酶的改造方法进展课件.ppt
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1、关于酶的改造方法进展第1页,此课件共64页哦为什么要进行酶改造?温和的自然体系:温和的自然体系:常温、常压、中性常温、常压、中性pHpH、水环境、水环境极端的工业体系:极端的工业体系:高温、高压、酸、碱、有机溶剂高温、高压、酸、碱、有机溶剂酶不适应第2页,此课件共64页哦酶的改造方法r 酶的化学修饰酶的化学修饰-分子修饰分子修饰r 酶的物理修饰酶的物理修饰-固定化固定化r 酶的生物改造酶的生物改造-定向进化定向进化r 酶的人工模拟酶的人工模拟-抗体酶抗体酶第3页,此课件共64页哦一、酶的化学修饰B通过制备酶单分子纳米凝胶,大大提高了酶的稳定性第4页,此课件共64页哦酶分子修饰主要方法酶分子修饰
2、主要方法 金属离子置换修饰金属离子置换修饰大分子结合修饰大分子结合修饰侧链基团修饰侧链基团修饰肽链有限水解修饰肽链有限水解修饰氨基酸置换修饰氨基酸置换修饰 第5页,此课件共64页哦1 1)金属离子置换修饰实例)金属离子置换修饰实例p SODSOD的金属离子置换的金属离子置换:天然天然SODSOD中的中的铁铁原子被原子被锰锰原子取代后,重组酶对原子取代后,重组酶对H H2 2O O2 2的稳定性的稳定性显著增强,对显著增强,对NaHNaH3 3的抑制作用的敏感型显著降低。的抑制作用的敏感型显著降低。p 氨基酸酰化酶的金属离子置换氨基酸酰化酶的金属离子置换:氨基酰化酶的氨基酰化酶的锌锌被被钴钴取代
3、后,底物专一性和最适取代后,底物专一性和最适pHpH都有改都有改变,锌酶对变,锌酶对N-N-乙酰丙氨酸的最适乙酰丙氨酸的最适pHpH是是8.5,8.5,而钴酶是而钴酶是7.0.7.0.第6页,此课件共64页哦2 2)酶大分子修饰的实例)酶大分子修饰的实例每分子核糖核酸酶和每分子核糖核酸酶和6.5分子的右旋糖酐结合,酶的催化效率提高分子的右旋糖酐结合,酶的催化效率提高2.25倍;倍;用琥珀酸酐法活化的聚乙二醇对菠萝蛋白酶进行修饰,在用琥珀酸酐法活化的聚乙二醇对菠萝蛋白酶进行修饰,在55的的稳定性比未修饰的提高稳定性比未修饰的提高38%;尿激酶采用聚乙二醇尿激酶采用聚乙二醇5000修饰,在兔体内的
4、半衰期延长修饰,在兔体内的半衰期延长913倍;倍;超氧化歧化酶采用聚乙二醇修饰后半衰期延长超氧化歧化酶采用聚乙二醇修饰后半衰期延长70350倍;倍;L-天冬酰胺酶经聚乙二醇修饰后,抗原性显著降低,天冬酰胺酶经聚乙二醇修饰后,抗原性显著降低,1994年经美年经美国国FDA批准成为治疗急性白血病的药物使用批准成为治疗急性白血病的药物使用第7页,此课件共64页哦3 3)侧链基团修饰的实例)侧链基团修饰的实例用亚硝酸修饰天冬酰胺酶,使氨基末端的用亚硝酸修饰天冬酰胺酶,使氨基末端的LeuLeu和肽链中的和肽链中的LysLys残基上残基上的的-NH-NH2 2脱氨变成脱氨变成-OH-OH,酶的半衰期延长,
5、酶的半衰期延长2 2倍;倍;葡萄糖异构酶经琥珀酰化修饰葡萄糖异构酶经琥珀酰化修饰酚基酚基后,最适后,最适pHpH下降下降0.50.5,稳定,稳定性增加,更有利于果葡糖浆生产;性增加,更有利于果葡糖浆生产;用用O-O-甲基异脲修饰溶菌酶,使酶分子中的甲基异脲修饰溶菌酶,使酶分子中的LysLys残基上的残基上的-氨基氨基结合结合屏蔽,稳定性显著增强;屏蔽,稳定性显著增强;枯草杆菌蛋白酶的第枯草杆菌蛋白酶的第104104位位TyrTyr上的上的酚羟基酚羟基经四硝基甲烷修饰后,经四硝基甲烷修饰后,生成生成3-3-硝基酪氨酸残基,使酶对带正电荷的底物结合能力硝基酪氨酸残基,使酶对带正电荷的底物结合能力显
