基因结构与功能分析精选PPT.ppt

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1、目录目录关于基因结构与功能分析第1页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录第二十二章第二十二章 基因结构与功能分析技术基因结构与功能分析技术 The Analysis Technology for Gene Structure and Function第2页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录人类的多种疾病都与基因的结构或功能异常有人类的多种疾病都与基因的结构或功能异常有关，因此，要阐明疾病发生的分子机制和进行关，因此，要阐明疾病发生的分子机制和进行有效的诊断与防治，均需首先揭示基因的结构有效的诊断与防治，均需首先揭示基因的结构与功能。与功能。DNADNA序列测定序列测定基因转录起点及其启动子的

2、分析基因转录起点及其启动子的分析基因编码序列的分析基因编码序列的分析基因拷贝数及其表达产物的分析基因拷贝数及其表达产物的分析基因功能获得和基因功能获得和/或缺失策略或缺失策略随机突变筛选策略随机突变筛选策略第3页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录第一节第一节 基因结构分析技术基因结构分析技术 第4页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录一、基因一级结构解析技术一、基因一级结构解析技术 基因的一级结构是指脱氧核苷酸的排列顺序，基因的一级结构是指脱氧核苷酸的排列顺序，解析一级结构最精确的技术就是解析一级结构最精确的技术就是DNA测序（测序（DNA sequencing）。）。第5页，讲稿共48张，

3、创作于星期日目录目录（一）双脱氧法和化学降解法是两种常规的（一）双脱氧法和化学降解法是两种常规的DNA测测序方法序方法 Sanger双脱氧测序（双脱氧测序（dideoxy sequencing）法）法 第6页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录Maxam-Gilbert化学降解测序法化学降解测序法 第7页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录（二）全自动激光荧光（二）全自动激光荧光DNA测序技术的原理基于测序技术的原理基于Sanger双脱氧法双脱氧法 1.四色荧光法：四色荧光法：采采用用四四种种不不同同的的荧荧光光染染料料标标记记同同一一引引物物或或4种种不不同同的的终终止止底底物物ddNTP，

4、最最终终结结果果均均相相当当于于赋赋予予DNA片片段段4种种不不同同的的颜颜色色。因因此，一个样品的此，一个样品的4个反应产物可在同一个泳道内电泳。个反应产物可在同一个泳道内电泳。2.单色荧光法：单色荧光法：采采用用单单一一荧荧光光染染料料标标记记引引物物5-端端或或dNTP，所所有有产产物物的的5-末末端端均均带带上上了了同同一一种种荧荧光光标标记记，一一个个样样品品的的四四个个反反应应必必须须分分别别进行，相应产物也必须在四个不同的泳道内电泳进行，相应产物也必须在四个不同的泳道内电泳第8页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录（三）焦磷酸测序是一种基于发光法测定焦磷酸（三）焦磷酸测序是一种基

5、于发光法测定焦磷酸的测序技术的测序技术 焦焦磷磷酸酸测测序序技技术术操操作作简简单单，结结果果准准确确可可靠靠，可可应应用用于于单单核核苷苷酸酸多多态态性性位位点点（SNP）分分析析、等等位位基基因因频频率率测测定定、细细菌菌和和病病毒毒等等微微生生物物的的分分型型鉴鉴定定、CpG甲甲基基化化分分析析、扫扫描描与与疾疾病病相相关关基基因因序序列列中中的的突突变变点点等等领领域域。该该方方法法的的测测序序长长度一般短于度一般短于Sanger法。法。第9页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录（四）循环芯片测序被称为第二代测序技术（四）循环芯片测序被称为第二代测序技术 循环芯片测序（循环芯片测序（c

6、yclic-array sequencing）可实现大规模并行化分析可实现大规模并行化分析 不需电泳，设备易于微型化不需电泳，设备易于微型化 样本和试剂的消耗量降低，降低了测序成本样本和试剂的消耗量降低，降低了测序成本 优势：优势：技术平台：技术平台：454测序、测序、Solexa测序（测序（Illumina测序）、测序）、SOLiD测测序等。序等。第10页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录基本流程：基本流程：将基因组将基因组DNA随机切割成为小片段随机切割成为小片段DNA；在所获小片段在所获小片段DNA分子的末端连上接头，然后变分子的末端连上接头，然后变性得到单链模板文库；性得到单链模板文

