转基因动物与生物反应器 课件.ppt

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1、转基因动物与生物反应器 第1页，此课件共158页哦 随着随着DNADNA内部结构和遗传机制的揭示，生物学家不再仅内部结构和遗传机制的揭示，生物学家不再仅仅满足于探索、揭示生物遗传的秘密，而是设想仅满足于探索、揭示生物遗传的秘密，而是设想在分子水平在分子水平上去改造生物的遗传特性。上去改造生物的遗传特性。9.1 转基因技术转基因技术第2页，此课件共158页哦 如果将一种生物如果将一种生物DNADNA中的中的某个遗传密码片段某个遗传密码片段连接到另外一连接到另外一种生物的种生物的DNADNA链上去，将链上去，将DNADNA重新组织一下，就可以按照人重新组织一下，就可以按照人类的愿望设计出新的遗传物

2、质，从而创造出新的生物。类的愿望设计出新的遗传物质，从而创造出新的生物。这种按照人的意愿，由重新组装基因到新生物产生的生物技这种按照人的意愿，由重新组装基因到新生物产生的生物技术，就称为基因工程技术。术，就称为基因工程技术。第3页，此课件共158页哦 基因工程技术的特点：基因工程技术的特点：基因体外重组、基因体外重组、即在离体条件下对即在离体条件下对DNADNA分子切割并将其与分子切割并将其与载体载体DNADNA分子连接，得到重组分子连接，得到重组DNADNA。世界上第一批重组世界上第一批重组DNADNA分子诞生于分子诞生于19721972年，次年几种不同年，次年几种不同来源的来源的DNADN

3、A分子装入载体后被分子装入载体后被转入到大肠杆菌转入到大肠杆菌中表达，标志中表达，标志着基因工程正式登上历史舞台。着基因工程正式登上历史舞台。第4页，此课件共158页哦 发展：发展：1 1、外来基因能在生物体内表达、外来基因能在生物体内表达 19741974年，美国斯坦福大学教授年，美国斯坦福大学教授科恩科恩把把金黄色葡萄球菌的抗金黄色葡萄球菌的抗药性基因片段药性基因片段和大肠杆菌的质粒和大肠杆菌的质粒“组装组装”成杂合质粒，送入成杂合质粒，送入大肠杆菌体内，使这种大肠杆菌体内，使这种大肠杆菌获得了对青霉素的抗药性大肠杆菌获得了对青霉素的抗药性。这说明金黄色菌萄球菌质粒上的抗青霉素基因由杂合质

4、粒这说明金黄色菌萄球菌质粒上的抗青霉素基因由杂合质粒带到大肠杆菌体内，更重要的是带到大肠杆菌体内，更重要的是表明外来基因在大肠杆菌体内表明外来基因在大肠杆菌体内同样也发生作用。同样也发生作用。第5页，此课件共158页哦2 2、基因工程完全可以不受生物种类的限制，而按照人基因工程完全可以不受生物种类的限制，而按照人类的意愿去拼接基因，创造新的生物。类的意愿去拼接基因，创造新的生物。19741974年，科恩又将年，科恩又将非洲爪蟾的非洲爪蟾的DNADNA与大肠杆菌的质粒与大肠杆菌的质粒“拼拼接接”，获得成功，拼接后的杂合质粒进入，获得成功，拼接后的杂合质粒进入大肠杆菌大肠杆菌，产生了，产生了非洲爪

5、蟾的核糖体核糠核酸非洲爪蟾的核糖体核糠核酸(rRNA)(rRNA)；两栖动物的基因能在细菌两栖动物的基因能在细菌里发挥作用里发挥作用 科恩随后以科恩随后以DNADNA重组技术发明人的身份向英国专利局申报重组技术发明人的身份向英国专利局申报专利、因此专利、因此成为世界上第一个基因工程的技术专利拥有人。成为世界上第一个基因工程的技术专利拥有人。第6页，此课件共158页哦 科恩的实验首次打破了不同物种在亿万年中形成的天然科恩的实验首次打破了不同物种在亿万年中形成的天然屏障，他的成功屏障，他的成功标志着任何不同种类生物学基因都能通过标志着任何不同种类生物学基因都能通过基因工程技术重组到一起，人类可以根

6、据自己的意愿定基因工程技术重组到一起，人类可以根据自己的意愿定向地改造生物的遗传特性，甚至创造新的生命类型。向地改造生物的遗传特性，甚至创造新的生命类型。人类历史上第一次具备了精确、细致地控制生物生长过程的人类历史上第一次具备了精确、细致地控制生物生长过程的能力。比如：我们可以从在极地生活的鱼类中提取抵御严寒的基能力。比如：我们可以从在极地生活的鱼类中提取抵御严寒的基因，再把它们插入到草莓中去，让草莓也能在极寒的地区生存。因，再把它们插入到草莓中去，让草莓也能在极寒的地区生存。如今，基因重组技术在如今，基因重组技术在生产医药生产医药上重要的药物以及在上重要的药物以及在农牧业育农牧业育种种等领域

