2022年食品毒理学实验指导 .pdf
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1、食品毒理学实验指导西南大学食品科学学院名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 1 页,共 10 页 -实验一 血细胞的计数【目的要求】学习红细胞、白细胞计数的方法。【基本原理】血液中血细胞数的计算是使用血细胞计数板。而且要用适当的溶液将血液稀释后,放入计数板的计数室内,在显微镜下计算一定容积血液稀释液中的血细胞个数,再将所得结果换算为1mm3血液中的血细胞个数。【动物与器材】血细胞计数板、玻璃毛细吸管、1ml和 5ml 吸管、表面皿、显微镜、刺血针、酒精棉球、红细胞稀释液、白细胞稀释液。【方法与步骤】1血细胞计数板的结构血细胞计数板为一块特制的长方形厚载玻片,在中部13 面积处有 4
2、 条槽。内侧2 条槽之间还有1 条横槽相通,因此在中部构成2 块长方形平台。此平台比整个载玻片的平面低0.1 mm。平台中部各刻有1 个含 9 个大方格的方格网,为计数室。每 1 个大方格边长1 mm,面积为 1mm2,体积为0.1 mm3。四角的每1 个大方格又被分为16 个中方格,适用于白细胞、血小板和培养细胞的计数。中央的大方格则由双线划分为25 个中方格,每个中方格面积为 0.04mm2,体积为0.004mm3,每个中方格又分成16 个小方格,适用于红细胞、微生物细胞的计数。2采血管采血管为一细长、均匀的毛细玻璃管,其上有 2 个刻度,前端刻度指示的容量为10mm3,后端的为20mm3
3、,尾端与 1个带孔的橡皮吸球相连。3采血及稀释(1)用 1 mL 吸管准确吸取0.38mL 白细胞稀释液,放入1 支干净的小试管内,加塞备用。用 5mL 吸管准确吸取3.98mL 红细胞稀释液,放入另 1 支干净的中试管内,加塞备用。(2)用消毒干棉球醮75乙醇消毒左手无名指或耳垂边缘(或兔的耳缘静脉采血部位),待酒精挥发后用采血针刺入皮肤约23mm深,让血液自然流出。采血时必须待皮肤上的消毒酒精挥发后才能穿刺,否则流出的血液不能成滴,无法吸取。用消毒干棉球拭去第1 滴血液,待流出第2 滴血成大滴时,用采血管吸血至20mm3刻度处。吸血时应注意,不可2名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整
4、理-第 2 页,共 10 页 -过度挤压组织以图加速血液流出;吸血时应尽量利用毛细管现象使血液自动进入吸管内。操作要快,以防止血液凝固。若血柱超出规定刻度12mm,可用干棉球轻触管口(此时须执管于水平位置),吸去多余部分,使血液面恰至规定刻度处。拭去附着于吸管尖端外部的血液。若血液面超过规定刻度2mm以上或吸入气泡,则应重新吸取血液。将血液吹入盛有白细胞稀释液的中试管底部,轻轻摇振试管12min,以摇匀稀释的血液。(3)趁出血处尚有血液流出,及时用另一支采血管依同样方法吸血至20mm3刻度处,并将血液吹入盛有红细胞稀释液的中试管底部。轻轻摇振试管12min,以摇匀稀释的血液,但不可用力过猛,以
5、免发生泡沫。4充液2 类血细胞计数分2 次充液,方法如下。(1)取干净的计数板平放于实验桌上,将盖玻片置入计数板正中央。计数板和盖玻片在使用前必须用软绸或擦镜纸擦净,并在低倍镜下检查计数室是否干净,其刻度是否清晰。用小滴管吸取稀释血液,并将管尖轻轻斜置于盖玻片边缘,让稀释血液缓慢流出,借毛细管现象而自动流入计数室内。一般应一次充液使计数室内充满稀释血液,若经几次充液,易形成气泡,应洗净计数板和盖玻片,干燥后重新充液。(2)稀释的血液充入计数室后,静置23min,待细胞不再浮动后,于低倍镜下计数。5计数为防止重复计数和漏数,计数时应遵循一定的顺序进行,即“从左到右,自上而下”;对正好压在格线上的
6、血细胞,依照“数上不数下,数左不数右”的原则进行计数(图1-2)。如计数白细胞时发现各大方格的白细胞数相差8个以上,计数红细胞时发现各中方格的红细胞数最多与最少相差20 个以上时,则表示血细胞分布不均匀,必须将稀释的血液摇匀后再重新充入计数室计图 1-2 血细胞计数方式实心圈表示应计数的红细胞空心圈表示不应计数的红细胞数。数因为:0。6计算(1)白细胞数将四角的 4 个大方格内数得的白细胞总数乘以50,即得每立方毫米血液内的白细胞总数,也可将对角两个大方格内数得的白细胞总数乘以100。即得每立方毫米血内的白细胞总稀释液 0.38mL 加入血液 20mm3(1mL1000mm3,故 20mm30