7、库；将带接头的单链小片段将带接头的单链小片段DNA文库固定于固体表面；文库固定于固体表面；对固定片段进行克隆扩增，从而制成对固定片段进行克隆扩增，从而制成polony芯片。芯片。针对芯片上的针对芯片上的DNA，利用聚合酶或连接酶进行一，利用聚合酶或连接酶进行一系列循环反应，通过读取碱基连接到系列循环反应，通过读取碱基连接到DNA链过程链过程中释放出的光学信号而间接确定碱基序列。中释放出的光学信号而间接确定碱基序列。第11页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录（五）单分子测序技术被称为第三代测序技术（五）单分子测序技术被称为第三代测序技术 主要策略：主要策略：通过掺入并检测荧光标记的核苷酸，来实

8、现单分子测序，通过掺入并检测荧光标记的核苷酸，来实现单分子测序，如单分子实时技术（如单分子实时技术（single molecule real time technology，SMRT）；）；利用利用DNA聚合酶在聚合酶在DNA合成时的天然化学方式来实现合成时的天然化学方式来实现单分子测序；单分子测序；直接读取单分子直接读取单分子DNA序列信息。序列信息。第12页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录二、基因转录起点分析技术二、基因转录起点分析技术 转录起点（转录起点（transcription start site，TSS）（一）用（一）用cDNA克隆直接测序法鉴定克隆直接测序法鉴定TSS 以以

9、mRNA为模板，经逆转录合成为模板，经逆转录合成cDNA第一链，同时利用第一链，同时利用逆转录酶的末端转移酶活性，在逆转录酶的末端转移酶活性，在cDNA第一链的末端加上第一链的末端加上polyC尾，并以此引导合成尾，并以此引导合成cDNA第二链。将双链第二链。将双链cDNA克隆于适宜载克隆于适宜载体，通过对克隆体，通过对克隆cDNA的的5-末端进行测序分析即可确定基因的末端进行测序分析即可确定基因的TSS序列。序列。该方法比较简单，尤其适于对特定基因该方法比较简单，尤其适于对特定基因TSS的分析。的分析。但可导致但可导致5-末端部分缺失，从而影响对末端部分缺失，从而影响对TSS的序列测定。的序

10、列测定。第13页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录（二）用（二）用5-cDNA末端快速扩增技术鉴定末端快速扩增技术鉴定TSS 常用的技术包括常用的技术包括5-末端基因表达系列分析（末端基因表达系列分析（5-end serial analysis of gene expression，5-SAGE）和帽分析基因表达（）和帽分析基因表达（cap analysis gene expression，CAGE）技术。）技术。第14页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录（三）用数据库搜索（三）用数据库搜索TSS 利用对寡核苷酸帽法构建的全长利用对寡核苷酸帽法构建的全长cDNA文库文库5-末端测序所得的数

11、据信息建立了一个末端测序所得的数据信息建立了一个TSS数据库数据库（database of transcription start sites，DBTSS），），并在此基础上，通过将寡核苷酸帽法和大量平行测并在此基础上，通过将寡核苷酸帽法和大量平行测序技术相结合开发了一种序技术相结合开发了一种TSS测序法，从而实现了测序法，从而实现了一次测试可产生一次测试可产生1107 个个TSS的数据。的数据。第15页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录三、基因启动子结构分析技术三、基因启动子结构分析技术（一）用（一）用PCR结合测序技术分析启动子结构结合测序技术分析启动子结构 该方法最为简单和直接，即根据

12、基因的启动子序列，该方法最为简单和直接，即根据基因的启动子序列，设计一对引物，然后以设计一对引物，然后以PCR法扩增启动子，经测序分析法扩增启动子，经测序分析启动子序列结构。启动子序列结构。第16页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录（二）用核酸（二）用核酸-蛋白质相互作用技术分析启动子蛋白质相互作用技术分析启动子结构结构 1.用足迹法分析启动子中潜在的调节蛋白结合位点用足迹法分析启动子中潜在的调节蛋白结合位点 足迹法（足迹法（footprinting）是利用）是利用DNA电泳条带连续电泳条带连续性中断的图谱特点判断与蛋白质结合的性中断的图谱特点判断与蛋白质结合的DNA区域，它区域，它是研究核

