基因工程的操作步骤精选PPT.ppt

《基因工程的操作步骤精选PPT.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因工程的操作步骤精选PPT.ppt（46页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、关于基因工程的操作步骤第1页，讲稿共46张，创作于星期日基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1.目的基因的获取目的基因的获取2.基因表达载体的构建基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定第2页，讲稿共46张，创作于星期日第3页，讲稿共46张，创作于星期日知识点一：知识点一：1.1.原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子启动子：启动子：位于基因首端一段能与位于基因首端

2、一段能与RNARNA聚合酶结合并能起始聚合酶结合并能起始mRNAmRNA合成的序列。没有启动合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。子，基因就不能转录。终止子：终止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片断，它能阻碍片断，它能阻碍RNARNA聚合酶的移动，并使其从聚合酶的移动，并使其从DNADNA模板链上脱离下来，使转录终止。模板链上脱离下来，使转录终止。RNARNA聚合酶聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.(.(以模板转录然后脱落以模板转录然后脱落)第4页，讲稿共46张，创作于星期日不能转录为

3、信使不能转录为信使RNARNA，不能编码蛋白质。，不能编码蛋白质。能转录相应的信使能转录相应的信使RNARNA，能编码蛋白质，能编码蛋白质 编码区编码区非编码区非编码区原核细原核细胞的基胞的基因结构因结构有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNARNA聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 启动子启动子终止子终止子第5页，讲稿共46张，创作于星期日第6页，讲稿共46张，创作于星期日能够编码蛋白质的序列叫做外显子能

4、够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内不能够编码蛋白质的序列叫做内含子含子编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子：外显子：外显子：知识点一：知识点一：2.2.真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构第7页，讲稿共46张，创作于星期日真真核核细细胞胞的的 基基因因结结构构编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列有调控作用的核苷酸

5、序列，包括位于编码区上游的有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNARNA聚合聚合酶结合位点等。酶结合位点等。非编码序列：非编码序列：包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 第8页，讲稿共46张，创作于星期日原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具有和具有调控作用的调控作用的_区组成的

6、区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？与真核细胞基因结构一样长吗？连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码第9页，讲稿共46张，创作于星期日1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定知识点二知识点二.基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤第10页，讲稿共46张，创作于星期日第11页，讲稿共46

7、张，创作于星期日一、获取目的基因1.获取目的基因的途径获取目的基因的途径 A.A.从自然界已有的物种中分离从自然界已有的物种中分离 B.B.人工合成人工合成2.获取目的基因的方法获取目的基因的方法 A.A.从基因文库中获取从基因文库中获取 B.B.利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增 C.C.利用化学方法人工合成利用化学方法人工合成目的基因主要是目的基因主要是_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因第12页，讲稿共46张，创作于星期日一、目的基因的获取一、目的基因的获取（一）从基因文库中直接获取（一）从基因文库中直接获取1.1.基因文库：基因文库：概念见概念见P9P92.2.基因文库的分类基

8、因文库的分类:按外源按外源DNADNA片段的来源分类片段的来源分类种种类类基因组基因组DNA文库：文库：含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因部分基因文库：部分基因文库：只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分部分基因，基因，如：如：cDNA文库文库3.3.基因文库的目的基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。基因。4.4.获取目的基因的根据：获取目的基因的根据：见课本见课本P9第13页，讲稿共46张，创作于星期日提取某种生物的全部提取某种生物的全部DNADNA用适当的限制酶切用适当的限制酶切一定大小的一定大

9、小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与载体连接片段与载体连接导入受体菌中储存导入受体菌中储存基因组文库基因组文库5.5.基因文库的构建方法之一基因文库的构建方法之一（1 1）直接分离法）直接分离法(鸟枪法鸟枪法)第14页，讲稿共46张，创作于星期日cDNA合成过程 n第一步，反转录酶以第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与为模板合成一条与RNA互补的互补的DNA单链，形成单链，形成RNA-DNA杂交分子。杂交分子。n第二步，核酸酶第二步，核酸酶H使使RNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的RNA链降链降解，使之变成单链的解，使之变成单链的DNA。n第三步，以单链第三步，以单链DNA为模

10、板，在为模板，在DNA聚合酶的作用下合聚合酶的作用下合成另一条互补的成另一条互补的DNA链，形成双链链，形成双链DNA分子。分子。5.5.基因文库的构建方法之基因文库的构建方法之第15页，讲稿共46张，创作于星期日基因组文库和部分基因组文库基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库文库)比较比较第16页，讲稿共46张，创作于星期日 概念概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项在生物，是一项在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段原理：原理：DNADNA复制复制2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因第1

11、7页，讲稿共46张，创作于星期日四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸(dNTP)(dNTP)一对引物：一对引物：热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶）模板模板DNA(DNA(需含有目的基因需含有目的基因 )MgMg2+2+(激活剂激活剂)条件：条件：条件：条件：缓冲溶液缓冲溶液一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物前提：前提：前提：前提：第18页，讲稿共46张，创作于星期日利用PCR技术扩增目的基因原理原理:DNA双链复制双链复制前

