高效液相色谱原理第一讲课件.ppt

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1、高效液相色谱原理第一讲高效液相色谱原理第一讲第1页，此课件共54页哦一、色谱概述一、色谱概述二、高效液相色谱二、高效液相色谱(HPLC)(HPLC)三、几种主要的三、几种主要的HPLCHPLC四、四、HPLCHPLC特点、特点、流程流程及主要部件及主要部件第2页，此课件共54页哦 1.什么是色谱什么是色谱?色谱是色谱法的简称色谱是色谱法的简称(又叫色层法又叫色层法,层析法层析法),),其本质是其本质是一种分离分析方法一种分离分析方法常见的分离方法常见的分离方法l蒸馏蒸馏l离心离心l电泳电泳l过滤过滤l色谱色谱(目前最有效的分离方法目前最有效的分离方法)一、色谱概述一、色谱概述第3页，此课件共5

2、4页哦2.2.色谱法简介色谱法简介色谱法色谱法(Chromatography)溯源溯源 100多年前俄国植物学家多年前俄国植物学家Tswett分离植物色素时分离植物色素时采用的实验方法采用的实验方法 他将植物色素的他将植物色素的石油醚提取液石油醚提取液倒入装有倒入装有碳酸钙碳酸钙的的直立玻璃管直立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下再加入石油醚使其自由流下,结果色素结果色素中各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带中各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带 Tswett用希腊语用希腊语chroma(色色)和和graphos(谱谱)描述他描述他的实验方法，即现在的的实验方法，即现在的Chromatograp

3、hy(色谱法色谱法)第4页，此课件共54页哦第5页，此课件共54页哦3.3.色谱法的发展色谱法的发展色谱法是一种现代的分离方法色谱法是一种现代的分离方法 1906年正式命名年正式命名20世纪世纪30年代开始广泛研究和应用年代开始广泛研究和应用高效液相色谱法的广泛应用始于高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪世纪70年年代代第6页，此课件共54页哦4.4.色谱法原理色谱法原理色谱法的原理色谱法的原理利利用用混混合合物物中中各各组组份份在在不不同同的的两两相相(流流动动相相、固固定定相相）中中溶溶解解,分分配配,吸吸附附等等化化学学作作用用性性能能的的差差异异,当当流流动动相相中中所所携携带带的的混

4、混合合物物流流过固定相时，就会和固定相发生作用过固定相时，就会和固定相发生作用(力的作用力的作用)。由由于于混混合合物物中中各各组组分分在在性性质质和和结结构构上上有有差差异异，与与固固定定相相发发生生作作用用的的大大小小也也有有差差异异。因因此此，在在同同一一推推动动力力作作用用下下，不不同同组组分分在在固固定定相相中中的的滞滞留留时时间间有有长长有有短短，从从而而按按先先后后不不同同的的次次序从固定相中流出。序从固定相中流出。两两相相中中有有一一相相是是固固定定的的,叫叫作作固固定定相相(Stationary(Stationary Phase),Phase),有有一一相相是是流流动动的的,

5、称称为为流流动动相相(Mobile(Mobile Phase),Phase),流流动动相相又又叫叫洗洗脱脱剂剂,溶剂溶剂第7页，此课件共54页哦n相相(Phase):物物理理化化学学术术语语,特特指指在在某某一一系系统统中中,具具有有相相同同成成分分及及相相同同物物理理、化化学学性性质质的的均均匀匀物物质质部部分分。各各相相之之间间有有明明显可分的界面。显可分的界面。第8页，此课件共54页哦n 分离分离 分离分离是一个物理过程。是一个物理过程。固定相固定相(Stationary Phase)流动相流动相(Mobile Phase)进样进样(Injection)洗脱洗脱(Elution)相互作用