13、酸是研究核酸-蛋白质相互作用的方法，而不是专门用于研蛋白质相互作用的方法，而不是专门用于研究启动子结构的方法。究启动子结构的方法。分类：分类：酶足迹法酶足迹法化学足迹法化学足迹法 第17页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录（1）用核酸酶进行足迹分析）用核酸酶进行足迹分析 酶酶足足迹迹法法（enzymatic footprinting）是是利利用用DNA酶酶处处理理DNA-蛋蛋白白质质复复合合物物，然然后后通通过过电电泳泳分分析析蛋蛋白白质质结结合序列。合序列。常常 用用 的的 酶酶 有有 DNA酶酶I（DNase I）和核酸外切酶）和核酸外切酶III。第18页，讲稿共48张，创作于星期日目录

14、目录（2）用化学试剂进行足迹分析）用化学试剂进行足迹分析 化化学学足足迹迹法法（chemical footprinting）是是利利用用能能切切断断DNA骨骨架架的的化化学学试试剂剂处处理理DNA-蛋蛋白白质质复复合合物物，由由于于化化学学试试剂剂无无法法接接近近结结合合了了蛋蛋白白质质的的DNA区区域域，因因此此在在电电泳泳上上形形成成空空白白区区域域的的位位置置就就是是DNA结结合合蛋蛋白白的的结结合合位位点点。最最常常用用的的化化学学足足迹迹法法是是羟羟自自由由基基足足迹迹法（法（hydroxyl radical footprinting）。）。第19页，讲稿共48张，创作于星期日目录目

15、录2.用电泳迁移率变动分析和染色质免疫沉淀技术鉴定启用电泳迁移率变动分析和染色质免疫沉淀技术鉴定启动子动子 电电泳泳迁迁移移率率变变动动分分析析（EMSA）和和染染色色质质免免疫疫沉沉淀淀（ChIP）只只能能确确定定DNA序序列列中中含含有有核核蛋蛋白白结结合合位位点点，故故尚尚需需结结合合DNA足足迹迹实实验验和和DNA测测序序等等技技术术来来确确定具体结合序列。定具体结合序列。第20页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录（三）用生物信息学预测启动子（三）用生物信息学预测启动子 1.用启动子数据库和启动子预测算法定义启动子用启动子数据库和启动子预测算法定义启动子 在在定定义义启启动动子子或或

16、预预测测分分析析启启动动子子结结构构时时应应包包括括启启动动子区域的子区域的3个部分个部分 核心启动子（核心启动子（core promoter）；）；近近端端启启动动子子（proximal promoter）：含含有有几几个个调调控控元元件的区域，其范围一般涉及件的区域，其范围一般涉及TSS上游几百个碱基；上游几百个碱基；远远端端启启动动子子（distal promoter）：范范围围涉涉及及TSS上上游几千个碱基，含有增强子和沉默子等元件。游几千个碱基，含有增强子和沉默子等元件。第21页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录2.预测启动子的其他结构特征预测启动子的其他结构特征 启启动动子子区区

17、域域的的其其他他结结构构特特征征包包括括GC含含量量、CpG比比率率、转录因子结合位点、碱基组成及核心启动子元件等。转录因子结合位点、碱基组成及核心启动子元件等。用用于于启启动动子子预预测测的的数数据据库库：EPD（eukaryotic promoter databases）数数据据库库，主主要要预预测测真真核核RNA聚聚合合酶酶型型启启动动子子，数数据据库库中中的的所所有有启启动动子子数数据据信信息息都都经经过过实实验验证证实实；TRRD（transcription regulatory region databases）是是一一个个转转录录调调控区数据库，数据来源于已发表的科学论文。控区数

18、据库，数据来源于已发表的科学论文。第22页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录四、基因编码序列分析技术四、基因编码序列分析技术（一）用（一）用cDNA文库法分析基因编码序列文库法分析基因编码序列 cDNA克克隆隆测测序序或或构构建建cDNA文文库库是是最最早早分分析析基基因因编编码码序序列列的的方方法法。全全长长cDNA文文库库可可以以通通过过mRNA的的结结构构特特征征进进行行判判断断，mRNA的的序序列列基基本本都都由由3部部分分组组成成，即即5-UTR、编编码码序序列列和和3-UTR。cDNA末末端端快快速速扩扩增增（RACE）技技术术是是高高效效钓钓取取未未知知基基因因编码序列的一种方

