基因工程和蛋白质工程精选PPT.ppt

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1、关于基因工程和蛋白质工程第1页，讲稿共53张，创作于星期日第一节 生物工程概述一、生物工程概念及研究技术二、在现代工、农、医领域中的应用第2页，讲稿共53张，创作于星期日一、生物工程的概念及研究技术1.基因工程在分子水平的遗传操作技术2.细胞工程遗传遗传物物质质在在细细胞胞间间的的转转移移4.生化工程生物工程产品的最终取得手段3.酶酶工程工程酶的改造和设计第3页，讲稿共53张，创作于星期日基因工程是指在微观领域（分子水平）中，根据分子生物学和遗传学原理，设计并实施一项把一个生物体中有用的目的DNA(遗传信息)转入另一个生物体中，使后者获得新的需要的遗传性状或表达所需要的产物，最终实现该技术的商

2、业价值。基因工程基因工程与建筑工程基因工程与建筑工程第4页，讲稿共53张，创作于星期日基因工程基因工程操作水平：操作水平：DNA分子水平分子水平目的：定向改变遗传物质或获得基因产物。目的：定向改变遗传物质或获得基因产物。2、基因工程的理论基础、基因工程的理论基础1）物质基础）物质基础脱氧核苷酸脱氧核苷酸2）结构基础）结构基础规则的双螺旋结构规则的双螺旋结构3）中心法则，共用一套遗传密码）中心法则，共用一套遗传密码第5页，讲稿共53张，创作于星期日细胞工程细胞工程1、细胞工程的概念、细胞工程的概念利用细胞融合技术把含有不同遗传物质的细利用细胞融合技术把含有不同遗传物质的细胞合成杂种细胞。并使之分

3、裂生长成为杂种生物。胞合成杂种细胞。并使之分裂生长成为杂种生物。它包括体细胞融合、核移植、细胞器摄取和染它包括体细胞融合、核移植、细胞器摄取和染色体片段的重组等。色体片段的重组等。第6页，讲稿共53张，创作于星期日细胞工程细胞工程操作水平：细胞整体水平或细胞器水平操作水平：细胞整体水平或细胞器水平目的：定向改变遗传物质或获得细胞产品。目的：定向改变遗传物质或获得细胞产品。2、细胞工程的理论基础、细胞工程的理论基础细胞全能性细胞全能性依据依据生物体的每一个干细胞都包含有生物体的每一个干细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质。该物种所特有的全套遗传物质。第7页，讲稿共53张，创作于星期日异种异种植

4、物植物细胞细胞杂种细胞杂种细胞转基因植转基因植物物异种异种动物动物细胞细胞动物细动物细胞群胞群重组细胞重组细胞体细体细胞细胞细胞核胞核早期胚胎早期胚胎受精卵受精卵去核去核卵细卵细胞胞克隆动物克隆动物试管婴儿试管婴儿动物细动物细胞融合胞融合植物体细胞植物体细胞杂交杂交植物组植物组织培养织培养动物细动物细胞培养胞培养核移植核移植胚胎移植胚胎移植体外体外受精受精第8页，讲稿共53张，创作于星期日3、主要技术、主要技术植物组织培养植物组织培养植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物细胞培养动物细胞培养动物细胞融合动物细胞融合单克隆抗体技术单克隆抗体技术胚胎移植胚胎移植核移植核移植植物植物细胞细胞工程工程技术技

5、术动物动物细胞细胞工程工程技术技术第9页，讲稿共53张，创作于星期日酶工程酶工程酶工程是利用酶的特异催化功能，酶工程是利用酶的特异催化功能，在常温长压下将一种物质转化为另一在常温长压下将一种物质转化为另一种物质，以获得高纯度的适用之物。种物质，以获得高纯度的适用之物。该技术包括各种酶的开发和生产。该技术包括各种酶的开发和生产。酶的分离和纯化技术等。酶的分离和纯化技术等。酶工程用于食品工业很有效。酶工程用于食品工业很有效。啤酒、酱油、葡萄糖等都可用酶工啤酒、酱油、葡萄糖等都可用酶工程生产。程生产。第10页，讲稿共53张，创作于星期日二、生物工程在现代工、农、医领域中的应用1.1.化工及冶金工业化

