0.17m

20、ol/L硝酸钠、0.12mol/L草酸铵、0.12mol/L硫酸钠、0.32mol/L甘油、0.32mol/L乙醇、0.32mol/L丙酮3材料：鸭血【实验步骤】1. 低渗溶液处理：试管一支：鸭血红细胞液ml蒸馏水 10ml2. 等渗溶液处理0.17mol/L氯化钠、0.17mol/L氯化铵、0.17mol/L醋酸铵、0.17mol/L硝酸铵、0.12mol/L草酸铵、0.12mol/L硫酸铵、0.32mol/L葡萄糖、0.32mol/L甘油、0.32mol/L乙醇、0.32mol/L丙酮等种溶液进行同样实验，步骤同上。3.观察实验结果【实验结果】记录在各种不同溶液中的溶血情况实验四 碱裂解法

21、抽提大肠杆菌质粒【实验目的】学习利用碱裂解法获得大肠杆菌质粒DNA的原理与技术。【实验原理】用SDS处理细菌，使细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA在强碱性（NaOH）条件下发生变性。再用酸性乙酸钾来中和，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA因分子较大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA未能充分复性，而且分子体积较大，则与细胞碎片一起沉淀至离心管底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。各试剂的作用：1溶液I：葡萄糖：增加溶液粘度，有助菌体悬浮，防止因机械剪切而DNA降解；EDTA： 螯合Ca2+

22、、Mg2+等金属离子，降低离子浓度，可抑制DNase的作用。2溶液II：0.2M NaOH：pH值 近12.6，使细胞破膜，蛋白质和DNA变性；1 SDS：阴离子型表面活性剂，作用有：（1） 解膜蛋白，破坏细胞膜；（2） 聚DNA结合蛋白；（3） 与蛋白质形成复合物，使蛋白质变性沉淀。3溶液III：3M KAc与HAc：作用有：（1） pH4.8，中和溶液II，使质粒DNA复性；（2） 3M高盐溶液，中和核酸的电荷，利于变性基因组DNA、RNA聚合沉淀；（3） 形成溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物，有助于蛋白等大分子的沉淀。4酚/氯仿/异戊醇的作用：酚和氯仿：表面变性剂，非极性分子，

23、而水是极性分子，当两者与蛋白水溶液混合时，会挤去蛋白质分子间的水分子，使蛋白质失水变性；离心后因三者的比重大小不同，分为上层水相、中层蛋白相、下层酚和氯仿的有机溶剂相。两者在去除蛋白质时各有利弊：酚变性作用较强，但与水有一定程度的互溶，因此一般预先添加pH8.0的Tris.Cl水溶液使酚饱和，减少DNA的损失；碱性环境中DNA比RNA更容易游离至水相；氯仿变性作用没有酚强，但与水不相溶，而与酚相溶。因此经酚抽提后，再用氯仿抽提，可在使蛋白质变性的同时一并去除剩余的酚。一般两者以25：24的比例再加入1份异戊醇以降低分子表面张力，防止泡沫产生并有助于稳定地分相。5乙醇：乙醇极性较低，可与水以任意

24、比相互溶，而DNA不溶于乙醇，是实验室最常用的DNA沉淀剂。无水乙醇：以22.5倍的体积与DNA溶液相混合，使乙醇的终浓度达到67以上，使DNA失水而易于聚合；同时结合Kac或NaAc等中和电荷作用，并低温放置一段时间，使DNA沉淀下来。70乙醇：洗去DNA沉淀中的盐类和有机溶剂等。6、无菌水与TE缓冲溶液：溶解DNA，其中TE缓冲液有助于维持DNA的稳定性。【仪器、材料与试剂】（一）仪器台式离心机 混匀器 生化培养箱 冷冻离心机 移液器 制冰机（二）试剂1LB液体培养基；2LB固体培养基；3氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)；50mg/ml4溶液：50 mmol/L 葡萄糖，25

