大学课件之食品微生物学第二章(7).ppt

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1、第三节 食品微生物生态学,食品生境 微生物生态生物化学和生理学(生长、不生长、死亡) 微生物相互影响 动态与静态相结合 传统方法与分子方法相结合 慢性病的肠源性学说,第四节食品微生物的检测与计数,微生物生态 微生物标准 微生物发酵 ,1. Sample collection and Processing,肉与肉制品样品的采集与制备 生肉及脏器检样：开腔后，用无菌刀取两腿内侧肌肉各50g；冷藏或销售的生肉，可取肥肉或其他部位的肌肉100g。检样放入无菌容器内，立即送检(3h)，送检时应冷藏，不加防腐剂。检样在化验室应立即检验或放置冰箱暂存。 禽类：鲜、冻家禽采取整只，放无菌容器内，处理要求同上。

2、 各类熟肉制品：熟禽采取整只，均放无菌容器内，立即送检，以下处理要求同上。,1. Sample collection and Processing,各类熟肉制品检样的处理 直接切取或称取25g，以下处理同生肉。 腊肠、香肠等生灌肠检样处理 先对生灌肠表面进行消毒，用灭菌剪子取内容物25g，以下处理同生肉。,外界环境污染,检验肉禽及其制品受外界环境污染的程度或检验其是否带有某种致病菌，应用棉拭采样法。 用板孔5cm2的金属板压在受检物上，将灭菌棉拭稍沾湿，在板孔内揩抹多次，然后将板移压另一点，如此共移压揩抹10次。每支棉拭在揩抹完毕后应立即剪断或烧断后投入盛有50mL灭菌水的容器中，立即送检。

3、检验时按要求作10倍递增稀释。 检验致病菌，不必用规板，在可疑部位用棉拭掐抹即可。,2. 微生物总数常用计数法,活性细胞的标准平板测定法(Standard Plate Count，SPC) 活性和非活性细胞的直接显微计数法（Direct Microscopic Counts，DMC) 染色还原技术估算具有还原能力的各种细胞的总数 最近似数测定法（Most Probable Number，MPN）,3. 微生物分析和相关技术,传统微生物检测技术 微量生化系统检测 物理方法测定 化学特征检测 与遗传物质相关的测定方法 免疫学技术,1) 传统微生物检测技术,分离纯化 菌落计数 显微镜直接计数 形态学

4、特征 生理生化反应特征,2) 微量生化系统检测,API系统：法国bioMrieux （生物梅里埃）公司生产，鉴定范围涵盖几乎所有的细菌群。 Enterotube系统：瑞士罗氏公司生产，有 15 种生化反应，专门鉴定肠道菌。 Biolog 系统：美国安普公司生产，可自动化鉴定，可鉴定 1140 种细菌。,API细菌数值鉴定系统,菌种,基本培养基 （液体）,菌悬液,检测、编码、查表、鉴定,适用于API鉴定细菌有700多种,50 CH,不同培养基分装不同小槽中，同步接种，培养后检测、查表、鉴定。,Enterotube 系统,Biolog全自动或手动细菌鉴定系统,在96孔的细菌培养板上检测微生物对不同

5、发酵性碳源利用情况进行的分类鉴定。,自动化、快速,可鉴定细菌有1140多种、酵母菌267种、目前已经可用于丝状真菌。,每个孔中含有不同的底物,菌悬液或无菌水,3) 物理方法测定,阻抗法 微热量法 流动细菌计数器法 放射测量法, 电阻抗法,微生物在培养过程中， 生理代谢作用使培养基中的电惰性物质(大分子物质) 转化为电活性物质(小分子物质)，使导电性增强，电阻抗降低。 电导率随时间的变化曲线与微生物生长曲线非常相似，原始菌数不同，出现指数增长期的时间也不同，建立二者间的关系，就能通过培养基电特性变化推出原始菌量。 用于快速检测食品(牛奶、牛肉等)、化妆品、药品等的细菌总数、大肠菌群、酵母菌、霉菌