6、相互作用(Interaction)第9页，此课件共54页哦Temporal course淋洗液淋洗液色谱分离色谱分离第10页，此课件共54页哦5.5.色谱法的分类色谱法的分类(1)(1)按分离过程的机理分按分离过程的机理分:l吸附色谱吸附色谱(Absorption Chromatography)(Absorption Chromatography)l根根据据样样品品组组分分对对活活性性固固定定相相表表面面吸吸附附亲亲和和力力的的不不同同实现分离实现分离l分配色谱分配色谱(Partition Chromatography)(Partition Chromatography)l分分离离基基于于样样

7、品品组组分分在在固固定定相相和和流流动动相相中中的的溶溶解解度度(分分配系数配系数)不同不同l离子交换色谱离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography)(Ion Exchange Chromatography)l根根据据样样品品组组份份离离子子交交换换亲亲和和力力的的差差异异分分离离,简简称称离离子色谱子色谱(IC)(IC)第11页，此课件共54页哦l GPC(Gel Permeation Chromatography)固定相是疏水性凝胶固定相是疏水性凝胶,流动相是有机溶剂流动相是有机溶剂l GFC(Gel Filtration Chromatography)固定相是亲

8、水性凝胶固定相是亲水性凝胶,流动相是水溶液流动相是水溶液利用多孔性物质对不同大小的分子的排阻作用进行分离利用多孔性物质对不同大小的分子的排阻作用进行分离的方法的方法l 体积排除色谱体积排除色谱(Size Exclusion Chromatography)l 亲和色谱亲和色谱 l利利用用生生物物大大分分子子和和固固定定相相表表面面存存在在的的某某种种特特异异性性亲亲和力，进行选择性分离。和力，进行选择性分离。第12页，此课件共54页哦 (2)按流动相的物态分按流动相的物态分:l气相色谱气相色谱(Gas Chromatography,GC)用气体作为流动相用气体作为流动相(又叫载气又叫载气)l液相

9、色谱液相色谱(Liquid Chromatography,LC)用液体作为流动相用液体作为流动相(又叫洗脱剂又叫洗脱剂)(3)按固定相的形态分按固定相的形态分:l平面色谱平面色谱l纸色谱纸色谱l薄层色谱薄层色谱l柱色谱柱色谱第13页，此课件共54页哦色谱法分类示意图色谱法分类示意图第14页，此课件共54页哦二、高效液相色谱二、高效液相色谱(HPLC)l HPLC 的产生的产生l HPLC 的固定相的固定相l HPLC 的流动相的流动相第15页，此课件共54页哦1.HPLC的产生的产生l液液相相色色谱谱法法开开始始阶阶段段是是用用大大直直径径的的玻玻璃璃管管柱柱在在室室温温和和常常压压下下用用液

10、液位位差差输输送送流流动动相相，称称为为经典液相色谱法经典液相色谱法l柱效低、时间长柱效低、时间长(常有几个小时常有几个小时)。第16页，此课件共54页哦l高高 效效液液 相相 色色 谱谱 法法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是是在在经经典典液液相相色色谱谱法法的的基基础础上上,于于60年年代代后后期期引引入入了了气气相相色色谱谱理理论论而而迅迅速速发发展起来的。展起来的。l与与经经典典液液相相色色谱谱法法的的区区别别是是填填料料颗颗粒粒小小而而均均匀匀,小小颗颗粒粒具具有有高高柱柱效效,但但会会引引起起高高阻阻力力,需需用用高高压压输

11、输送送流流动动相相,故故又又称称高高压压液液相相色色谱谱法法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC).l因因分分析析速速度度快快而而又又称称为为高高速速液液相相色色谱谱法法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也也称称现现代代液液相相色色谱。谱。第17页，此课件共54页哦lHPLC 是一种区别于经典液相色谱是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高基于仪器方法的高效能分离手段效能分离手段 高性能色谱柱高性能色谱柱,高精度输液泵高精度输液泵,高灵敏度检测器高灵敏度检测器 广广泛泛应应用用于于各各个个领领域域:医

