食品理化检验方法主要内容和使用注意点解读.docx

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1、食品理化检验方法主要内容和使用注意点解读食品理化检验方法内容一般包括发布日期、实施日期，技术内容包括范围、原理、试剂和材料、仪器和设备、分析步骤、分析结果的表述、精密度、其他（如检出限、定量限），附录（如参考条件、典型图谱）等。依据相关法律法规和技术规范，食品检验要严格按照食品检验标准（或国家有关规定确定的检验方法）对食品进行检验，保证对外出具的检验数据和结论客观公正。理化检验方法总体参照GB/T5009.1-2003（食品卫生检验方法 理化部分总则，该标准正在修订中）的基本原则和要求。理化检验方法作为日常食品安全抽检监测的重要依据，检测方法的选择、文本内容的理解应用、方法每一步操作原理和关键

2、点、结果计算和评价等都至关重要。发布日期和实施日期机构日常需动态关注检验方法标准（文本）的发布情况，及时做好新方法证实和新旧方法变更确认；对外出具具有证明性作用数据和结论时需获取资质，确保检验采用现行有效方法；食品安全抽样检验管理办法 15号令中还明确规定复检使用方法要求，应当使用与初检机构一致的检验方法。但实施复检时食品安全标准对检验方法有新的规定的，从其规定。方法主要内容解读范围：食品理化检验方法的范围规定，一般会明确方法适用的食品基质范围。特别注意的是可能某方法下还会包括仪器原理或方法原理不同的方法，可能有不同的适用范围。如食品安全国家标准GB5009.97-2016 食品中环己基氨基磺

3、酸钠的测定中，包括气相色谱法、液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法，特别强调气相色谱法不适用于白酒中该化合物的测定。而液相色谱-质谱/质谱法适用于白酒、葡萄酒、黄酒、料酒中环己基氨基磺酸钠的测定。但配制酒采用液相色谱法，方法选择时需特别注意。一些方法中可能还会依据含量水平选择不同的方法，如水分、蛋白质的测定。日常开展检验对仪器分析方法的适用范围都较为注意，但往往容易疏忽的是常规理化项目方法的选择。如食品安全国家标准 GB 5009.3-2016 食品中水分的测定，包括直接干燥法、减压干燥法、蒸馏法、卡尔费休法，如（蒸馏法）适用于含水较多又有较多挥发性成分的水果、香辛料及调味品、肉与肉制品等食品中

4、水分的测定，不适用于水分含量小于1g/100g的样品。卡尔费休法适用于食品中含微量水分的测定，不适用于含有氧化剂、还原剂、碱性氧化物、氢氧化物、碳酸盐、硼酸等食品中水分的测定。卡尔费休容量法适用于水分含量大于1.010-3g/100g的样品。如食品安全国家标准GB 5009.229-2016食品中酸价的测定，辣椒油应使用冷溶剂自动电位滴定法（第二法）。因此，在选择方法时，一定结合产品配料信息及含量水平等综合评估。另外，某方法的适用范围虽未包括某食品基质，但通用标准指定了检验方法，也可使用，但需做好方法的如回收率、精密度、检出限、定量限、基质效应等性能参数的确认，并符合检测方法或GB/T 274

5、04或GB/T 27417等技术要求。日常检验中，如方法中存在几种方法，适用基质范围无差异，如GB 5009.121-2016 食品中脱氢乙酸的测定，建议对疑似结果，可采用气相色谱法和液相色谱法进行方法比较验证，可一定程度上排除因基质干扰或其他原因产生的系统性问题。原理：方法原理描述一般都较为简洁，充分概括了提取、净化、分析原理、定量方式等关键信息。还要注意方法中检测目标化合物的形态，如游离型还是结合型，尤其注意方法中每一步解决的关键问题。试剂和材料：试剂和材料一般包括试剂、试剂配制、标准品、标准溶液的制备、固相萃取小柱、滤膜等材料要求。这里要注意的是方法中对试剂纯度、耗材规格、填料等要求。特