19、法。编码序列的一种方法。核核酸酸杂杂交交法法可可从从cDNA文文库库中中获获得得特特定定基基因因编编码码序序列列的的cDNA克隆。克隆。第23页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录（二）用（二）用RNA剪接分析法确定基因编码序列剪接分析法确定基因编码序列 高通量分析高通量分析RNA剪接的方法：剪接的方法：基于基于DNA芯片的分析法芯片的分析法 交联免疫沉淀法交联免疫沉淀法 体外报告基因测定法体外报告基因测定法选选择择性性剪剪接接的的转转录录产产物物可可以以通通过过基基因因表表达达序序列列标标签签（expression sequence tag,EST）的的比比较较进进行行鉴鉴定定，但但这这种种

20、方方法法需需进进行行大大量量的的EST序序列列测测定定；同同时时由由于于大大多多数数EST文文库库来来源源于于非非常常有有限限的的组组织织，故故组组织织特特异性剪接变异体也很可能丢失。异性剪接变异体也很可能丢失。第24页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录（三）用数据库分析基因编码序列（三）用数据库分析基因编码序列在在基基因因数数据据库库中中，对对各各种种方方法法所所获获得得的的cDNA片片段段的的序序列列进进行行同同源源性性比比对对，通通过过染染色色体体定定位位分分析析、内内含含子子外外显显子子分分析析、ORF分分析析及及表表达达谱谱分分析析等等，可可以以初初步步明明确确基基因因的的编编码码

21、序序列列，并并可可对对其其编码产物的基本性质进行分析。编码产物的基本性质进行分析。利利用用有有限限的的序序列列信信息息即即可可通通过过同同源源性性搜搜索索获获得得全全长长基基因因序序列列，然然后后，利利用用NCBI的的ORF Finder软软件件或或EMBOSS中中的的getorf软软件件进进行行ORF分分析析，并并根根据据编编码码序序列列和和非非编编码码序序列列的的结结构构特特点点，便可确定基因的编码序列。便可确定基因的编码序列。第25页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录五、基因拷贝数分析技术五、基因拷贝数分析技术 分分析析某某种种基基因因的的种种类类及及拷拷贝贝数数，实实质质上上就就是是

22、对对基基因因进进行行定定性性和和定定量量分分析析，常常用用的的技技术术包包括括DNA印印迹迹（Southern印迹）、实时定量印迹）、实时定量PCR技术等。技术等。DNA印印迹迹是是根根据据探探针针信信号号出出现现的的位位置置和和次次数数判判断基因的拷贝数断基因的拷贝数 实实时时定定量量PCR是是通通过过被被扩扩增增基基因因在在数数量量上上的的差差异推测模板基因拷贝数的异同异推测模板基因拷贝数的异同DNA测序是最精确的鉴定基因拷贝数的方法测序是最精确的鉴定基因拷贝数的方法第26页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录第二节第二节 基因表达产物分析技术基因表达产物分析技术 第27页，讲稿共48张，

23、创作于星期日目录目录一、通过检测一、通过检测RNA而在转录水平分析而在转录水平分析基因表达基因表达 根根据据分分析析方方法法的的原原理理和和功功能能特特性性，可可将将基基因因转转录录水水平分析分为封闭和开放性系统研究方法。平分析分为封闭和开放性系统研究方法。封封闭闭性性系系统统研研究究方方法法（如如DNA芯芯片片、RNA印印迹迹、实实时时RT-PCR等等）的的应应用用范范围围仅仅限限于于已已知知基基因因。开开放放性性系系统统研研究究方方法法（如如差差异异显显示示PCR、双双向向基基因因表表达达指指纹纹图图谱谱、分分子子索索引引法法、随随机机引引物物PCR指指纹纹分分析析等等）可可用用于发现和分

24、析未知基因。于发现和分析未知基因。第28页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录（一）用核酸杂交法检测（一）用核酸杂交法检测RNA表达水平表达水平 1.用用RNA印迹分析印迹分析RNA表达表达 RNA印印迹迹被被广广泛泛应应用用于于RNA表表达达分分析析，并并作作为为鉴定鉴定RNA转录本、分析其大小的标准方法。转录本、分析其大小的标准方法。2.用核糖核酸酶保护实验分析用核糖核酸酶保护实验分析RNA水平及其剪接情况水平及其剪接情况 RNA酶酶保保护护实实验验（ribonuclease protection assay，RPA）是是一一种种基基于于杂杂交交原原理理分分析析RNA的的方方法法，既既可可