6、工及冶金工业2.2.轻轻工和食品工工和食品工业业4.农业和畜牧业3.3.医医药药工工业业5.5.环环保和能源工保和能源工业业第11页，讲稿共53张，创作于星期日l 稀少珍贵的蛋白质药物1982年，美国食品与药物管理局批准了首例基因工程产品人胰岛素投放市场它标志了基因工程产品正式进入到商业化阶段。人生长激素、表皮生长因子、肿瘤坏死因子、a-干扰素、纤维素酶、抗血友病因子、红细胞生成素、尿激酶原、白细胞介素-2、集落刺激因子、乙肝疫苗等等第12页，讲稿共53张，创作于星期日l 畜牧业中的应用动物疫苗、生长激素等例：从转基因羊的羊奶中提取出治疗心脏病的药物tPA（组织溶解酶原激活剂）。第13页，讲稿

7、共53张，创作于星期日l 种植业中的应用用携带外源基因的农杆菌Ti质粒转化植物原生质体，使外源DNA与植物染色体DNA整合，通过原生质体的培养分化成愈伤组织，最后发育成具有新性状的完整植株转基因植物第14页，讲稿共53张，创作于星期日 基因工程包括DNA重组技术和其他使基因结构得以定向改造的技术。本节主要介绍DNA重组技术，大体上包括下列5个步骤。基因工程是1973年由美国斯坦福大学科恩和旧金山大学医学院的博耶创立的概念第二节 基因工程第15页，讲稿共53张，创作于星期日DNA重组的 技术路线Foreign DNA to be insertedPlansmid vectorJoiningRec

8、ombinant DNA molecule Introduction into host cells by transformation Host chromatemeSlection for cells coteining a recombinant DNA moleculeCloning+1、目的基因的制备、目的基因的制备2、载体载体的构建的构建3、目的基因与载体的重、目的基因与载体的重组组4、重组、重组 体体导入导入宿主细宿主细胞进行扩增胞进行扩增5、克隆基因的鉴定克隆基因的鉴定第16页，讲稿共53张，创作于星期日一、目的基因的获得二、基因载体三、重组DNA的筛选及表达第17页，讲稿共5

9、3张，创作于星期日一、目的基因的获得1.限制酶特异性切割DNA的手术刀2.取得目的基因的方法分离法及合成法第18页，讲稿共53张，创作于星期日1.限制性内切酶 DNA重组重组即是将两种DNA分子经过切割，选择适合的片段连接起来的过程 实现这一步，是在限制性内切酶发现以后才实现的 限制性内切酶：一类核酸内切酶，可以将外源DNA在特定位点切割降解 。以后从细菌中分别分离出了I型和型两类限制性内切酶。第19页，讲稿共53张，创作于星期日限制性内切酶的命名 用细菌同名的第一个字母（大写）和种名的前用细菌同名的第一个字母（大写）和种名的前两个字母（小写）构成酶的基本名称。若酶是从两个字母（小写）构成酶的

10、基本名称。若酶是从其中一种特殊菌株来，还在基本名称后加上菌株其中一种特殊菌株来，还在基本名称后加上菌株名称符号。名称后的罗马数字，表示在该特殊菌名称符号。名称后的罗马数字，表示在该特殊菌株中发现此酶的先后次序。如株中发现此酶的先后次序。如HaeIIHaeII是从是从（Haemophilus aegypticusHaemophilus aegypticus）中提取的，并且是从中中提取的，并且是从中发现的第二个酶发现的第二个酶。第20页，讲稿共53张，创作于星期日l限制性内切酶切割DNA的方式 a.从识别序列的中间切开从识别序列的中间切开b.b.在识别序列对称轴的左右两方进行切割在识别序列对称轴的

11、左右两方进行切割 c.c.在识别序列对称轴的右边（在识别序列对称轴的右边（5-35-3链）和对称轴左边链）和对称轴左边（3-53-5链）切开链）切开 第21页，讲稿共53张，创作于星期日a.从识别序列的中间切开 从识别序列的中间切开产生平齐末端（从识别序列的中间切开产生平齐末端（bluntends），如如HaeHae 第22页，讲稿共53张，创作于星期日b.在识别序列对称轴的左右两方进行切割 即分别在5-3链和3-5链对称轴的左右方切开，形成带有凸出的5磷酸基团的粘性末端（Cohesive ends），如如EcoREcoR 第23页，讲稿共53张，创作于星期日c.在识别序列对称轴的右边（5-3