6、别注意的是标准溶液的制备方式，是采取外标法，还是内标法，还是单点法，是否需要空白基质匹配或加标基质随行。还要注意标准品的信息准确（CAS号、分子式、英文等信息综合确定）、对应保存条件的稳定性要求，要注意开展期间核查比对尤其不稳定指标，必要情况下可储备多种来源标准品。另外，还要注意标准品的预处理要求，如GB5009.28-2016 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定中要求，糖精钠含结晶水，使用前需在120烘4h，干燥器中冷却至室温后备用。日常我们容易忽略的是试剂的酸碱度对水解或酶解、对固相萃取净化洗脱效果等影响，要注意试剂的密封保存。还要注意的是可能方法中要求对耗材，如滤膜是否存在干扰或对目标化

7、合物有吸附，或固相萃取小柱性能如何等进行验证。日常检验中需要采取全试剂空白（不加样品，其他包含试剂、耗材、酶、接触器皿等）、关键点加标回收等方式考察试剂和材料是否满足方法要求。仪器和设备：一般会列举方法中需要的仪器和设备，包含主要检测仪器，如色谱-质谱联用仪、电感耦合等离子体质谱、液相色谱仪、紫外分光光度计等。还包括天平（使用中需注意感量要求）、超声波发生器、高速离心机（注意转速和温度要求）、振荡器、涡旋混合器、氮吹仪等。部分方法标准将酶联免疫亲和柱归到了仪器和设备项下，如GB5009.111-2016 食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定标准附录A.2中给出了免疫亲和柱的柱容量质量

8、验证方法。另外，日常关键仪器设备需经过检定和校准，需考察仪器的响应稳定性以及长期分析系统的抗干扰能力，保证仪器设备处于正常工作状态。本期食品理化检验方法主要内容和使用要点解读延续上期内容，重点阐释技术内容中的分析步骤。分析步骤：1）试样制备：试样制备作为分析步骤的前端，要求关联抽样、制样、检验、复检等具体实施情况，涉及抽样数量（包含检验数量、复检备样数量）、包装个数、样品预处理（冷冻、加入抗氧化剂、加热熔融、含维生素类样品避光等）、样品制备部位、制备后样品数量、制备后样品存储条件、制样均匀性等。实验室制样规程要充分消化吸收各检测方法对试样制备的要求，考虑判定依据、试样称取量、产品标准、化合物稳

9、定性等因素。复检机构也要和初检机构交流试样制备的注意事项。如，GB 5009.22-2016食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定液体样品，如液体样品（植物油、酱油、醋等) 采样量需大于1L，对袋装、瓶装等包装样品需至少采集3个包装（同一批次或号），将所有液体样品用匀浆机混匀后，对其中任意的100g（mL）样品进行检测。2）试样溶液的制备：整个食品安全性的检测分析中，较大部分时间用在样品的前处理上，而实验误差也主要来自样品前处理。试样提取：方法中一般会明确取样量（注意精度要求），取样量影响到抽样数量和复检备样数量。方法中还包括前处理方式和稀释倍数等，要充分理解测试对象的针对性，如目标化合物的极性、形

10、态、旋光、结合型或游离型、内源型或外源型、稳定性等。一般会有直接提溶剂提取（如超声萃取、微波萃取、加速溶剂提取等），也有酸水解、酶解、碱化处理、皂化、沉淀蛋白、蒸馏、索氏提取等。提取过程中可能会加入抗氧化剂，或进行避光操作等；也可能是酸硝化消解，如元素的测定。不同基质可能会采取不同的前处理方式，如GB 5009.120-2016食品中丙酸钠、丙酸钙的测定，蒸馏法适用于豆类制品、生湿面制品、醋、酱油等样品，直接浸提法适用于面包、糕点。为保证提取的充分性，尤其内源性结合的化合物，要考虑样品的基质分散性、固体样品的渗透性（如茶叶加水浸泡、乳粉加水复溶等）、皂化完全、水解酶解充足、消解充分等，要注意酶

11、活、时间、酸碱、皂化试剂量、提取溶剂量、提取功率、提取时间、提取次数等。试样净化：净化方式一般有液-液萃取、固相萃取（反相萃取或正相萃取）、固相微萃取、基质分散、凝胶渗透、离子交换、免疫亲和、分子印迹、酸碱转化、QUECHERS处理、混合模式净化、顶空分离等，部分农药残留项目还采取磺化处理。净化中需注意净化原理，才能清楚每一步操作要点。一是注意净化前对耗材的性能评价，还需考察耗材对空白是否存在干扰，方法验证时可针对多品牌的耗材进行比较筛选。二是使用前的活化平衡，严格按照方法描述或产品说明书进行，注意平衡时间和活化溶剂用量。三是上样，如提取液有浑浊现象，如使用水溶液（缓冲盐溶液、酸碱溶液等），提