12、医药药,环环保保,石石化化,生生命命科科学学,食品工业食品工业,农业农业 无无论论在在技技术术上上,理理论论上上,还还是是在在应应用用上上仍仍有有较较大大的的发展空间发展空间第18页，此课件共54页哦2.2.高效液相色谱的固定相高效液相色谱的固定相(1)固定相以承受高压能力来分类，可分为固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体刚性固体 和硬胶和硬胶两大类。两大类。l刚刚性性固固体体 以以二二氧氧化化硅硅为为基基质质，可可承承受受7.0 1081.0 109 Pa 的的高高压压，可可制制成成直直径径、形形状状、孔孔隙隙度度不不同同的的颗颗粒粒。如如果果在在二二氧氧化化硅硅表表面面键键合合各各种

13、种官官能能团团，可可扩扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。l硬硬胶胶 主主要要用用于于离离子子交交换换和和尺尺寸寸排排阻阻色色谱谱中中，它它由由聚聚苯苯乙乙烯烯与与二二乙乙烯烯苯苯基基交交联联而而成成。可可承承受受压压力力上上限限为为3.5 108 Pa。第19页，此课件共54页哦l表表面面多多孔孔型型固固定定相相 它它的的基基体体是是实实心心玻玻璃璃球球，在在玻玻璃璃球球外外面面覆覆盖盖一一层层多多孔孔活活性性材材料料，如如硅硅胶胶、氧氧化化硅硅、离离子子交交换剂、分子筛、聚酰胺等。换剂、分子筛、聚酰胺等。(2)固定相按孔隙深度分类，可分

14、为固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔表面多孔型和全多孔型型两类。两类。多孔层厚度小多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效高；孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达到平衡，较适合做常规分析。到平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受到限制。由于多孔层厚度薄，最大允许量受到限制。第20页，此课件共54页哦l全全多多孔孔型型固固定定相相 由由直直径径为为10nm的的硅硅胶胶微微粒粒凝凝聚聚而而成成。这这类类固固定定相相由由于于颗颗粒粒细细(510 m)，孔孔仍仍然然较较

15、浅浅，传传递递速速率率快快，易易实实现现高高效效、高高速速。特特别别适适合合复复杂混合物分离及衡量分析。杂混合物分离及衡量分析。第21页，此课件共54页哦3.3.液相色谱的流动相液相色谱的流动相(1)(1)流动相特性流动相特性l液液相相色色谱谱的的流流动动相相又又称称为为：淋淋洗洗液液，洗洗脱脱剂剂。流流动动相相组组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况.l亲亲水水性性固固定定相相常常采采用用疏疏水水性性流流动动相相，即即流流动动相相的的极极性性小小于于固固定定相相的的极极性性，称称为为正正相相液液液液色色谱谱法法，极性柱也称正相柱。极性柱也称正相柱。

16、l若若流流动动相相的的极极性性大大于于固固定定液液的的极极性性，则则称称为为反反相相液液液液色色谱谱，非非极极性性柱柱也也称称为为反反相相柱柱。组组分分在在两两种种类类型型分离柱上的出峰顺序相反。分离柱上的出峰顺序相反。第22页，此课件共54页哦(2)流动相类别流动相类别l 按流动相组成分：单组分和多组分；按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。l常常用用溶溶剂剂：己己烷烷、四四氯氯化化碳碳、甲甲苯苯、乙乙酸酸乙乙酯酯、乙乙醇、乙腈、醇、乙腈、水。水。l采用二元或

17、多元组合溶剂作为流动相可以灵活调采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。整出峰时间。第23页，此课件共54页哦(3)流动相选择流动相选择l在选择溶剂时，在选择溶剂时，溶剂的极性溶剂的极性是选择的重要依据。是选择的重要依据。l溶溶剂剂的的极极性性越越高高，则则保保留留时时间间缩缩短短，通通过过改改变变流流动动相的极性可以得到理想的保相的极性可以得到理想的保留时间。留时间。l常常用用溶溶剂剂的的极极性性顺顺序序：水水(最最大大)甲甲酰酰胺胺 乙乙腈腈 甲甲醇醇 乙乙醇醇 丙丙醇醇 丙丙酮酮 二二氧氧六