7、中取得了很多成果。等领域中取得了很多成果。第7页，此课件共158页哦 对于基因工程，范围是相当广泛的。如对于基因工程动对于基因工程，范围是相当广泛的。如对于基因工程动物而言，就有物而言，就有转基因转基因、基因替换基因替换、内源基因敲除内源基因敲除等类型的基因等类型的基因工程动物。工程动物。本章仅重点介绍基因工程中的本章仅重点介绍基因工程中的转基因技术，即：转基因技术，即：将通过人工操作的方式将外源基因整合到生物体基因组内，使将通过人工操作的方式将外源基因整合到生物体基因组内，使该转基因生物能稳定地将此基因遗传给后代的实验技术。该转基因生物能稳定地将此基因遗传给后代的实验技术。第8页，此课件共1

8、58页哦 基因转移的方法基因转移的方法 物理方法物理方法 化学方法化学方法 生物学方法生物学方法9 91 11 1 细胞转染外源基因的方法细胞转染外源基因的方法第9页，此课件共158页哦 向细胞中导入外源基因是定向改变细胞遗传性状的常用手段。向细胞中导入外源基因是定向改变细胞遗传性状的常用手段。要使外源基因有效地转入受体细胞要使外源基因有效地转入受体细胞首先首先 要选择合适的受体细胞要选择合适的受体细胞其次其次 要有可靠的转化后筛选方法要有可靠的转化后筛选方法 常用的哺乳动物细胞转染常用的哺乳动物细胞转染(接受外源基因接受外源基因)的方法有两种：的方法有两种：(1)(1)暂时转染：暂时转染：质

9、粒在宿主细胞中不必停留很长时间，质粒在宿主细胞中不必停留很长时间，DNADNA被转录成被转录成mRNAmRNA，随后翻译成蛋白，并不进入细胞基因组。，随后翻译成蛋白，并不进入细胞基因组。磷酸钙沉淀法、磷酸钙沉淀法、DEAEDEAE葡聚糖葡聚糖法均为暂时转染。法均为暂时转染。(2)(2)永久性转染：永久性转染：反转录病毒载体法可以产生永久有效的转染。反转录病毒载体法可以产生永久有效的转染。第10页，此课件共158页哦 (一一)电穿孔法电穿孔法 这种方法这种方法利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，在细胞利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，在细胞膜上形成纳米级的微孔，从而使外源膜上形成纳米级的微孔，从而使外

10、源DNADNA转移至细胞中。转移至细胞中。这种方法简单、效率较高，因而广泛应用于培养细胞这种方法简单、效率较高，因而广泛应用于培养细胞的基因转移。的基因转移。将受体细胞悬浮于含有待转化将受体细胞悬浮于含有待转化DNADNA的溶液中，在盛有上述的溶液中，在盛有上述悬浮液的电击池两端施加短暂的脉冲电场，使细胞膜产生细悬浮液的电击池两端施加短暂的脉冲电场，使细胞膜产生细小的空洞达到增加通透性的效果；此时，外源小的空洞达到增加通透性的效果；此时，外源DNADNA片段能片段能不经不经过胞饮作用过胞饮作用就能直接进入细胞质。就能直接进入细胞质。物理方法物理方法第11页，此课件共158页哦 第12页，此课件

11、共158页哦 第13页，此课件共158页哦 （二（二)微注射法微注射法 显微注射法主要用于制备转基因动物。基本操作方法如下显微注射法主要用于制备转基因动物。基本操作方法如下9-9-2 2。通过通过激素疗法激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄鼠交配，然后处死使雌鼠超数排卵，并与雄鼠交配，然后处死雌鼠，取出受精卵。然后借助于显微镜将纯化的雌鼠，取出受精卵。然后借助于显微镜将纯化的DNADNA溶液迅速溶液迅速注入受精卵中变大的雄核内。将该受精卵移植到另外一注入受精卵中变大的雄核内。将该受精卵移植到另外一只假受孕母鼠的输卵管内，正常发育、繁殖出转基因鼠。只假受孕母鼠的输卵管内，正常发育、繁殖出转基因鼠。第1

12、4页，此课件共158页哦 拥有长寿基因的鼠拥有长寿基因的鼠第15页，此课件共158页哦 优点：优点：这种方法转入的基因长度可达数百这种方法转入的基因长度可达数百kbkb，并能随机地整合在受体细胞染色体并能随机地整合在受体细胞染色体DNADNA上，因此应上，因此应用范围广。用范围广。缺点：缺点：但是这种整合有时会导致转基因动物基因但是这种整合有时会导致转基因动物基因组的重排、易位、缺失或定点突变。组的重排、易位、缺失或定点突变。第16页，此课件共158页哦 (三三)裸露裸露DNADNA直接注射法直接注射法 将裸露将裸露DNADNA直接注射到组织中，直接注射到组织中，DNADNA有可能直接被细胞所