12、取溶液体积大、杂质多，可采用低温高速离心、快速滤纸过滤或玻璃纤维过滤等；上样量需和净化耗材规格（载量）匹配，还要注意上样介质，尤其极性、pH、上样流速等，离子交换尤其对流速敏感。四是洗脱过程，按照方法选用合适的洗脱溶液，必要时可分步洗脱，洗脱流速对方法回收率也很关键；如回收率不稳定或结果重现不好，可核查是否需要加大洗脱体积。特别注意的是，在进行极性差异较大的两相交换时要注意抽干。如GB/T 21981-2008 动物源食品中激素多残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法中，净化（7.2）在上样后，由甲醇-水介质转换为二氯甲烷-甲醇介质洗脱，极性差异较大，需尽力抽干，才能充分洗脱目标物质。洗脱中还需

13、要注意洗脱液的酸碱度，一定要正确收集目标洗脱液。另外，在有些情况下，提取后的试样溶液还需要进行衍生处理，其中衍生试剂用量、衍生介质pH、衍生温度时间、衍生后溶液放置的稳定性等都对结果有一定影响。部分项目衍生后还要进一步液液萃取净化。如GB/T 21311-2007 动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法 高效液相色谱/串联质谱法，提取和净化（7.2）操作中pH调节是关键，pH在7-7.5之间时，四种代谢物衍生物萃取效率最高。试样溶液的制备：试样在经过提取、净化后，往往还要采取氮吹、旋蒸等浓缩处理，对一些较为不稳定的目标化合物，需注意温度、流速、浓缩程度等。按照方法要求进行复溶，为避免

14、溶剂效应，一般会采取初始流动相比例的溶液进行复溶。方法中还可能使用空白基质溶液复溶来减少基质效应。有些兽药残留项目复溶后，如溶液仍显浑浊，可采取低温冷藏后进行离心或在对目标化合物没影响的情况下使用少量正己烷进一步脱脂。复溶过滤时需注意滤膜可能吸附或干扰的情况。而元素项目，试样溶液制备中重点关注的是试样溶液的酸度和标准系列溶液酸度的一致性，在含量较低情况下，可能容器会对元素进行吸附而影响检验结果，需及时开展检测。有些项目需要进行显色剂比色后测定，要注意显色试剂、用量、加入顺序、显色温度、时间及放置稳定性等条件的控制。3）空白试验：全空白试验监控从试样制备到试样溶液的制备整个环节，对分析接触工具（

15、菜板、粉碎机等）、人员（制样人员、检验人员等）、试剂、接触耗材（酶、固相萃取小柱、滤膜、色谱柱等）、试验器皿、仪器分析系统等对样品的交叉污染或干扰至关重要。试样制备必须注意防范污染，而试样溶液的制备务必同步制备全空白溶液。本期食品理化检验方法主要内容和使用要点解读延续上两期内容，重点阐释技术要求中的其他内容和方法使用的注意要点。分析步骤仪器参考条件：方法中会给出仪器参考条件，如色谱仪，色谱柱、流动相、程序升温条件、检测器、质谱参数等。一般食品添加剂检测使用液相色谱或气相色谱，而部分兽药残留或农药残留采用色谱质谱联用。在给定参考仪器条件时，我们需要注意的是可能某些样品基质有干扰。检测色谱项目时，

16、可使用DAD光谱监控、改变流动相梯度或程序升温来验证。日常检验经验显示三氯蔗糖、TBHQ、山梨酸、阿斯巴甜、糖精钠等项目可能会存在干扰，需要借助更换色谱柱、改变流动相或使用质谱进一步确认。如GB 5009.28-2016食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定第一法中，5.3仪器参考条件中注：当存在干扰峰或需要辅助定性时，可以采用加入甲酸的流动相来测定，实际检测中发现该系统可以提高分离来验证干扰。而色谱质谱联用时，可在方法验证开发质谱条件时，设定多对定性离子来辅助确证。标准曲线制作：有外标法、内标法、基质匹配、基质加标随行、标准加入法等方式，标准曲线范围往往结合目标化合物的仪器响应、方法检出限或定量