6、、乳酸菌数和沙门氏菌。,直接阻抗法,直接阻抗法是将培养基装入特制的测量管，接种后在培养基中插入电极，直接测量培养基的电特性变化。 培养基的选择是决定检测成败的关键因素之一，它既要有利于被测菌的繁殖与分离, 又要在检测过程中产生显著的阻抗变化。,测定步骤,测试前先根据培养基和所测样品的种类设定M 值的阈值, 从测量开始到达到阈值所需的时间定义为检测时间(DT)。 1gCFU与DT呈线性关系，对每一种待测菌预先需测定CFU对DT 值的标准曲线，测定不同样品的DT值，对照标准曲线即可得到CFU的数值。 电阻抗法能检测出活菌量低于10cfu/mL的样品，其灵敏度受到温度、缓冲体系和电极材料的安放位置的

7、影响(测量管底部灵敏度顶部)。,间接阻抗检测法,某些特殊微生物的培养需要使用LiCl、KCl等高浓度盐。这使培养基本身带有很强的导电性，掩盖了微生物代谢产生的阻抗变化，因此不能用直接阻抗法分析。 间接阻抗检测法是通过检测微生物生长代谢产生的CO2 来反映微生物的代谢活性。 在阻抗测试管中加入KOH，接种后培养产生的CO2与KOH 反应生成碳酸盐，其导电性比原始溶液低，记录测试管中溶液的导电性变化即可得到微生物的信息。, 微量量热法,原理：在细菌生长的整个过程中总会有一定的热效应发生，用微量热量仪连续测定细菌生长过程的热量变化即可获得细菌生长的热谱图，由热谱图可以确定初始的菌液浓度。,细菌在22

8、下的产热曲线,细菌生长的产热曲线方程,除温度外，培养基、测定方法、起始菌液浓度等都对方程有影响, 流动型血球细胞计数法,当电流接通后，位于小孔(充满了具有电导性的液体)两侧的电极产生稳定的电流。当有一个细胞通过小孔时，小孔感应区内的电阻增加，瞬间电压变化产生一个脉冲信号。细胞体积越大，脉冲振幅越高。,流动型血球细胞计数法,原理：检测器根据细胞特性如荧光性、吸光性和光散射性进行计数，还可通过流动分类器进行分类。 蛋白染色：荧光性异硫氰酸盐 DNA染色：丙基碘化物 每个面包酵母中含4.610-14 g DNA、1.110-11 g 蛋白质 流动型血球细胞计数法与荧光标记的抗体联合 40min内就可

9、检测到牛乳和鸡蛋中的鼠伤寒沙门氏菌，灵敏度达103个/ml。 经6h的非选择性富集，牛乳中检测限度为10个/ml，鸡蛋中为1个/ml。,4) 化学特征检测, 热稳定性核酸酶 原理：绝大多数金葡球菌菌株，特别是肠毒素生产菌株可产凝固酶和热稳定性核酸酶。 实验证明，热稳定性核酸酶是金葡球菌生长的标志，凝固酶是产肠毒素菌株存在的标志。,热稳定性核酸酶法的优点,在细胞受热、化学因素和病原体等因素影响时，核酸酶仍然存在。 检测热稳定性核酸酶比检测肠毒素快 当有0.34单位的热稳定性核酸酶存在时，表明有某种葡萄球菌生长，当细胞数达到105-106时才能检测到核酸酶，而细胞数106时才能检测到肠毒素，即先产

10、核酸酶后产肠毒素。 检测时样品不用浓缩，而检测肠毒素需浓缩样品。, 荧光素酶测定法,生物发光 (Bioluminescence, BL),细胞内发光：如果细胞内同时含有荧光素和荧光素酶，则发光可在细胞内进行，此称细胞内发光；此类生物类群有细菌、单细胞动物、低等无脊椎动物、萤火虫和某些鱼类。 细胞外发光：如果细胞内仅含有荧光素或荧光素酶，则发光必须在分别含有荧光素和荧光素酶的不同发光细胞之分泌物相遇时才能产生，此称细胞外发光。此类生物类群有水母、介形类、高等无脊椎动物和某些鱼类(冷发光)。,荧光素酶测定法原理,原理：ATP普遍存在于一切活细胞中，荧光素酶在Mg2+存在的条件下，与还原荧光素和AT