6、著增强;显著增强;第8页,此课件共64页哦 胰蛋白酶原(胰蛋白酶原(trypsinogentrypsinogen)的激活)的激活 4 4)肽链有限水解修饰实例)肽链有限水解修饰实例第9页,此课件共64页哦5 5)氨基酸置换修饰实例)氨基酸置换修饰实例 Bender Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸,修饰后,该酶失去对中心的丝氨酸转换为半胱氨酸,修饰后,该酶失去对蛋白蛋白质和多肽质和多肽的水解能力,却出现了催化的水解能力,却出现了催化硝基苯酯硝基苯酯等底物水解的活等底物水解的活性。性。评价评价:化学修饰法难
7、度大,成本高,专一性差,而且要对酶:化学修饰法难度大,成本高,专一性差,而且要对酶分子逐个修饰,操作复杂,难以工业化生产;分子逐个修饰,操作复杂,难以工业化生产;发展趋势:定点突变发展趋势:定点突变 通过定点突变技术把农杆菌通过定点突变技术把农杆菌-葡萄糖苷酶催化中心的第葡萄糖苷酶催化中心的第358358位位L-GluL-GluL-AlaL-Ala,使亲核的羧基,使亲核的羧基甲基,结果使该酶失去了水甲基,结果使该酶失去了水解活性,而可以催化糖苷合成解活性,而可以催化糖苷合成第10页,此课件共64页哦酶分子修饰的发展趋势酶分子修饰的发展趋势大分子修饰研究最为成功,尤其是聚乙二醇修饰;大分子修饰研
8、究最为成功,尤其是聚乙二醇修饰;酶的侧链基团修饰已经成为酶结构研究的重要手段;酶的侧链基团修饰已经成为酶结构研究的重要手段;更为精细的酶侧链修饰往往和结构生物学紧密相关;更为精细的酶侧链修饰往往和结构生物学紧密相关;第11页,此课件共64页哦二、酶的物理改造二、酶的物理改造-固定化固定化 载体固定化:纳米材料、树脂、水凝胶、壳聚糖等 无载体固定化:细胞表面自固定化、酶聚集体等第12页,此课件共64页哦10mL 淀粉淀粉葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶(350g/mL)与与30mg 壳聚糖混合,在室温壳聚糖混合,在室温放置放置1h,不时搅拌,在,不时搅拌,在4过夜,过滤,用过夜,过滤,用600mL 蒸馏水洗
9、涤蒸馏水洗涤,过过滤即得滤即得壳聚糖壳聚糖固定化淀粉葡萄糖苷酶固定化淀粉葡萄糖苷酶;第13页,此课件共64页哦海藻酸钠海藻酸钠先加热配成溶液,取一定量碱性蛋白酶溶液和海藻酸钠溶液先加热配成溶液,取一定量碱性蛋白酶溶液和海藻酸钠溶液混合,搅拌均匀后用蠕动泵将混合液滴入混合,搅拌均匀后用蠕动泵将混合液滴入2%的的CaCl2 中形成凝胶珠,中形成凝胶珠,放入放入4 冰箱硬化冰箱硬化4h,得到海藻酸钠微球。,得到海藻酸钠微球。卡拉胶卡拉胶加热配成一定的浓度加热配成一定的浓度,50 水浴保温水浴保温,加入乳糖酶溶液,加入乳糖酶溶液,均匀搅拌后冷却,均匀搅拌后冷却,4 冰箱中硬化,得到块状固定化酶;冰箱中
10、硬化,得到块状固定化酶;第14页,此课件共64页哦 酶与酶与1.5%的的海藻酸钠海藻酸钠溶液充分混和,通过针头滴入溶液充分混和,通过针头滴入1.1%氯化氯化钙溶液中,形成珠状的海藻酸胶颗粒。凝胶珠用钙溶液中,形成珠状的海藻酸胶颗粒。凝胶珠用0.5%的的聚赖氨酸聚赖氨酸处理,再经处理,再经0.1%的的2-N-环已胺乙基磺酸处理,用生理盐水洗涤,环已胺乙基磺酸处理,用生理盐水洗涤,再以再以0.05mol/L的柠檬酸钠水溶液液化微囊内海藻酸钙,得到近的柠檬酸钠水溶液液化微囊内海藻酸钙,得到近乎透明的乎透明的微囊化微囊化的固定化酶。的固定化酶。第15页,此课件共64页哦DEAE-纤维素固定虫漆酶纤维素