17、限、标准限量值、常见关注浓度综合确定。标准曲线配制要注意容器的洁净、体积的精准加入、试剂的顺序加入和温度时间的控制（显色）等，并尽可能保证标准系列和待测物质相同的基体和介质。另外，标准曲线仪器分析时，从低到高浓度进样，并且进样序列中要穿插适当浓度的标准溶液进行仪器响应监控。要特别注意的是标准曲线产生的不确定度是一个重要的分量。试样溶液的测定：测定中往往分为定性测定和定量测定。定性测定依据保留时间、定性离子的相对丰度比等进行分析。定性确证较为重要，尤其针对复杂基质存在的干扰。识别干扰依赖于日常对分析系统的稳定性、基质效应的评估，也可借助其他手段，如DAD光谱图、质谱等来辅助识别。采用定性离子相对

18、丰度比时，要尽可能采用基质匹配、浓度相当的标准溶液建立参考。定量测定需要注意的是进样中要监控全试剂空白，避免交叉污染；样品溶液的待测物的响应值应在仪器测定的线性范围内，适当情况下可将样品溶液进行稀释。结果计算和表达结果计算和表达会明确计算公式、结果单位和保留有效位数，其中数据修约可参考GB/T 8170-2008（数值修约规则与极限数值的表示和判定）。总则4.3.1中明确，在判定测定值或其计算值是否符合标准要求时，应将测试所得的测定结果或其计算值与标准规定的极限数值作比较，而食品检测一般会使用全数值比较法，在日常进行结果判定时要尤其注意。另外，如分析结果未检出，可用未检出表述分析结果，同时应注

19、明定量限（或检出限）。精密度精密度是指在规定条件下，对同一或类似被测对象重复测量所得示值或测得的量值间的一致程度。方法中一般会明确为，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值超过均值的百分比要求。有些方法会因为浓度水平不同而设置不同的要求。日常实验精密度达不到方法规定要求时，往往是因为表征分析系统存在异常，需要系统排查原因。一方面可能是样品制样不均匀，溶剂提取、水解酶解、淋洗洗脱、溶剂复溶等条件不充分，人员、容器、分析系统被污染都有可能影响精密度。其他其他规定了方法的检出限和定量限，这也是方法验证时需要满足的重要参数条件。检出限或定量限水平的满足对于不得使用、禁用等指标的判定尤其重要；如

20、达不到要求，需要进一步优化仪器条件，或考察试剂纯度等影响。另外，方法中可能还会给出不同浓度的准确度考察要求，以及参考色谱图等，方法使用时都需要作为参考验证使用。理化检验方法验证参照GB/T 27417，方法验证是指实验室通过核查，提供客观有效证据证明满足检测方法规定的要求。即证实该方法能在该实验室现有的设施设备、人员、环境等条件下获得令人满意的结果，必要时可参加能力验证或进行实验室间比对。方法验证过程中关键的参数取决于方法的特性和可能测到的样品基质的范围，至少应测定正确度和精密度。对于痕量分析，实验室还应确保检出限、定量限的验证。当然，还可验证线性范围、基质效应等，方法回收率偏差范围可参考GB

21、/T 27404要求。检验过程质量控制方法的验证只能证实实验室要素满足方法的要求和实验室拥有相应的技术能力，但不能充分表征批量实验结果的准确性和分析系统是否正常。批量实验时，为监控可能由于环境、试剂、接触品、人员、实验操作、分析系统等关键要素对结果的异常影响，需要加强检验过程质量控制，做到有效科学评估实验结果。一般会采取全试剂空白、有证标准物质、平行样、关键点加标回收（定量限或限量水平或其他关注浓度）、在线分析监控、不同原理方法比对、人员比对、不同来源标准品比较等多种方式进行监控。日常需积累如空白响应、关键点仪器响应、基质效应、平行样精密度、回收率水平、标准物质测定值等重要信息，尽可能同一实验室稳定，也可采用质量控制图来进行分析预警。归纳总结使用理化检验方法时，要系统化理解方法所有要求，包括方法的各部分技术要求和方法操作关键点等；平时要积累方法的性能参数，便于识别实验异常的重要信号；批量痕量分析时，要采取针对性手段加强过程质量控制，确保结果的准确性和有效性。余晓琴（四川省食品药品检验检测院）转载自中国市场监管报