7、.02mL,),使血液稀释20 倍,换算成未稀释血时应乘以2在计数时仅统计四角的4 个大方格内的白细胞,其容积为lmm1mm0.1mm 40.4mm3,换算成每立方毫米时应乘以2.5。这样,把四角4 个大方格内数得的白细胞总数乘以 50(即 202.550),即得每立方毫米血内的白细胞总数。(2)红细胞数将中央大方格中的四角和中央的中方格共5 个中方格内数得的红细胞总数乘以10000,即得每立方毫米血内红细胞的总数。因为:稀释液 3.98mL,加入血 20mm3(即 0.02mL),使血液稀释200 倍,换算成未稀释血时应乘以 200。在计数时仅统计0.02 mm3内的红细胞(1 个中方格的容
8、积为0.2mm0.2mm0.1mm 0.004mm3,5 个中方格的容积为0.004mm3 50.02mm3),换算成每立方毫米时应乘以50。这样把 5 个中方格内数得的红细胞总数乘以10 000(即 2005010000),即得每立方毫米血内的红细胞总数。(3)按目前临床上血细胞计数采用的通用单位,将以上所获每毫升血液中所含各血细胞数量换算为各血细胞在每升血液中的数量。3名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 3 页,共 10 页 -7清洗血细胞计数板盖玻片及计数板用过之后,必须立即用水冲洗,但不可用硬物刷洗。计数板晾干或吹风机吹干后,应镜检计数室是否干净,如不干净必须重复洗至干净
9、为止。注:人体红细胞的正常参考值:男性:4.5 5.5 1012/L 女性:3.8 4.6 1012/L 新生儿:6.0 1012/L 以上白细胞计数成人 410109/L 新生儿 1520109/L 血细胞稀释液配制法1白细胞稀释液冰醋酸(破坏红细胞)1.5ml 1%龙胆紫(染白细胞核,便于计数)1ml 蒸馏水加至 100ml 2红细胞稀释液NaCl(维持渗透压)0.5g Na2SO4(使溶液比重增加,红细胞均匀分布不易下沉)2.5g HgCl2(固定红细胞并防腐)0.25g 蒸馏水加至 100ml 草酸盐抗凝剂:其配制方法如下:草酸铵1.2g、草酸钾 0.8g、40%甲醛溶液(防止霉菌生长
10、)1ml、加蒸馏水至100ml。将抗凝剂溶液0.1ml 吸入毛细管中,待溶液水分自然蒸发或稍加温烘干后使用。4名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 4 页,共 10 页 -实验二 急性毒性试验常用染毒方法及半数致死浓度的测定【目的要求】1 掌握动物保定和灌胃染毒的方法 2 掌握半数致死浓度(LD50)霍恩氏法测定方法和结果评定。【基本原理】霍恩氏法利用剂量对数与死亡率的转换数呈直线关系设计的方法,又称平均移动法或剂量递增法。【动物与器材】实验动物:雌雄相同数量的健康成年小鼠 材料:灌胃器材1 套,注射器,苦味酸酒精饱和液,亚硝酸钠,动物称【方法与步骤】1 常用实验动物的保定方法(1
11、)小白鼠的保定小白鼠性情较温顺,挣扎力小,比较容易抓取和保定。抓取时,用左手拇指和食指捏住小鼠尾巴中部放在格板或铁笼上。趁着小鼠试图挣脱的瞬间,迅速用另外三个手指压住小鼠的尾巴根部握入手掌;放松拇指和食指,用另外三个手指控制小鼠,然后用食指和拇指捏住小鼠头部两边疏松的皮肤提起小鼠,完成抓取保定。注意,抓小鼠尾巴应抓住尾巴中部或根部,不能仅捏住小鼠尾巴的尾端,因为这时小鼠的重量全部集中到尾端,如果小鼠挣扎,有可能弄破尾端。在进行解剖、手术、心脏采血、尾静脉注射时,可将小鼠用线绳捆绑在木板上,或固定在尾静脉注射架及粗试管中。(2)大白鼠的抓取保定抓取大鼠前最好戴上防护手套,右手轻轻抓住大鼠尾巴的中
12、部并提起,迅速放在笼盖上或其它粗糙面上,左手顺势按、卡在大鼠躯干背部,稍加压力向头颈部滑行,以左手拇指和食指捏住大鼠两耳后部的头颈皮肤,其余三指和手掌握住大鼠背部皮肤,完成抓取保定。(3)豚鼠的抓取豚鼠性情温顺,胆小易惊,一般不易伤人。捉拿时,实验人员可先用手轻轻扣、按住豚鼠背部,顺势抓紧其肩胛上方皮肤,拇指和食指环其颈部,用另一只手轻轻托住其臀部,即可将豚鼠抓取保定。抓取豚鼠需讲究稳、准、柔、快,不可过分用力抓捏豚鼠的腰腹部,否则容易造成肝破裂、脾淤血而引起死亡。如果在动物实验操作过程中,豚鼠挣扎剧烈,实验人员遇到这种情况,可以用纱布将豚鼠头部蒙住,把豚鼠置于实验台上,实验人员稍为用力扣、按
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