18、六环环 四四氢氢呋呋喃喃 甲甲乙乙酮酮 正正丁丁醇醇 乙乙酸酸乙乙酯酯 乙乙醚醚 异异丙丙醚醚 二二氯氯甲甲烷烷 氯氯仿仿 溴溴乙乙烷烷 苯苯 四四氯氯化化碳碳 二二硫硫化化碳碳 环环己己烷烷 己烷己烷 煤油煤油(最小最小)。第24页，此课件共54页哦(4)(4)流动相的要求流动相的要求l流流动动相相是是液液体体，它它对对组组分分有有亲亲合合力力，并并参参与与固固定定相相对对组组分分的的竞竞争争，因因此此，正正确确选选择择流流动动相相直直接接影影响响组组分分的的分分离离度度。对对流流动动相相溶剂的要求是：溶剂的要求是：l溶剂对于待测样品，须具有合适的极性和良好的选择性。溶剂对于待测样品，须具有

19、合适的极性和良好的选择性。l溶剂与检测器匹配溶剂与检测器匹配 对对于于紫紫外外吸吸收收检检测测器器，应应注注意意选选用用检检测测器器波波长长比比溶溶剂剂的的紫紫外外截截止止波波长长要要长长。(所所谓谓溶溶剂剂的的紫紫外外截截止止波波长长指指当当小小于于截截止止波波长长的的辐辐射射通通过过溶溶剂剂时时，溶溶剂剂对对此此辐辐射射产产生生强强烈烈吸吸收收，此此时时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量)。对对于于折折光光率率检检测测器器，要要求求选选择择与与组组分分折折光光率率有有较较大大差差别别的的溶溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。剂作

20、流动相，以达到最高灵敏度。第25页，此课件共54页哦l高高纯纯度度 由由于于高高效效液液相相色色谱谱灵灵敏敏度度高高，对对流流动动相相溶溶剂剂的的纯纯度度也也要要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰伪峰”。l化学稳定性好化学稳定性好l低低粘粘度度(粘粘度度适适中中)若若使使用用高高粘粘度度溶溶剂剂，势势必必增增高高压压力力，不不利利于分离于分离 常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等；常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等；但但粘粘度度过过低低的的溶溶剂剂也也不不宜宜采采用用，例例如如戊戊烷烷和和乙乙醚醚等等，它它们们容容易易在在色谱柱或检测器内形成气

21、泡，影响分离。色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。第26页，此课件共54页哦(5)(5)选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题l尽尽量量使使用用高高纯纯度度试试剂剂作作流流动动相相，防防止止微微量量杂杂质质长长期期累累积积损损坏坏色谱柱和使检测器噪声增加。色谱柱和使检测器噪声增加。l避避免免流流动动相相与与固固定定相相发发生生作作用用而而使使柱柱效效下下降降或或损损坏坏柱柱子子。如如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。l试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀

22、并在柱中沉积。l流流动动相相同同时时还还应应满满足足检检测测器器的的要要求求。当当使使用用紫紫外外检检测测器器时时，流流动动相相不不应有紫外吸收。应有紫外吸收。第27页，此课件共54页哦按分离机制的不同分为：按分离机制的不同分为：l 吸附色谱法吸附色谱法l 分配色谱法分配色谱法l 交换色谱法（交换色谱法（离子离子）l 体积排阻色谱法体积排阻色谱法l 亲和色谱法亲和色谱法三、几种主要的三、几种主要的HPLC第28页，此课件共54页哦(一一)吸附吸附(液液-固固)色谱色谱l基本原理：基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸。组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸。l固固定定相相：固固体体吸吸附附剂剂为