11、固定虫漆酶 CM-纤维素酶固定虫漆酶纤维素酶固定虫漆酶 第16页,此课件共64页哦吸附交联法:吸附交联法:先将酶吸附在硅胶或树脂等载体上,再用戊二醛等双功先将酶吸附在硅胶或树脂等载体上,再用戊二醛等双功能试剂交联,所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。能试剂交联,所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。交联包埋法:交联包埋法:把酶液和双功能试剂(戊二醛)凝结成颗粒很细的集把酶液和双功能试剂(戊二醛)凝结成颗粒很细的集合体,然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。制得的固合体,然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。制得的固定化酶稳定性好;定化酶稳定性好;第17页,此课件共64页哦泵泵储罐反应产物离心
12、机离心机消旋消旋反应反应器器固定化酶柱子晶体 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-Ala固定化氨基酰化酶制备固定化氨基酰化酶制备L-L-丙氨酸丙氨酸世界上第一种工业化生产的固定化酶世界上第一种工业化生产的固定化酶第18页,此课件共64页哦酶固定化的发展趋势酶固定化的发展趋势载体新材料层出不穷载体新材料层出不穷 介孔材料、纳米材料,磁性材料,大孔材料等;介孔材料、纳米材料,磁性材料,大孔材料等;固定化方法日新月异固定化方法日新月异 定向固定,微囊化固定,酶聚集体,静电纺丝等;定向固定,微囊化固定,酶聚集体,静电纺丝等;酶的结构与性能研究是热点酶的结构与性能研究是热点 结构
13、模拟与计算等;结构模拟与计算等;第19页,此课件共64页哦三、酶的生物改造三、酶的生物改造-定向进化定向进化 自然界酶的进化是极其缓慢的,无法适应工业过程的需要。随着自然界酶的进化是极其缓慢的,无法适应工业过程的需要。随着分子生物学技术快速发展,人们可以在试管内利用几周时间完成自然分子生物学技术快速发展,人们可以在试管内利用几周时间完成自然界几万年的进化过程界几万年的进化过程自然进化诱变育种定向进化上万年上万年几年到十多年几年到十多年几个月几个月第20页,此课件共64页哦酶的定向进化技术发展历程酶的定向进化技术发展历程生物催化剂进化方法发展历程随机和定点突变定向进化计算机辅助设计基于序列-功能
14、关系与统计模型的理性进化第21页,此课件共64页哦蛋白质蛋白质稳定性活性有机溶液中的活性不同的底物的利用酸碱度蛋白质的表达亲和性 专一性1234性能代数达到目的达到目的随机突变随机突变随机杂交随机杂交筛选筛选目标蛋白目标蛋白酶定向进化的过程和应用范围酶定向进化的过程和应用范围第22页,此课件共64页哦酶定向进化的典型例子酶定向进化的典型例子枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化热稳定性的分子进化第23页,此课件共64页哦进化后的枯草杆菌蛋白酶E在在60%60%的的DMFDMF中酶催化效率提高中酶催化效率提高157157倍,最适温度提高倍,最适温度提高1717正面反面第24页,此课件共
15、64页哦对硝基苯酯酶的分子进化(Lori Giver等,1998)(在在30%30%的的DMFDMF中酶催化活性提高中酶催化活性提高100100倍倍)第25页,此课件共64页哦-葡糖苷酶耐热性的提高(Mara Jesu s Arrizubieta等,2000)第26页,此课件共64页哦酶定向进化的基本过程酶定向进化的基本过程随机突变随机突变 不同的定向进化方法不同的定向进化方法构建突变基因文库构建突变基因文库 载体的选择,基因重组,组建基因文库载体的选择,基因重组,组建基因文库突变基因的筛选突变基因的筛选 平板筛选法,荧光筛选法,表面展示法平板筛选法,荧光筛选法,表面展示法 第27页,此课件共
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