13、有可能直接被细胞所摄入。摄入。这是最简单的基因转移方法。但是转移效率较低这是最简单的基因转移方法。但是转移效率较低第17页，此课件共158页哦 基因转移的化学方法主要包括：基因转移的化学方法主要包括：DEAEDEAE葡聚糖法葡聚糖法、磷酸钙磷酸钙DNADNA共沉淀法、脂质体载体包埋法等。共沉淀法、脂质体载体包埋法等。主要原理：主要原理：通过改变细胞膜的通透性或者增加通过改变细胞膜的通透性或者增加DNADNA与细胞的与细胞的吸附而实现基因的转移。吸附而实现基因的转移。化学方法化学方法第18页，此课件共158页哦 (一一)DEAE)DEAE葡聚糖法葡聚糖法 最早的动物细胞转染方法最早的动物细胞转染

14、方法；主要是将主要是将外源外源DNADNA片段片段与与DEAEDEAE葡聚糖葡聚糖等高分子碳水化合等高分子碳水化合物物混合混合，这样，这样DNADNA链上带负电的磷酸骨架便被吸附于链上带负电的磷酸骨架便被吸附于DEAEDEAE正正电荷基团上，从而形成电荷基团上，从而形成DNADNA大颗粒。后者黏附于受体细胞大颗粒。后者黏附于受体细胞表面，并通过胞饮作用进入细胞内。表面，并通过胞饮作用进入细胞内。该方法的转化率较低。该方法的转化率较低。第19页，此课件共158页哦 （二）磷酸钙（二）磷酸钙-DNA-DNA共沉淀法共沉淀法二价金属离子能促进细菌吸收外源二价金属离子能促进细菌吸收外源DNADNA 当

15、核酸以当核酸以磷酸钙磷酸钙-DNA-DNA共沉淀物共沉淀物的形式存在时，细胞摄取的形式存在时，细胞摄取DNADNA的能力显著加强。的能力显著加强。第20页，此课件共158页哦 第21页，此课件共158页哦 将将待转化的待转化的DNADNA溶解在溶解在磷酸根离子的缓冲液磷酸根离子的缓冲液中，此时磷酸中，此时磷酸钙与钙与DNADNA共沉淀形成大颗粒。加入受体细胞培养一段时间后，共沉淀形成大颗粒。加入受体细胞培养一段时间后，DNADNA就通过就通过脂相收缩时裂开的空隙脂相收缩时裂开的空隙进入细胞，或者在钙、磷的进入细胞，或者在钙、磷的诱导作用下被细胞吞噬而进入细胞内，从而使外源诱导作用下被细胞吞噬而

16、进入细胞内，从而使外源DNADNA整合到整合到受体细胞中得到表达。受体细胞中得到表达。该方法的转染效率虽比该方法的转染效率虽比DEAEDEAE葡聚糖法高出约葡聚糖法高出约100100倍，但倍，但还是比较低，还是比较低，仅有仅有1 15 5的外源的外源DNADNA可以进入受体细胞核可以进入受体细胞核中，中，大约仅有大约仅有1 1的的DNADNA可以在细胞中稳定表达。可以在细胞中稳定表达。第22页，此课件共158页哦 （三）脂质体载体包埋法（三）脂质体载体包埋法 脂质体为人工膜泡，可作为体内外物质传送的裁体。脂质体为人工膜泡，可作为体内外物质传送的裁体。将将需转移的外源需转移的外源DNADNA或或

17、RNARNA包裹于脂质体内，由于脂质体具包裹于脂质体内，由于脂质体具有磷脂双层结构，与细胞膜类似，因此可以与受体细胞膜融合，有磷脂双层结构，与细胞膜类似，因此可以与受体细胞膜融合，从而将外源从而将外源DNADNA转入宿主细胞。转入宿主细胞。这种方法转基因效率高。这种方法转基因效率高。第23页，此课件共158页哦 第24页，此课件共158页哦 将待转移的将待转移的DNADNA溶液与天然或人工合成的磷脂混合，后者在溶液与天然或人工合成的磷脂混合，后者在表面活性剂存在的条件下形成表面活性剂存在的条件下形成包埋水相包埋水相DNADNA的脂质体结构。的脂质体结构。当这种当这种脂质体脂质体悬浮液中加入到细

18、胞培养皿中便悬浮液中加入到细胞培养皿中便会与受体细会与受体细胞膜发生融合胞膜发生融合，DNADNA片段随即进入细胞质和细胞核内片段随即进入细胞质和细胞核内，第25页，此课件共158页哦 基因转移的生物学方法主要是基因转移的生物学方法主要是病毒介导的基因转移病毒介导的基因转移。根。根据受体细胞类型不同可选择不同宿主范围和不同感染途径据受体细胞类型不同可选择不同宿主范围和不同感染途径的病毒基因组作为转化载体。的病毒基因组作为转化载体。目前常用的病毒载体包括目前常用的病毒载体包括DNADNA病毒载体病毒载体(腺病毒载体、牛痘腺病毒载体、牛痘病毒载体等病毒载体等)、逆转录病毒载体逆转录病毒载体等。等。