11、P结合形成荧光素酶-荧光素-单磷酸腺苷的复合物，该复合物与氧结合时发出光。 在反应过程中，放出的总光量取决于荧光素酶、荧光素、氧和ATP的浓度，当所有其它反应物过量时，发出的总光量和最大光强度与ATP的量成正比。,荧光素酶测定法应用,此法是BL测定法中最敏感的方法， ATP方法在国外已用于肉制品、饮料和酒类中细菌的快速检测，已有多种检测仪器。目前多主张利用核苷酸激酶使ADP 转化为ATP，使检测灵敏度进一步提高。 存在问题 细菌数1104 cfu/ml 时，检测结果不准确 如何去除食品中非微生物产生的ATP 利用该技术快速检测微生物时，必须对非微生物ATP 进行有选择地萃取和水解，同时必须选择

12、合适的微生物ATP 萃取剂和萃取方法。, 荧光素酶发光基因(Lux),发光细菌：发光杆菌属、弧菌属和异短杆菌属。 发光细菌菌体中的发光物质受基因的控制，目前已从费氏弧菌、哈氏弧菌和明亮发光杆菌等多种发光细菌中克隆到Lux，通过转移这些基因可使其它微生物具有产生发光物质的能力。,Lux的应用,细菌主要的荧光素酶基因为luxA-E，将lux基因插入噬菌体内，构建重组噬菌体。当加入宿主细菌时，含有lux基因的噬菌体吸附、增殖，通过增加lux基因使宿主细胞发光。 检测沙门氏菌的含量只需1h，另外可检测肠细菌等G-，但G+产生的光比G-弱100倍，此法不适用。, 辐射测量法,原理：以14C标记培养基中的

13、可代谢物质为基础，微生物在利用这些物质时有14CO2释放，再利用放射能计数器检测。 检测能利用葡萄糖的微生物：14C-葡萄糖 检测不能利用葡萄糖的微生物： 14C-甲酸盐或14C-谷氨酸盐 适用于微生物含量高的食品检测，一般需5-6h；而微生物含量低则时间更长。, 荧光和发光法,原理：在食品微生物培养基中添加某种化合物，它们被微生物产生的酶分解或与菌体细胞结合，产生荧光基质或发光基质，这些物质的含量可在一定的波长下检测或使菌落显色。,5-Br-4-Cl-3-吲哚醛-葡萄糖醛酸(BCIG)可使大肠杆菌菌落成蓝色，而其它微生物不显蓝色。 氨肽酶使L-丙氨酸-p-硝基苯胺(LAPN) p-硝基苯胺，

14、在390nm检测此黄色物质的量。用于检测G-。 已知有97分离出的大肠杆菌产生葡萄糖苷酸酶，此酶能使葡萄糖苷酸-4-甲基伞形花烯(MUG)分解而生成荧光性甲基伞形花酮，可用作快速检测。,5) 与遗传物质相关的测定方法,GC mol% 同一种微生物，种内各菌株间的GC mol%可相差2.5-4.0%，大于5可认为是两个种，大于10可认为是不同的属。 基因探针 基因组探针、cDNA探针、寡核苷酸探针 PCR 基因芯片,6) 免疫学技术,凝集反应 沉淀反应 免疫电子显微技术 免疫磁珠 免疫标记技术,( )是产肠毒素金葡球菌菌株存在的标志。 A. 热稳定性核酸酶 B. 溶菌酶 C. DNA聚合酶 D. 凝固酶,D,荧光素酶测定法的反应过程中，放出的总光量与( )无关 A. 荧光素酶 B. 荧光素 C. 二氧化碳 D. ATP的浓度,C,作 业,低酸罐藏食品的杀菌条件为什么确定为121/ 2.52 min或杀菌效果相当的工艺条件？酸性罐头为什么不需要采用该工艺？ 芽孢具有哪些抗性？请说明芽孢耐热性的机制并讨论如何控制芽孢对食品腐败的影响。 菌膜、损伤细胞及微生物的VBNC状态分别有些什么特征？它们对食品加工有何不利的影响？ 上交时间：11月15日,