12、链）和对称轴左边（3-5链）切开形成带有凸出的形成带有凸出的33羟基的粘性末端，如羟基的粘性末端，如pstIpstI第24页，讲稿共53张，创作于星期日2.取得目的基因的方法 分离法及合成法（1）DNA片段的直接提取（2）用噬菌体或质粒直接从宿主细胞中将目 的基因携出（3）使用相应的mRNA分离基因第25页，讲稿共53张，创作于星期日二、基因载体1.质粒染色体以外的遗传单元2.噬菌体感染细菌的病毒第26页，讲稿共53张，创作于星期日 质粒是一种环状双链的DNA分子。自身在细菌细胞中能不断复制繁殖。研究比较深入的质粒有大肠杆菌的性因子（F因子）、大肠杆菌素因子和抗药因子等 抗药因子（质粒）在其D

13、NA上编码有某些酶的基因，表达产生的酶对链霉素、氯霉素、磺胺、青霉素、四环素、卡那霉素等药物能产生生物化学修饰，使之钝化而失效1.质粒染色体以外的遗传单元第27页，讲稿共53张，创作于星期日质粒的作用 质粒DNA能从细菌中提出来，又能再转入细菌。这个过程称转化。转入的质粒DNA仍能进行复制，这种性能为DNA重组技术提供了重要的条件，即将一种外源基因与质粒重组后，再转入细菌中去复制繁殖，使外源基因得以增殖。质粒自身的某些抗药基因成为从转化的细菌中筛选它们的一种标记。除质粒外，噬菌体、病毒也能通过“感染”将外源基因带入细菌并进行复制。第28页，讲稿共53张，创作于星期日目前所使用的质粒 目前实验中

14、所使用的质粒、噬菌体和病毒载体种类很目前实验中所使用的质粒、噬菌体和病毒载体种类很多。但都是经过了人工改造，更适宜运用于多。但都是经过了人工改造，更适宜运用于DNADNA重组技重组技术。它们既保留了转化和感染活细胞的能力，又具有术。它们既保留了转化和感染活细胞的能力，又具有多处携带外源多处携带外源DNA的酶切位点，并含有特殊的筛选标记的酶切位点，并含有特殊的筛选标记 这些载体中有些只能复制扩增带入的外源基因；有些可这些载体中有些只能复制扩增带入的外源基因；有些可以使外源基因复制、转录和翻译出基因的蛋白质产物，这以使外源基因复制、转录和翻译出基因的蛋白质产物，这种载体称为表达载体种载体称为表达载

15、体第29页，讲稿共53张，创作于星期日pBR322质粒的结构质粒的结构第30页，讲稿共53张，创作于星期日 以噬菌体或病毒为载体，将所需基因或含有此基因的以噬菌体或病毒为载体，将所需基因或含有此基因的DNADNA片段转移给受体细胞的过程，称为转导。片段转移给受体细胞的过程，称为转导。我们常常采用我们常常采用噬菌体作为基因工程的载体，其一它噬菌体作为基因工程的载体，其一它的遗传结构与功能知道得比较清楚；其二是易于使细胞的遗传结构与功能知道得比较清楚；其二是易于使细胞感染，易于使外源感染，易于使外源DNADNA导入宿主细胞。2.噬菌体感染细菌的病毒第31页，讲稿共53张，创作于星期日以以以以 噬菌

16、体为载体进噬菌体为载体进噬菌体为载体进噬菌体为载体进行行行行DNADNA克隆克隆克隆克隆 DNA用限制性内切酶用限制性内切酶除去中间一段除去中间一段与外源与外源DNA连接连接重组载体的体外包装重组载体的体外包装带有外源带有外源DNA的的 噬菌噬菌体体太小不能被包装太小不能被包装头部前体头部前体多联体多联体DNAA蛋白蛋白COSCOSCOS成熟的颗粒成熟的颗粒在宿主细胞内进行在宿主细胞内进行DNA的装配过程的装配过程第32页，讲稿共53张，创作于星期日三、重组DNA的筛选及表达1.1.转化带有目的基因的载体进入受体细胞带有目的基因的载体进入受体细胞2.2.筛选筛选从大量受体从大量受体细细胞胞选选