19、生物学方法生物学方法第26页，此课件共158页哦 对于对于DNADNA病毒载体，以腺病毒载体为例。腺病毒基因组病毒载体，以腺病毒载体为例。腺病毒基因组DNADNA全长全长36kb36kb，其包装上限为原基因组的，其包装上限为原基因组的105105、即、即37.8kb37.8kb。优点优点 安全性好、不整合人染色体、不导致肿瘤发生、安全性好、不整合人染色体、不导致肿瘤发生、宿主范围广、对受体细胞分裂周期要求不严、外源基因在宿主范围广、对受体细胞分裂周期要求不严、外源基因在载体上容易高效表达。载体上容易高效表达。第27页，此课件共158页哦 逆转录病毒载体逆转录病毒载体是一种传染性病毒，含有是一种

20、传染性病毒，含有RNARNA遗传物质，遗传物质，可将非病毒基因转移至分裂细胞。感染进细胞的可将非病毒基因转移至分裂细胞。感染进细胞的RNARNA反转录反转录产生产生DNADNA互补链，该互补链，该DNADNA又可以作为合成第二条又可以作为合成第二条DNADNA链的模板。链的模板。这两条这两条DNADNA链可渗入受体细胞的基因组链可渗入受体细胞的基因组DNADNA中。之后，病毒中。之后，病毒利用宿主细胞的酶体系自行转录与复制、从而可以使病毒利用宿主细胞的酶体系自行转录与复制、从而可以使病毒单拷贝基因组稳定地进宿主细胞。单拷贝基因组稳定地进宿主细胞。逆转录病毒载体可以获得稳定、有效的转染，可用于逆

21、转录病毒载体可以获得稳定、有效的转染，可用于不不易转化的细胞或原代培养细胞。易转化的细胞或原代培养细胞。第28页，此课件共158页哦 但是病毒载体也具有一些但是病毒载体也具有一些缺陷缺陷 如：如：1 1、所有病毒载体都会诱导产生一定程度的所有病毒载体都会诱导产生一定程度的免疫反应免疫反应 2 2、或多或少存在一定的或多或少存在一定的安全隐患安全隐患 3 3、转导能力有限转导能力有限，不适合大规模生产。，不适合大规模生产。第29页，此课件共158页哦 1 1、可以设计可以设计含有抗药性基因的外源含有抗药性基因的外源DNADNA载体载体，然后通然后通过选择性培养基进行转染细胞的筛选。过选择性培养基

22、进行转染细胞的筛选。2 2、可以通过提取转染细胞的、可以通过提取转染细胞的DNADNA，以适当限制性内切酶酶切，以适当限制性内切酶酶切后进行后进行SouthernSouthern转移分析，检验细胞中是否有被转移的外源转移分析，检验细胞中是否有被转移的外源基因。基因。9 9.1 1.2 2 转染细胞的鉴定转染细胞的鉴定第30页，此课件共158页哦9.2.1 9.2.1 定义与发展历史定义与发展历史 转基因动物转基因动物是指在基因组内稳定地整合以实验方法导入的是指在基因组内稳定地整合以实验方法导入的外源基因，并且外源基因可以稳定地遗传给后代的遗传工程动物。外源基因，并且外源基因可以稳定地遗传给后代

23、的遗传工程动物。9.29.2 转基因动物转基因动物第31页，此课件共158页哦 1974 1974年，年，JaenishJaenish和和MintzMintz应用显微注射法，在世界上应用显微注射法，在世界上首次成功地获得了首次成功地获得了AV40 DNAAV40 DNA转基因小鼠。转基因小鼠。19801980年，年，GordonGordon等人首先育成带有等人首先育成带有人胸苷激酶基因人胸苷激酶基因的转基因的转基因小鼠。小鼠。PalmiterPalmiter等人于等人于19821982年将年将大鼠的生长激素基因大鼠的生长激素基因导入小鼠导入小鼠受精卵的雄原核中，获得了比普通对照小鼠生长速度快受

24、精卵的雄原核中，获得了比普通对照小鼠生长速度快2-42-4倍、体形大一倍的转基因倍、体形大一倍的转基因“硕鼠硕鼠”，从此转基因动物从此转基因动物技术轰动了整个生命科学界。技术轰动了整个生命科学界。第32页，此课件共158页哦 它使人们看到了利用此技术在它使人们看到了利用此技术在建立人类疾病动物模型建立人类疾病动物模型、加速动物育种加速动物育种、研究真核生物基因表达调控机制研究真核生物基因表达调控机制，以及在，以及在哺乳动物特异组织系统内生产人的药用蛋白等方面令人鼓哺乳动物特异组织系统内生产人的药用蛋白等方面令人鼓舞的前景。舞的前景。第33页，此课件共158页哦 在随后的十几年里，转基因动物技术

25、飞速发展，在随后的十几年里，转基因动物技术飞速发展，转基因转基因兔、转基因绵羊、转基因猪、转基因牛和转基因山羊兔、转基因绵羊、转基因猪、转基因牛和转基因山羊陆续陆续育成育成 除哺乳动物外，科学家还分别合成了除哺乳动物外，科学家还分别合成了转基因鱼、转基因鸡转基因鱼、转基因鸡，这些开创性的工作使人们可以从分子、细胞和个体多水这些开创性的工作使人们可以从分子、细胞和个体多水平层次，从发育时间和组织生理空间多角度、立体地研平层次，从发育时间和组织生理空间多角度、立体地研究基因的功能，使人类按照自己的意愿修正和改造物种。究基因的功能，使人类按照自己的意愿修正和改造物种。第34页，此课件共158页哦9