23、为硅硅胶胶、氧氧化化铝铝等等，较较常常使使用用的的是是5 510m10m的硅胶吸附剂。的硅胶吸附剂。l流动相：流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。各种不同极性的一元或多元溶剂。l应应用用：适适用用于于分分离离相相对对分分子子质质量量中中等等的的油油溶溶性性试试样样，对对具具有官能团的化合物和异构体有较高选择性。有官能团的化合物和异构体有较高选择性。l缺点：缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾。非线形等温吸附常引起峰的拖尾。第29页，此课件共54页哦l基基本本原原理理：利利用用试试样样各各组组分分在在固固定定相相和和流流动动相相上上的的分分配配比比例例不不同同而而分分离离。在在固固定定相相上上分

24、分配配多多的的组组分分（分分配配系系数数高高）后后出出峰，分配少（分配系数低）的先出峰。峰，分配少（分配系数低）的先出峰。l流流动动相相：对对于于亲亲水水性性固固定定液液，采采用用疏疏水水性性流流动动相相，即即流流动动相相的的极极性性小小于于固固定定液液的的极极性性（正正相相 normal normal phasephase），反反之之，流流动动相相的的极极性性大大于于固固定定液液的的极极性性（反反相相 reverse reverse phasephase）。正正相相与与反相的出峰顺序相反；反相的出峰顺序相反；l固定相：固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；早期涂渍固定液，固定液流失，

25、较少采用；l化化学学键键合合固固定定相相：将将各各种种不不同同基基团团通通过过化化学学反反应应键键合合到到硅硅胶胶（担体）表面的游离羟基上。（担体）表面的游离羟基上。C-18C-18柱（反相柱）。柱（反相柱）。(二二)分配（液分配（液-液）色谱液）色谱第30页，此课件共54页哦(三三)离子交换色谱离子交换色谱l基基本本原原理理：组组分分在在固固定定相相上上发发生生反反复复离离子子交交换换反反应应；组组分分与与离离子子交交换换剂剂之之间间亲亲和和力力的的大大小小与与离离子子半半径径、电电荷荷、存存在在 形形式式等等有有关关。亲亲和和力力大，保留时间长。大，保留时间长。阳离子交换：阳离子交换：R-

26、SOR-SO3 3H +MH +M+=R-SO =R-SO3 3 M+H M+H+阴离子交换：阴离子交换：R-NRR-NR4 4OH+XOH+X-=R-NR=R-NR4 4 X+OHX+OH-l 固定相：固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂。阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂。l流流动动相相：阴阴离离子子离离子子交交换换树树脂脂作作固固定定相相，采采用用酸酸性性水水溶溶液液；阳阳离离子子离离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液。子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液。l应用：应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等第31页，此课件共54页哦阳阳离子

27、交换分离机理离子交换分离机理 Temporal course 第32页，此课件共54页哦 阴离子交换阴离子交换分离机理分离机理m第33页，此课件共54页哦(四四)体积排阻色谱体积排阻色谱l固固定定相相：具具有有一一定定大大小小孔孔隙隙的的凝凝胶胶；l原原理理：借借助助多多孔孔性性凝凝胶胶孔孔径径的的大大小小，使使样样品品中中的的大大分分子子不不能能进进入入凝凝胶胶孔孔洞洞而而完完全全被被排排阻阻，只只能能沿沿凝凝胶胶粒粒子子之之间间的的空空隙隙通通过过色色谱谱柱柱，而而首首先先被被洗洗脱脱出出来来。被被分分析析样样品品可可按按分分子子的的相相对对大小分别先后流出。大小分别先后流出。第34页，此