25、mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH 8.0)。 成批配制,100ml每份,高压灭菌15分钟,储存于4冰箱。5溶液：0.2 mol/L NaOH，1 SDS。6溶液：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至100ml,溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Ac- 5mol/L，高压灭菌。7饱和酚：经TrisCl（pH8.0）饱和。 8酚/氯仿/异戊醇:按氯仿:异戊醇24:1体积比加入异戊醇。使用时按体积/体积1:1混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)。9TE缓冲液：10mmo/L

26、TrisCl (pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。高压灭菌后储存于4冰箱中。（三）材料含质粒的大肠杆菌枪头，离心管，牙签【实验方法】1取1.5ml培养液12000rpm离心1-2min，弃上清，收集菌体。 2加入100l溶液I，振荡或枪头吹打混匀，使菌体充分悬浮。 3加入200l溶液II，温和上下颠倒2-3次，溶液转变为澄清透明。4加入150l溶液III，上下颠倒混匀数次，静置2-3min。512000 rpm离心5min。6用牙签挑出沉淀，上清加400l的酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，12000 rpm离心5min。7吸取上层水相，加入1ml无水乙醇，混匀。（注意不要吸到

27、酚和中间层固体物质）84，12000rpm离心10min。9弃上清，加入0.5 ml 70乙醇，4，12000 rpm离心5 min。 10 弃上清，沉淀自然干燥10 min后，加20l无菌水或TE缓冲液（pH8.0）溶解。114 保存备用【实验结果】1 结合实验原理，注意观察实验过程中出现的现象实验五 质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分析【实验目的】学习琼脂糖凝胶电泳,及利用琼脂糖凝胶电泳检测质粒及分析质粒构型。【实验原理】琼脂糖凝胶电泳法：是核酸检测最常规的方法之一，其操作简便快速，所需样品量很少。原理是根据插入DNA分子中的荧光染料溴化乙锭(Ethidium bromide, EB) 在紫外光

28、的激发下发射的荧光，其强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品作为电泳对照，即可估计出待测样品的浓度。如电泳后成像观察，仅需510ng的DNA；肉眼观察，可检察0.050.1g的DNA。不同大小的DNA片段迁移率不同，迁移率与其分子量的对数值成反比，分子量越大，在凝胶中迁移越慢。利用这一特性不同浓度的琼脂糖凝胶可以分离从200bp至近50kb的DNA片段在琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子的迁移率还与DNA分子构型有关。质粒DNA有三种构型：1, 超螺旋的共价闭合环DNA（covalently closed circular DNA，ccc DNA）；2, 开环DNA（open circula

29、r DNA,oc DNA），双链中有一条链发生一处或多处断裂；3, 线状DNA（linear DNA），两条链在同一处断裂；同一质粒的不同构型在电场中的迁移率不同，一般超螺旋型（ccc）最快，其次是线状（L），最慢的是开环型（OC）。同时，在抽提的质粒DNA中，若还有染色体DNA或RNA，或较多的蛋白质，在琼脂糖凝胶上也可分别观察到电泳区带，由此可分析样品的纯度。【仪器、材料与试剂】（一）仪器冰箱，移液器，微波炉或电炉，水平电泳槽及电源，紫外分析成像系统（二）试剂150xTAE：每1 L Tris 242 g 冰醋酸 57 mL 0.5molL EDTA 200 mL HCl调pH 至8.02

30、凝胶加样缓冲液(6x) 溴酚蓝 0.25 蔗糖 40 3溴化乙锭（EB）溶液：配成10mg/ml，铝箔或黑纸包裹容器,室温贮存。 4琼脂糖（三）材料质粒，枪头，离心管【实验方法】1用胶带将洗净、干燥的水平板的边缘封住，形成一个胶模并水平放置，插入梳子。2用1TAE配置1的琼脂糖凝胶，微波炉加热至沸腾，琼脂糖完全融解。3等凝胶温度降至大约5060以下时，加入1mg/L溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5ug/mL（或将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭溶液中染色）；摇匀并平稳倒入水平板中，防止产生气泡。 4凝固后，将梳子轻轻拔出。5去掉胶带，将水平板放入加有1TAE电泳缓冲液的电泳槽中，并且使电泳缓冲液高出凝