17、出出带带有重有重组组体的体的细细胞胞3.3.表达表达外源DNADNA在受体在受体细细胞的胞的转录转录和翻和翻译译第33页，讲稿共53张，创作于星期日1.转化带有目的基因的载体进入受体细胞 由质粒作载体形成的克隆，转入细菌时细菌预先要在低温由质粒作载体形成的克隆，转入细菌时细菌预先要在低温条件下用氯化钙处理，形成条件下用氯化钙处理，形成“感受态感受态”细胞。即增加细胞膜细胞。即增加细胞膜的通透性才能实现转化。的通透性才能实现转化。由噬菌体作载体的克隆，转入细胞的过程称为由噬菌体作载体的克隆，转入细胞的过程称为“侵染侵染”。因噬菌体具有自动侵入的功能。细菌不用预先处理。因噬菌体具有自动侵入的功能。

18、细菌不用预先处理。第34页，讲稿共53张，创作于星期日 噬菌体感染大肠杆菌的途径噬菌体感染大肠杆菌的途径第35页，讲稿共53张，创作于星期日第36页，讲稿共53张，创作于星期日2.2.筛选从大量受体细胞选出带有重组体 的的细细胞胞（1 1）插入失活法）插入失活法（2 2）放射性探）放射性探针检测针检测法法（3 3）R-环检测环检测法法（4）免疫）免疫测测定法定法第37页，讲稿共53张，创作于星期日（1 1）插入失活法 在现在的基因工程操作中，所使用的载体通常在现在的基因工程操作中，所使用的载体通常是经过加工改造的衍生物，它们要么带有一个或是经过加工改造的衍生物，它们要么带有一个或几个可供选择的

19、遗传标记，要么具有被选择的遗几个可供选择的遗传标记，要么具有被选择的遗传功能，这就使带有目的基因与不带目的基因的传功能，这就使带有目的基因与不带目的基因的细菌有明显区别，便于筛选。细菌有明显区别，便于筛选。第38页，讲稿共53张，创作于星期日pBR322质粒结构质粒结构 如果外源如果外源DNA插插入，氨卞青霉素抗入，氨卞青霉素抗性基因失活性基因失活 如果外源如果外源DNA插入，插入，四环素抗性基因失活四环素抗性基因失活第39页，讲稿共53张，创作于星期日（2 2）放射性探）放射性探针检测针检测法法 利用mRNA可与相应的可与相应的DNADNA段落杂交，来检测有外源DNADNA插入的重组体，是一

20、种快速而灵敏的插入的重组体，是一种快速而灵敏的方法。方法。第40页，讲稿共53张，创作于星期日第41页，讲稿共53张，创作于星期日（3 3）R-R-环检测法 在有利于形成在有利于形成R-R-环的条件下，使待检测的纯化的环的条件下，使待检测的纯化的质粒质粒DNADNA，在含有mRNA的缓冲液中局部变性。如的缓冲液中局部变性。如若质粒若质粒DNADNA存在着与存在着与mRNAmRNA探针互补的序列，探针互补的序列，mRNA就会取代就会取代DNADNA中一条链，与另一条链形成双中一条链，与另一条链形成双链杂交分子，从而形成链杂交分子，从而形成R-环结构，在电子显微镜下环结构，在电子显微镜下观察，可直

21、接观察到观察，可直接观察到R-R-环。这样可检出重组体质粒DNA。第42页，讲稿共53张，创作于星期日（4）免疫）免疫测测定法定法免疫法测定只能是所转移外源免疫法测定只能是所转移外源DNADNA必须表达后才必须表达后才能进行，而且必须具备有效的特异性抗体。能进行，而且必须具备有效的特异性抗体。第43页，讲稿共53张，创作于星期日第44页，讲稿共53张，创作于星期日SouthernSouthern和和和和WesternWestern印迹法印迹法印迹法印迹法DNA frangmentElectrophoresisTransfer of DNA by blotting32P-labled DNA p

22、robeAutoradiographyAgarrose gelAutoradiogramNitrocellulose sheetAutoradiogramPolymer sheetSDS-Polyacrylamide gelTransfer proteinAdd radiolabled spesfic antibody,Wash to remove unboud antibodyProtein band detected by specific antibodyAutoradiography第45页，讲稿共53张，创作于星期日3.表达外源DNADNA在受体细胞中的转录和翻译在受体细胞中的转录和