26、92 22 21 1 原理与方法原理与方法 随着分子生物学与哺乳动物胚胎操作技术的不断发展，随着分子生物学与哺乳动物胚胎操作技术的不断发展，将将外源目的基因导入早期胚胎培育转基因动物已经由可能外源目的基因导入早期胚胎培育转基因动物已经由可能变成了现实变成了现实。以动物个体为受体的转基因技术首先是从小鼠开始的，以动物个体为受体的转基因技术首先是从小鼠开始的，转基转基因小鼠因小鼠为研究特定基因及其表达调控机制提供了独特的为研究特定基因及其表达调控机制提供了独特的实验模实验模型型。但就经济效益而言，大型家畜动物的转基因动物更具有开但就经济效益而言，大型家畜动物的转基因动物更具有开发价值。发价值。9

27、92 22 2 转基因动物的制备转基因动物的制备第35页，此课件共158页哦 基于基因工程的基本原理与技术方法，生产转基因动物的关基于基因工程的基本原理与技术方法，生产转基因动物的关键技术包括：键技术包括：外源目的基因的制备；外源目的基因的制备；外源目的基因有效的导入生殖细胞或胚胎干细胞；外源目的基因有效的导入生殖细胞或胚胎干细胞；选择获得携有目的基因的细胞选择获得携有目的基因的细胞 选择合适的体外培养系统和宿主动物；选择合适的体外培养系统和宿主动物；转基因细胞胚胎发育及鉴定；转基因细胞胚胎发育及鉴定；筛选所得的转基因动物品系。筛选所得的转基因动物品系。第36页，此课件共158页哦 转基因动物

28、研究的核心技术是转基因动物研究的核心技术是如何成功地把目的基因如何成功地把目的基因转入动物早期胚胎细胞中。转入动物早期胚胎细胞中。主要方法：主要方法：基因显微注射法基因显微注射法 胚胎干细胞移植法胚胎干细胞移植法 反转录病毒感染法反转录病毒感染法 精子载体导入法精子载体导入法第37页，此课件共158页哦 （一）原核期胚胎显微注射法（一）原核期胚胎显微注射法 基因显微注射法是由美国人基因显微注射法是由美国人GordonGordon发明的发明的,也是一种比也是一种比较经典、应用比较广泛、效果比较稳定的转基因导入方法。较经典、应用比较广泛、效果比较稳定的转基因导入方法。首例表达首例表达人胸苷激酶基因

29、人胸苷激酶基因、人生长激素基因的转基因小鼠、人生长激素基因的转基因小鼠都是利用这种方法获得成功的。都是利用这种方法获得成功的。目前采用这种方法已成功培育出转基因小鼠、猪、绵目前采用这种方法已成功培育出转基因小鼠、猪、绵羊、免和牛。羊、免和牛。第38页，此课件共158页哦 基本原理是：基本原理是：通过显微操作仪将外源基因直接用注射器通过显微操作仪将外源基因直接用注射器注入注入受精卵受精卵(雄原核内雄原核内)，利用受精卵繁殖中，利用受精卵繁殖中DNADNA的复制的复制过程，将外源基因整合到过程，将外源基因整合到DNADNA中，再发育成转基因动中，再发育成转基因动物。物。第39页，此课件共158页哦

30、 具体而言，基因显微注射法主要包括以下几具体而言，基因显微注射法主要包括以下几个步骤：个步骤：(1)DNA(1)DNA的制备与纯化的制备与纯化 (2)(2)动物的挑选、超排卵与取卵动物的挑选、超排卵与取卵 (3)DNA(3)DNA的显微注射的显微注射 (4)(4)卵的转移卵的转移 (5)(5)转基因动物的获得转基因动物的获得第40页，此课件共158页哦 （二）反转录病毒感染法（二）反转录病毒感染法 反转录病毒的核酸为一条反转录病毒的核酸为一条单链单链RNARNA分子分子。病毒进入细胞后，。病毒进入细胞后，RNARNA首先首先编码出反转录酶，在酶作用下，病毒编码出反转录酶，在酶作用下，病毒RNA

31、RNA反转录为双链分子，反转录为双链分子，DNADNA通过通过一种尚未明确的机制整合列宿主细胞一种尚未明确的机制整合列宿主细胞DNADNA中。中。方法方法:1)1)将目的基因重组到反转录病毒载体上，人为感染着床前或着床后将目的基因重组到反转录病毒载体上，人为感染着床前或着床后的胚胎，的胚胎，2)2)直接将胚胎与能释放反转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染目的，直接将胚胎与能释放反转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染目的，就可通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因组就可通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因组DNADNA中。中。第41页，此课件共158页哦 由于反转录病毒的由于反转录病毒