31、胶约1mm。6按下列比例混合： 6上样缓冲液 2ul 质粒DNA 10ul（实验一抽提得到）混匀后加入上样孔，记录点样次序。7盖好电泳槽盖子，选择适当的电泳电压（5V/cm）及电泳方向(DNA由阴极向阳极)，通电，开始电泳。8约30分钟后，停止电泳，样品在紫外灯下观察、成像。【实验结果】2. 如实绘制观察到的电泳图，并分析各条带所代表的物质【注意事项】1. 在紫外灯下观察，应戴上防护眼镜，以防紫外线伤害眼睛。2. 溴化乙锭为致癌物，须戴一次性手套操作，并注意防止环境污染。【附：不同类型及浓度琼脂糖分离DNA片段大小范围】实验六 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化【实验目的】通过本实验，学习大肠杆菌

32、感受态细胞制备和转化的原理与技术方法。【实验原理】感受态是指细菌细胞处于易于接受外源DNA的状态。转化（Transformation）是指将载体DNA或重组子导入受体细胞，使之高效表达外源基因或获得遗传新性状的操作及过程。转化中所用的受体菌多为限制修饰缺陷型，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变型，可允许外源DNA分子进入胞体并稳定遗传。常用菌株有DH5a、DH10B、JM109等。大肠杆菌常用的转化方法有物理法如电击法，化学方法如CaCl2、RbCl（KCl）等化学试剂处理，有机溶剂法如PEG处理等。其中CaCl2法因其简便快速、菌株适用范围广，且转化效率较高而得到广泛应用。该法于1972年由

33、Cohen等人发现，其原理是在0，CaCl2低渗溶液中，菌体（E.coli DH5a）膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物附于菌体表面，经42热击短暂处理，细胞吸收DNA复合物；在非选择型培养基上培养1h后，重组子中基因得到表达，使受体菌获得新表型（如Ampr等），再用Amp抗性来筛选转化子。【仪器、材料与试剂】（一）仪器1超净工作台2低温离心机3恒温振荡器4生化培养箱5低温冰箱6移液器7制冰机（二）材料1 大肠杆菌DH52 涂布棒3 枪头4 5ml及1.5ml离心管5 接种环（三）试剂1pUC19质粒20.1M氯化钙3LB液体培养基（2蛋白胨，0.5%酵母膏，1

34、NaCl）4含氨苄青霉素的LB平板【实验方法】1挑取大肠杆菌DH5单菌落，接于5mL LB液体培养基中37振荡培养过夜2以1:50比例将1ml菌液转移到新鲜LB液体培养基中，37振荡培养1.52 hr左右，使A600在0.40.5左右3将培养液4ml转移到5ml离心管中，4下，5000rpm离心3min4弃上清，加0.5mL预冷的0.1 M CaCl2溶液，轻轻吹打或摇动混匀细胞(勿振荡)5冰上放置15-20min，4，5000rpm离心2min6弃上清，加0.1ml预冷的0.1 M CaCl2溶液，轻轻吹打或摇动混匀细胞，即得感受态细胞7将取0.1ml感受态细胞转移到1.5ml离心管中，加1l质粒或10l连接产物，混匀，冰上放置30min842水浴90秒9加入0.5 ml新鲜LB培养基，37，200rpm振荡约30min10. 取100l涂布到含有氨苄青霉素的平板上11倒置平皿，37培养1216h感受态细胞制备过程中尽量冰上操作，动作轻柔，不能过于剧烈。【实验结果】第二天观察平板上菌落生长情况第 19 页 共 20 页