25、进进行定量分析，又可研究其结构特征。行定量分析，又可研究其结构特征。第29页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录第30页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录3.用原位杂交进行用原位杂交进行RNA区域定位区域定位 原原位位杂杂交交（ISH）是是通通过过设设计计与与目目标标RNA碱碱基基序序列列互互补补的的寡寡核核苷苷酸酸探探针针，利利用用杂杂交交原原理理在在组组织织原原位位检检测测RNA的的技技术术，其其可可对对细细胞胞或或组组织织中中原原位位表表达达的的RNA进进行行区区域域定定位位，同同时时也也可可作作为为定定量量分分析析的的补补充。充。第31页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录（二）用（

26、二）用PCR技术检测技术检测RNA表达水平表达水平 1.用逆转录用逆转录PCR进行进行RNA的半定量分析的半定量分析 逆逆转转录录PCR（RT-PCR）一一般般用用于于RNA的的定定性性分分析析；如如果果设设置置阳阳性性参参照照，则则可可对对待待测测RNA样样品进行半定量分析。品进行半定量分析。2.用实时定量用实时定量PCR进行进行RNA的定量分析的定量分析 实实时时定定量量PCR是是定定量量分分析析RNA的的最最通通用用、最最快快速速、最最简简便便的的方方法法，该该方方法法是是对对PCR反反应应进进行行实实时时监测，具有很高的灵敏度和特异性。监测，具有很高的灵敏度和特异性。第32页，讲稿共4

27、8张，创作于星期日目录目录（三）用基因芯片和高通量测序技术分析（三）用基因芯片和高通量测序技术分析RNA表表达水平达水平 1.基因芯片已成为基因表达谱分析的常用方法基因芯片已成为基因表达谱分析的常用方法 基基因因芯芯片片主主要要采采用用cDNA芯芯片片，其其便便于于对对不不同同状状态态下下的的基基因因表表达达谱谱进进行行比比较较，揭揭示示转转录录组组差差异异表表达达的的规规律律，对对探探索索发发病机制、评价治疗效果、筛选药物靶标具有重要意义。病机制、评价治疗效果、筛选药物靶标具有重要意义。2.用循环芯片测序技术分析基因表达谱用循环芯片测序技术分析基因表达谱 运运用用循循环环芯芯片片测测序序技技

28、术术，可可对对基基因因表表达达谱谱进进行行高高通通量量分分析析，一一次次可可完完成成几几十十万万到到几几百百万万个个DNA分分子子片片段段的的序序列列测测定定，从而快速获得转录组或基因组的全貌。从而快速获得转录组或基因组的全貌。第33页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录二、通过检测蛋白质二、通过检测蛋白质/多肽而在翻译水平分多肽而在翻译水平分析基因表达析基因表达（一）用蛋白质印迹技术检测蛋白质（一）用蛋白质印迹技术检测蛋白质/多肽多肽（二）用酶联免疫吸附实验分析蛋白质（二）用酶联免疫吸附实验分析蛋白质/多肽多肽 酶酶联联免免疫疫吸吸附附实实验验（ELISA）也也是是一一种种建建立立在在抗抗原

29、原-抗抗体体反反应应基基础础上上的的蛋蛋白白质质/多多肽肽分分析析方方法法，其其主主要要用于测定可溶性抗原或抗体，用于测定可溶性抗原或抗体，第34页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录（三）用免疫组化实验原位检测组织（三）用免疫组化实验原位检测组织/细胞表达的蛋细胞表达的蛋白质白质/多肽多肽 免免疫疫组组化化实实验验包包括括免免疫疫组组织织化化学学和和免免疫疫细细胞胞化化学学实实验验，二二者者原原理理相相同同，都都是是用用标标记记的的抗抗体体在在组组织织/细细胞胞原原位位对对目目标标抗抗原原（目目标蛋白质标蛋白质/多肽）进行定性、定量、定位检测。多肽）进行定性、定量、定位检测。（四）用流式细胞