32、的高效率感染高效率感染和在宿主细胞和在宿主细胞DNADNA上的上的高度高度整合特性整合特性，借此可以大大提高基因转移的效率。，借此可以大大提高基因转移的效率。应用该方法已成功培育出转基因鸡和牛。应用该方法已成功培育出转基因鸡和牛。第42页，此课件共158页哦 胚胎干细胞胚胎干细胞(ES)(ES)是从是从早期胚胎内细胞团早期胚胎内细胞团(1cM)(1cM)中分离出来中分离出来的，能在体外培养的一种高度的，能在体外培养的一种高度未分化未分化的多能细胞。在某种意的多能细胞。在某种意义上也可以说，它是一种含正常二倍染色体的具有义上也可以说，它是一种含正常二倍染色体的具有发育全能性发育全能性的的细胞，能

33、分化为成体动物的所有组织细胞，能分化为成体动物的所有组织(包括生殖细胞包括生殖细胞)。在发育上类似于早期胚胎的内细胞团细胞、当被注入囊胚腔在发育上类似于早期胚胎的内细胞团细胞、当被注入囊胚腔后可以参与包括生殖腺在内的各种组织嵌合体的形成。后可以参与包括生殖腺在内的各种组织嵌合体的形成。因此只要将外源因此只要将外源DNADNA导入胚胎干细胞就可以实现基因的转移。导入胚胎干细胞就可以实现基因的转移。(三三)胚胎干细胞方法胚胎干细胞方法第43页，此课件共158页哦 第44页，此课件共158页哦 以胚胎干细胞作为外源基因引入的载体有许多以胚胎干细胞作为外源基因引入的载体有许多方法，包括：脂质体转染、原

34、生质体融合等。还方法，包括：脂质体转染、原生质体融合等。还可以如图可以如图9 9-6 6所示的那样，所示的那样，外源外源DNADNA转化转化ESES细胞后再通过核移植产生转基因动细胞后再通过核移植产生转基因动物物，也可以也可以通过聚合法或注射法产生嵌合体通过聚合法或注射法产生嵌合体，经过嵌，经过嵌合体的繁育获得转基因动物。合体的繁育获得转基因动物。第45页，此课件共158页哦 利用利用ESES细胞途径获得转基因动物的关键之处是细胞途径获得转基因动物的关键之处是ESES细胞的细胞的分离和获得分离和获得。当外源基因移入到当外源基因移入到ESES细胞基因组后，既能高效稳定表达，细胞基因组后，既能高效

35、稳定表达，又不影响又不影响ESES细胞的各种功能。细胞的各种功能。ESES细胞不仅使转基因的成功率细胞不仅使转基因的成功率大大提高，而且使基因剔除、基因诱捕等技术成为可能。大大提高，而且使基因剔除、基因诱捕等技术成为可能。第46页，此课件共158页哦 采用胚胎干细胞方法和胚胎移植技术实现采用胚胎干细胞方法和胚胎移植技术实现转基因动物制转基因动物制备的基本具体步骤备的基本具体步骤 1 1、从胚胎分离出胚胎干细胞，通过转录将外源基因导入细、从胚胎分离出胚胎干细胞，通过转录将外源基因导入细胞内，再将其转入到植入前胚胎的胚泡腔。胞内，再将其转入到植入前胚胎的胚泡腔。2 2、这些带有外源基因的胚胎干细胞

36、可嵌入宿主囊胚的、这些带有外源基因的胚胎干细胞可嵌入宿主囊胚的内细胞团中参与胚胎发育、出生的动物其生殖系统就有内细胞团中参与胚胎发育、出生的动物其生殖系统就有可能整合上外源基因可能整合上外源基因 3 3、通过杂交繁育就可得到具有纯合目的基因的个体，通过杂交繁育就可得到具有纯合目的基因的个体，即转基因动物。即转基因动物。第47页，此课件共158页哦 (四四)精子载体法精子载体法 由于显微注射技术的效率很低，加之设备昂贵，因此人们一由于显微注射技术的效率很低，加之设备昂贵，因此人们一直在试图寻找一种简单、有效和广泛适用的方法将外源基因导入直在试图寻找一种简单、有效和广泛适用的方法将外源基因导入到任

37、意种类动物到任意种类动物(如哺乳类、禽类及鱼类如哺乳类、禽类及鱼类)的基因组内。的基因组内。第48页，此课件共158页哦 精子载体法精子载体法是一种直接用精子作为外源是一种直接用精子作为外源DNADNA载体的转移方法。载体的转移方法。基本原理和方法是：精子直接与外源基本原理和方法是：精子直接与外源DNADNA混合培养，外源混合培养，外源基因可以直接进入精子头部，受精后就可发育成转基因动基因可以直接进入精子头部，受精后就可发育成转基因动物。物。第49页，此课件共158页哦 后来罗特曼后来罗特曼(Rottman)(Rottman)对此方法进行了改进，将外源对此方法进行了改进，将外源DNADNA在与