12、提前提:要有一段已知目要有一段已知目的基因的脱氧核的基因的脱氧核苷酸序列，以便苷酸序列，以便合成引物。合成引物。第19页，讲稿共46张，创作于星期日 过程过程高温变性（高温变性（解旋为单链解旋为单链）低温退火（低温退火（引物与单链互补结合引物与单链互补结合）适温延伸适温延伸（在在TaqTaq酶的作用下合成酶的作用下合成 与模板互补的与模板互补的DNADNA双链双链）重复循环重复循环预变性（预变性（增加增加DNADNA变性的概率变性的概率）第20页，讲稿共46张，创作于星期日2 2、具体过程、具体过程第21页，讲稿共46张，创作于星期日PCR(多聚酶链式反应)第22页，讲稿共46张，创作于星期日

13、目的基因的目的基因的mRNA单链单链单链单链DNA DNA(cDNA(cDNA）双链双链DNA(即目的基因即目的基因即目的基因即目的基因)反转录反转录合成合成1）反转录法：）反转录法：以目的基因转录成的信使以目的基因转录成的信使RNARNA为模板，反转录成互补的单为模板，反转录成互补的单链链DNADNA，然后在酶的作用下合，然后在酶的作用下合成双链成双链DNADNA，从而获得所需的，从而获得所需的基因。基因。蛋白质蛋白质的氨基的氨基酸序列酸序列mRNAmRNA的核苷的核苷酸序列酸序列结构基因的结构基因的核苷酸序列核苷酸序列目的基因推测推测推测化学合化学合成成2）根据已知的氨基酸序列合成）根据已

14、知的氨基酸序列合成DNA法法：3 3、人工合成的目的基因、人工合成的目的基因第26页，讲稿共46张，创作于星期日二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建 基因工程的核心基因工程的核心1、目的：、目的：所需物质：所需物质：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。用。第27页，讲稿共46张，创作于星期日2 2、基因表达载体的组成：、基因表达载体的组成：复制原点复制原点+目的基因目的基因+启动子启动子+终止子终止子+标记基因标记基因第28页，讲稿共46张，创作于星期

15、日启动子：启动子：位于基因的首端的一段特殊的位于基因的首端的一段特殊的DNADNA片断，它是片断，它是RNARNA聚合酶识别和结合的部聚合酶识别和结合的部位，有了它才能位，有了它才能驱动基因转录出驱动基因转录出mRNAmRNA，最，最终获得蛋白质终获得蛋白质终止子：终止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片断，片断，能终止能终止mRNAmRNA的转录的转录标记基因标记基因的作用是的作用是为了为了鉴别鉴别受体细胞中受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来细胞筛选出来第29页，讲稿共46张，创作于星期日载体载体与

16、与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分点两部分DNADNA片段。表达载体在载体基础上增加了片段。表达载体在载体基础上增加了目的基目的基因、启动子、终止子因、启动子、终止子三部分结构三部分结构用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到既用到限制酶切割载体，又用到DNADNA连连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键二酯键启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以

17、表达载体的必需以表达载体的方式携带进去。方式携带进去。注意注意第30页，讲稿共46张，创作于星期日三、将目的基因导入受体细胞-植物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力第31页，讲稿共46张，创作于星期日将目的基因导入受体细胞-动物细胞n显微注射法显微注射法第32页，讲稿共46张，创作于星期日将目的基因导入受体细胞-微生物细胞nCa2+处理处理 使细胞处于一种能吸收周围环境中的使细胞处于一种能吸收周围环境中的DNA-感受态细胞感受态细胞第33页，讲稿共46张，创作于星期日四、目的基因的检测与鉴定n检测检测:

18、n是否插入目的基因是否插入目的基因（DNA分子杂交技术分子杂交技术）n是否转录是否转录（mRNA分子杂交技术分子杂交技术）n是否翻译是否翻译（抗原抗原抗体杂交技术抗体杂交技术）n鉴定鉴定:n功能活性鉴定功能活性鉴定n抗性鉴定抗性鉴定分别提取什么进行检测归纳步骤第34页，讲稿共46张，创作于星期日DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分子的分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链那么，互补的碱基序列就会结合在

19、一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。链。第35页，讲稿共46张，创作于星期日归纳:基因工程的基本操作程序1.1.获取目的基因获取目的基因u从基因文库从基因文库u利用利用PCRPCRu化学方法人工合成化学方法人工合成2.2.构建基因表达载体构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u农杆菌转化法、显微注射法农杆菌转化法、显微注射法4.4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译第36页，讲稿共46张，创作于星期日第37页，讲稿共46张，创作于星期日基因操作的基本步骤第38页，讲稿共46张，创作于星期日基因操作的基本步骤第39页，讲稿共46张，创作于星期日感感谢谢大大家家观观看看第46页，讲稿共46张，创作于星期日