30、术分析表达特异蛋白质的阳性细胞（四）用流式细胞术分析表达特异蛋白质的阳性细胞 流流式式细细胞胞术术（flow cytometry）通通常常利利用用荧荧光光标标记记抗抗体体与与抗抗原原的的特特异异性性结结合合，经经流流式式细细胞胞仪仪分分析析荧荧光光信信号号，根根据据细细胞胞表表达特定蛋白质的水平对某种蛋白质阳性细胞做出判断。达特定蛋白质的水平对某种蛋白质阳性细胞做出判断。第35页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录（五）用蛋白质芯片和双向电泳高通量分析蛋白（五）用蛋白质芯片和双向电泳高通量分析蛋白质质/多肽表达水平多肽表达水平 1.用蛋白质芯片分析蛋白质用蛋白质芯片分析蛋白质/多肽的表达谱多肽

31、的表达谱 根根据据制制作作方方法法和和用用途途不不同同，可可将将其其分分为为蛋蛋白白质质检检测测和和功功能能芯芯片片两两大大类类。蛋蛋白白质质检检测测芯芯片片包包括括抗抗体体芯芯片片、抗抗原原芯芯片片、配配体体芯芯片片等等，它它是是将将具具有有高高亲亲和和力力的的特特异异性性探探针针分分子子固固定定在在基基片片上上，用用以以识识别别生生物物样样品品溶溶液液中中的的目目标标多多肽肽；蛋蛋白白质质功功能能芯芯片片可可用用来来研研究究蛋蛋白白质质修修饰饰、蛋蛋白白质质-蛋蛋白白质质蛋蛋白白质质-DNA蛋蛋白白质质-RNA，以以及及蛋蛋白白质质与与脂脂质质、蛋蛋白质与药物、酶与底物、蛋白质白质与药物、

32、酶与底物、蛋白质-小分子等的相互作用。小分子等的相互作用。第36页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录蛋白质芯片可用于检测组织蛋白质芯片可用于检测组织细胞来源的样品中蛋细胞来源的样品中蛋白质的表达谱；其精确程度、信息范畴取决于芯片上已白质的表达谱；其精确程度、信息范畴取决于芯片上已知多肽的信息多寡。知多肽的信息多寡。2.用双向电泳分析蛋白质用双向电泳分析蛋白质/多肽表达谱多肽表达谱 双向电泳可同时分离成百上千的蛋白质，对双向电泳可同时分离成百上千的蛋白质，对差异表达的蛋白质进行鉴定。差异表达的蛋白质进行鉴定。第37页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录第三节第三节 基因的生物学功能鉴定技术基因

33、的生物学功能鉴定技术第38页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录一、用功能获得策略鉴定基因功能一、用功能获得策略鉴定基因功能 基因功能获得策略的本质是将目的基因直接基因功能获得策略的本质是将目的基因直接导入某一细胞或个体中，使其获得新的或更高水导入某一细胞或个体中，使其获得新的或更高水平的表达，通过细胞或个体生物性状的变化来研平的表达，通过细胞或个体生物性状的变化来研究基因功能。究基因功能。方法：方法：转基因技术转基因技术基因敲入技术基因敲入技术 第39页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录（一）用转基因技术获得基因功能（一）用转基因技术获得基因功能 转基因技术（转基因技术（transgeni

34、c technology）是指将外源基因导入受精卵）是指将外源基因导入受精卵或胚胎干细胞（或胚胎干细胞（embryonic stem cell），即），即ES细胞，通过随机重组使外源细胞，通过随机重组使外源基因插入细胞染色体基因插入细胞染色体DNA，随后将受精卵或，随后将受精卵或ES细胞植入假孕受体动物的子细胞植入假孕受体动物的子宫，使得外源基因能够随细胞分裂遗传给后代。宫，使得外源基因能够随细胞分裂遗传给后代。转基因动物（转基因动物（transgenic animal）是指应用转基因技术培育出）是指应用转基因技术培育出的携带外源基因，并能稳定遗传的动物，其制备步骤主要包括的携带外源基因，并能

35、稳定遗传的动物，其制备步骤主要包括转基因表达载体的构建、外源基因的导入和鉴定、转基因动物转基因表达载体的构建、外源基因的导入和鉴定、转基因动物的获得和鉴定、转基因动物品系的繁育等。的获得和鉴定、转基因动物品系的繁育等。转基因小鼠最为常见。转基因小鼠最为常见。第40页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录第41页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录（二）用基因敲入技术获得基因的功能（二）用基因敲入技术获得基因的功能 基因敲入基因敲入（gene knock-in）是通过同源重组的方）是通过同源重组的方法，用某一基因替换另一基因，或将一个设计好的基法，用某一基因替换另一基因，或将一个设计好的基因片段插