38、精子共孵育之前用脂质体包埋，使脂质体与在与精子共孵育之前用脂质体包埋，使脂质体与DNADNA相互作用相互作用形成脂质体形成脂质体DNADNA复合物。这种复合体比较容易和精子细胞融合，复合物。这种复合体比较容易和精子细胞融合，从而进入细胞内。从而进入细胞内。我国学者使用我国学者使用阳离子脂质体介导技术阳离子脂质体介导技术进行操作，方便、进行操作，方便、重复性好、转染率高。尽管该方法的可靠性尚有争论，重复性好、转染率高。尽管该方法的可靠性尚有争论，但是由于它的经济性与方便性，许多研究者在进行该方但是由于它的经济性与方便性，许多研究者在进行该方法的改进工作。法的改进工作。第50页，此课件共158页哦

39、（五）人工酵母染色体法（五）人工酵母染色体法 人工酵母染色体是近年来才发展起来的一种新型载体，人工酵母染色体是近年来才发展起来的一种新型载体，具有克隆百万碱基对级的大片段具有克隆百万碱基对级的大片段DNADNA的能力。的能力。19921992年人们采用该方法获得了具有百万碱基对外源年人们采用该方法获得了具有百万碱基对外源DNADNA的转的转基因小鼠。基因小鼠。这种方法最明显的优点是可以保证巨大基因的完整性这种方法最明显的优点是可以保证巨大基因的完整性及较长外源基因片段在转基因动物中的较高的整合率。及较长外源基因片段在转基因动物中的较高的整合率。第51页，此课件共158页哦 (六六)受精前卵细胞

40、显微注射法受精前卵细胞显微注射法 受精前卵细胞显微注射法是将外源基因克隆至反转录病毒受精前卵细胞显微注射法是将外源基因克隆至反转录病毒载体，然后将这一携带外源目的基因的缺陷型反转录病毒通过显载体，然后将这一携带外源目的基因的缺陷型反转录病毒通过显微注射技术，注入到受精前卵细胞的卵周腔，然后再体外受精，微注射技术，注入到受精前卵细胞的卵周腔，然后再体外受精，培养至囊胚期，移入假孕的雌性动物子宫内发育。培养至囊胚期，移入假孕的雌性动物子宫内发育。第52页，此课件共158页哦这种方法的优点主要体现在以下两个方面：这种方法的优点主要体现在以下两个方面：(1)(1)目前大型动物转基因普遍采用原核显微注射

41、法，但目前大型动物转基因普遍采用原核显微注射法，但是大型动物受精卵的原核不如小鼠等的清晰可见，因此给是大型动物受精卵的原核不如小鼠等的清晰可见，因此给显微注射带来极大不便。目前采用离心等方法显现原核，显微注射带来极大不便。目前采用离心等方法显现原核，效果也不理想。而采用受精前卵细胞显微注射法就可能避效果也不理想。而采用受精前卵细胞显微注射法就可能避免这一难题。免这一难题。第53页，此课件共158页哦 能使首代转基因动物阳性率显著提高。而且，由于仅需将外能使首代转基因动物阳性率显著提高。而且，由于仅需将外源基因注射进卵细胞周腔即可，不需刺破细胞质膜及原核膜，源基因注射进卵细胞周腔即可，不需刺破细

42、胞质膜及原核膜，所以对卵造成的机械损伤极小，因此注射后的卵细胞成活率显所以对卵造成的机械损伤极小，因此注射后的卵细胞成活率显著提高。著提高。第54页，此课件共158页哦 (2)(2)与传统的反转录病毒法相比，这种方法也有了明显改与传统的反转录病毒法相比，这种方法也有了明显改进：进：首先，选用受精前卵细胞作为外源基因的转入点，让首先，选用受精前卵细胞作为外源基因的转入点，让外源基外源基因比精子染色质先进入卵细胞因比精子染色质先进入卵细胞，这样，只要发生外源基因的整，这样，只要发生外源基因的整合，每一个细胞都会携带外源基因从而避免了嵌合体动物的产合，每一个细胞都会携带外源基因从而避免了嵌合体动物的

43、产生。生。第55页，此课件共158页哦 其次，由于在体外培养的卵细胞在其次，由于在体外培养的卵细胞在MM期包裹染色体的核膜期包裹染色体的核膜会暂时消失，因此在这个时候进行外源基因转入，可大大提会暂时消失，因此在这个时候进行外源基因转入，可大大提高外源基因进入核内与核染色体接触的机会。高外源基因进入核内与核染色体接触的机会。第三，受精前卵细胞比受精卵和早期胚胎更易转染反转第三，受精前卵细胞比受精卵和早期胚胎更易转染反转录病毒，因此可以提高外源基因的整合率。录病毒，因此可以提高外源基因的整合率。第56页，此课件共158页哦（七）其他方法（七）其他方法 除了以上方法之外，动物的转基因技术还有电除了以

44、上方法之外，动物的转基因技术还有电脉冲法、脉冲法、染色体片段注入法、磷酸钙共沉淀法、微弹轰击法、原染色体片段注入法、磷酸钙共沉淀法、微弹轰击法、原生质细胞介导的转基因技术、基因剔除和基因嵌入生质细胞介导的转基因技术、基因剔除和基因嵌入等。这等。这些方法大多具有一些特殊的优势。些方法大多具有一些特殊的优势。第57页，此课件共158页哦9 92 22 22 2转基因动物鉴定技术转基因动物鉴定技术 早期采用的、也是目前具有权威性的转基因动物鉴定早期采用的、也是目前具有权威性的转基因动物鉴定技术是技术是southern blottingsouthern blotting。具体步骤是：提取待检动物组织的