23、翻译 带有目的基因的载体转移到受体细胞成功并筛选出来带有目的基因的载体转移到受体细胞成功并筛选出来后，最终目的是要目的基因在受体细胞中得以表达，产后，最终目的是要目的基因在受体细胞中得以表达，产生具有功能性的蛋白质或肽生具有功能性的蛋白质或肽。第46页，讲稿共53张，创作于星期日第三节第三节 蛋白质工程蛋白质工程一、一、蛋白质工程的概念蛋白质工程的概念蛋白质工程的概念蛋白质工程的概念二、二、二、二、蛋白质工程的一般技术蛋白质工程的一般技术蛋白质工程的一般技术蛋白质工程的一般技术三、三、三、三、蛋白质工程的应用蛋白质工程的应用第47页，讲稿共53张，创作于星期日一、蛋白质工程的概念 蛋白质工程蛋

24、白质工程蛋白质工程蛋白质工程(protein engineering)：通过改造与蛋通过改造与蛋白质相应的基因中的碱基顺序，或设计合成新的基因，白质相应的基因中的碱基顺序，或设计合成新的基因，将它克隆至受体细胞中，通过基因表达而获得具有新将它克隆至受体细胞中，通过基因表达而获得具有新的特性的蛋白质技术的特性的蛋白质技术1 1、基因定点突变、基因定点突变定做新蛋白质定做新蛋白质2 2、蛋白质设计、蛋白质设计对天然蛋白质的修饰对天然蛋白质的修饰第48页，讲稿共53张，创作于星期日蛋白质工程蛋白质工程 举例：举例：定点突变技术：定点突变技术：已知丝氨酸是由已知丝氨酸是由TCTTCT编码，只要把编码，

25、只要把C C改为改为GG，就变成半胱氨就变成半胱氨酸的密码酸的密码TGTTGT。于是用人工合成一段寡聚核苷酸引物，引物里于是用人工合成一段寡聚核苷酸引物，引物里含有含有TGTTGT外，其余均与基因部分互补。打开含有被突变蛋白外，其余均与基因部分互补。打开含有被突变蛋白质基因的质粒的双条链成单链模板，用引物与之互补链退火质基因的质粒的双条链成单链模板，用引物与之互补链退火（假如退火在适宜温度下进行，约（假如退火在适宜温度下进行，约1515个碱基中，有一个碱基个碱基中，有一个碱基错配是可以容忍的）。然后由错配是可以容忍的）。然后由DNADNA聚合酶延伸引物，由聚合酶延伸引物，由DNADNA连连接酶

26、将双链再连接成环，转入宿主细胞复制，即产生两种子代质接酶将双链再连接成环，转入宿主细胞复制，即产生两种子代质粒。一半的顺序中含有粒。一半的顺序中含有TCTTCT顺序，另一半含有顺序，另一半含有TGTTGT顺序。表达具顺序。表达具有有TGTTGT顺序的质粒，即可以产生在同一部位上半胱氨酸代替丝顺序的质粒，即可以产生在同一部位上半胱氨酸代替丝氨酸的蛋白质。氨酸的蛋白质。第49页，讲稿共53张，创作于星期日二、蛋白质工程的一般技术二、蛋白质工程的一般技术1 1、蛋白质工程的理论设计、蛋白质工程的理论设计蛋白质工程的前提蛋白质工程的前提2、点突变法基因修饰的方法（1 1）基因的全化学合成）基因的全化学

27、合成（2）基因直接修饰法（3 3）盒式突变技术）盒式突变技术第50页，讲稿共53张，创作于星期日三、蛋白质工程的应用三、蛋白质工程的应用1 1、蛋白质工程酶、蛋白质工程酶酶特性的改造酶特性的改造（1 1）改变酶的催化活性）改变酶的催化活性（2 2）改变酶的底物专一性）改变酶的底物专一性（3 3）提高酶的稳定性）提高酶的稳定性（4）酶的反应特性改变（5 5）产生新酶）产生新酶2 2、合理药物设计、合理药物设计蛋白质工程用于新药研制蛋白质工程用于新药研制 譬如：胰岛素原的人工合成第51页，讲稿共53张，创作于星期日胰岛素原的人工合成胰岛素原的人工合成胰脏胰脏(A)n胰岛素原胰岛素原mRNAcDNA重组质粒重组质粒转化细菌转化细菌mRNA反转录酶反转录酶胰岛素原基因胰岛素原基因与质粒连与质粒连接接感染感染E.coli胰岛素原胰岛素原第52页，讲稿共53张，创作于星期日感感谢谢大大家家观观看看第53页，讲稿共53张，创作于星期日