36、入到基因组的特定位点，使之表达并发挥作因片段插入到基因组的特定位点，使之表达并发挥作用。用。通过基因敲入可以研究特定基因在体内的功能；通过基因敲入可以研究特定基因在体内的功能；也可以与之前的基因的功能进行比较；或将正常基也可以与之前的基因的功能进行比较；或将正常基因引入基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗因引入基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。的目的。第42页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录基基因因敲敲入入是是基基因因打打靶靶（gene targeting）技技术术的的一一种种。基基因因打打靶靶是是一一种种按按预预期期方方式式准准确确改改造造生生物物遗遗传传信信息息的的实实验

37、验手手段段。除除基基因因敲敲入入外外，基基因因打打靶靶还还包包括括基基因因敲除、点突变、缺失突变、染色体大片段删除敲除、点突变、缺失突变、染色体大片段删除等。等。基基因因打打靶靶与与转转基基因因技技术术均均可可用用于于基基因因功功能能研研究究，但但二二者者的的最最大大区区别别就就是是基基因因打打靶靶能能去去除除和和/或或替替换换生生物物体体内内的的固固有有基基因因，而而转转基基因因技技术术则则未未去去除除或或替替换换固固有有基基因因。目目前前，基基因因打打靶靶已已成成为为研研究究基基因因功功能能最最直接和最有效的方法之一。直接和最有效的方法之一。第43页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录二、

38、用功能失活策略鉴定基因功能二、用功能失活策略鉴定基因功能 基基因因功功能能失失活活策策略略的的本本质质是是将将细细胞胞或或个个体体的的某某一一基基因因功功能能部部分分或或全全部部失失活活后后，通通过过观观察察细细胞胞生生物物学学行行为或个体遗传性状表型的变化来鉴定基因的功能。为或个体遗传性状表型的变化来鉴定基因的功能。方法：方法：基因敲除基因敲除基因沉默基因沉默 第44页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录基基因因敲敲除除（gene knock-out）属属于于基基因因打打靶靶技技术术的的一一种种，其其利利用用同同源源重重组组的的原原理理，在在ES细细胞胞中中定定点点破破坏坏内内源源基基因因，

39、然然后后利利用用ES细细胞胞发发育育的的全全能能性性，获获得得带带有有预预定定基基因因缺缺陷陷的的杂杂合合子子，通通过过遗遗传育种最终获得目的基因缺陷的纯合个体。传育种最终获得目的基因缺陷的纯合个体。（一）用基因敲除技术使基因功能完全缺失（一）用基因敲除技术使基因功能完全缺失 条条件件性性基基因因敲敲除除（conditional gene knock-out）可可以以更更加加明明确确地地在在时时间间和和空空间间上上操操作作基基因因靶靶位位，敲敲除除效效果果更更加加精精确确可可靠靠，理理论论上可达到对任何基因在不同发育阶段和不同器官、组织的选择性敲除。上可达到对任何基因在不同发育阶段和不同器官、

40、组织的选择性敲除。第45页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录第46页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录（二）用基因沉默技术可使基因功能部分缺失（二）用基因沉默技术可使基因功能部分缺失 1.用用RNA干扰技术研究基因功能干扰技术研究基因功能 2.用用miRNA技术研究基因功能技术研究基因功能 3.用反义用反义RNA技术研究基因功能技术研究基因功能 4.核酶（核酶（ribozyme）技术）技术 利用利用RNAi能在短时间内高效特异地抑制靶基因表达的能在短时间内高效特异地抑制靶基因表达的特点，可以很方便地研究基因的功能。特点，可以很方便地研究基因的功能。通过与通过与mRNA不完全互补配对结合而抑制翻译，一种不完全互补配对结合而抑制翻译，一种miRNA可沉默多个靶基因。可沉默多个靶基因。通过反义通过反义RNA与细胞中的与细胞中的mRNA特异性结合，从而抑制特异性结合，从而抑制相应相应mRNA的翻译。的翻译。核酶通过剪切靶核酶通过剪切靶RNA分子而抑制基因的表达。分子而抑制基因的表达。第47页，讲稿共48张，创作于星期日目录目录感谢大家观看第48页，讲稿共48张，创作于星期日