45、染色体具体步骤是：提取待检动物组织的染色体(一般选择导入一般选择导入基因中的单一限制酶位点基因中的单一限制酶位点)，消化后电泳，转膜后选择适当的，消化后电泳，转膜后选择适当的探针进行杂交，通过放射自显影获得结果。探针进行杂交，通过放射自显影获得结果。该方法的优点是结果可靠，但缺点是工作量大、操作该方法的优点是结果可靠，但缺点是工作量大、操作繁琐。繁琐。第58页，此课件共158页哦 另外一种比较常见的方法是另外一种比较常见的方法是斑点杂交；斑点杂交；主要步骤包括：主要步骤包括：动物动物DNADNA的提取、点于硝酸纤维素膜、探针杂交、放射的提取、点于硝酸纤维素膜、探针杂交、放射自自显影。显影。优点

46、优点：操作简便，操作简便，缺点缺点：当动物体内整合的外源基因与内源基因有同源时，当动物体内整合的外源基因与内源基因有同源时，往往出现假阳性。另外由于提取的染色体往往出现假阳性。另外由于提取的染色体DNADNA浓度较高，杂浓度较高，杂交效果往往不十分理想。因此这种方法用于转基因动物的交效果往往不十分理想。因此这种方法用于转基因动物的筛选并不多。筛选并不多。第59页，此课件共158页哦 聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)(PCR)技术技术在分子生物学领域中的应用在分子生物学领域中的应用使转基因动物的筛选工作大大简化。使转基因动物的筛选工作大大简化。只需设计一对特异性引物，以组织提取的只需设计一

47、对特异性引物，以组织提取的DNADNA为模板为模板进行进行PCRPCR扩增，通过对扩增产物进行序列分析就可以实现扩增，通过对扩增产物进行序列分析就可以实现转基因动物的鉴定。转基因动物的鉴定。缺点：缺点：有时也会存在假阳性，对筛选工作影响较大，必须加有时也会存在假阳性，对筛选工作影响较大，必须加以克服。以克服。第60页，此课件共158页哦 除了以上方法，近年来不断出现一些新技术。例如，可用除了以上方法，近年来不断出现一些新技术。例如，可用染色体原位杂交的方法染色体原位杂交的方法鉴定转基因猪，虽然操作比较繁鉴定转基因猪，虽然操作比较繁琐、但其独到之处是可确定出外源基因在染色体上的整琐、但其独到之处

48、是可确定出外源基因在染色体上的整合位点以及整合状态。合位点以及整合状态。第61页，此课件共158页哦 转基因动物技术是在转基因动物技术是在2020世纪世纪8080年代初发展起来的。从这项年代初发展起来的。从这项技术诞生的那天起，它就在技术诞生的那天起，它就在改良畜禽生产性状改良畜禽生产性状、提高畜禽抗病力提高畜禽抗病力以及利用转基因畜禽生产非常规畜牧产品以及利用转基因畜禽生产非常规畜牧产品(如人类药用蛋白如人类药用蛋白)等方面显示出了广阔的应用前景。等方面显示出了广阔的应用前景。9 9.2 2.2.2 转基因动物技术的意义与最新进展转基因动物技术的意义与最新进展第62页，此课件共158页哦 转

49、基因技术是将人工分离和修饰过的基因导入到生物转基因技术是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体性状的体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体性状的可遗传修饰。可遗传修饰。转基因动物就是基因组中含有外源基因的动物。通过转基因动物就是基因组中含有外源基因的动物。通过生长素基因、多产基因、高泌乳量基因、瘦肉型基因、角生长素基因、多产基因、高泌乳量基因、瘦肉型基因、角蛋白基因、抗寄生虫基因、抗病毒基因蛋白基因、抗寄生虫基因、抗病毒基因等基因转移，可能育等基因转移，可能育成成生长周期短生长周期短、产仔、生蛋多、泌乳量高或抗病性强的动、产仔、生蛋多、泌乳量高或抗病性

50、强的动物物 目前转基因技术已在牛、羊、猪、鸡、鱼等家养动物中取目前转基因技术已在牛、羊、猪、鸡、鱼等家养动物中取得一定成果得一定成果9 9.2 2.2.2 转基因动物技术的意义与最新进展转基因动物技术的意义与最新进展第63页，此课件共158页哦荧光鼠荧光鼠20072007年末，荧光鼠脑细胞的图片年末，荧光鼠脑细胞的图片传遍世界各地，从传遍世界各地，从“福利客福利客”超市的宣超市的宣传海报到传海报到“自然自然”杂志的封面。这些五彩杂志的封面。这些五彩斑斓的脑细胞是单个的神经元，鲜艳的色彩斑斓的脑细胞是单个的神经元，鲜艳的色彩帮助科学家将它们区分开来。英国帮助科学家将它们区分开来。英国哈佛大学哈佛