28、课件共54页哦(五五)亲和色谱亲和色谱 l原原理理：利利用用生生物物大大分分子子和和固固定定相相表表面面存存在在的的某某种种特特异异性性亲亲和和力力，进进行选择性分离。行选择性分离。l先先在在载载体体表表面面键键合合上上一一种种具具有有一一般般反反应应性性能能的的间间隔隔臂臂(环环氧氧、联联胺胺等等)，再再连连接接上上配配基基(酶酶、抗抗原原等等)，这这种种固固载载化化的的配配基基将将只只能能和和具具有有亲亲和和力力特特性性吸吸附附的的生生物物大大分分子子作作用用而而被被保留保留.改变淋洗液后洗脱。改变淋洗液后洗脱。第35页，此课件共54页哦按分离过程物理化学原理分类的各种按分离过程物理化学原

29、理分类的各种液相色谱法的比较液相色谱法的比较具有锁匙结具有锁匙结构络合物的构络合物的可逆性离解可逆性离解 多孔凝胶的渗多孔凝胶的渗透或过滤透或过滤 可逆性的可逆性的离子交换离子交换 吸附与解吸吸附与解吸 分离原分离原理理 不同不同pH值值的缓冲溶液，的缓冲溶液，加入改性剂加入改性剂 有机溶剂或一有机溶剂或一定定pH值的缓值的缓冲溶液冲溶液 不同不同pH值的缓冲值的缓冲溶液溶液 不同极性有不同极性有机溶剂机溶剂 流动相流动相 多种不同性多种不同性能的配位体能的配位体键联在固相键联在固相基体上基体上 具有不同孔径具有不同孔径的多孔性凝胶的多孔性凝胶 高效微粒高效微粒离子交换离子交换剂剂 溶解与挥发

30、溶解与挥发 不同极性有不同极性有机溶剂和水机溶剂和水 固定液载在固定液载在固相基体上固相基体上 全多孔固体全多孔固体吸附剂吸附剂 固定相固定相 亲和色谱亲和色谱体积排阻色谱体积排阻色谱离子色谱离子色谱分配色谱分配色谱吸附色谱吸附色谱相相色谱色谱第36页，此课件共54页哦四、四、HPLC特点、特点、流程流程及主及主要部件要部件 l特点特点l流程流程l主要部件主要部件第37页，此课件共54页哦HPLC仪器（仪器（1）第38页，此课件共54页哦液相色谱仪（液相色谱仪（2）第39页，此课件共54页哦液相色谱仪（液相色谱仪（3）第40页，此课件共54页哦液相色谱仪（液相色谱仪（4）第41页，此课件共54

31、页哦1.HPLC的特点的特点l 分离效能高分离效能高l 选择性能高选择性能高l 检测灵敏度高检测灵敏度高l 分析速度快分析速度快第42页，此课件共54页哦2.2.流程流程第43页，此课件共54页哦色谱的基本流程图色谱的基本流程图淋洗液淋洗液 高压高压泵泵分离分离柱柱检测器检测器 泵液泵液分离分离 检测检测 记录记录进样进样器器抑制器检测检测器器进样进样第44页，此课件共54页哦3.3.主要部件主要部件l 输液泵输液泵(高压高压)l 梯度淋洗器梯度淋洗器(装置装置)l 进样器进样器(装置装置)l 分离器分离器(柱柱)l 检测器检测器(装置装置)l 结果记录器结果记录器(计算机及软件计算机及软件)

32、第45页，此课件共54页哦(1)(1)高压输液泵高压输液泵l主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：150350105 Pa。l为为了了获获得得高高柱柱效效而而使使用用粒粒度度很很小小的的固固定定相相（10m），液液体体的的流流动动相相高高速速通通过过时时，将将产产生生很很高高的的压压力力，因因此此高高压压、高高速速是是高高效效液液相相色谱的特点之一。色谱的特点之一。l应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性第46页，此课件共54页哦(2)(2)梯度淋洗装置梯度淋洗装置l外外梯梯度度(低低压压梯梯度度):):一一台台高高压压泵泵,通通

33、过过比比例例调调节节阀阀,将将两两种种或或多多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。l梯梯度度:不不同同溶溶剂剂的的比比例例.通通过过设设置置不不同同溶溶剂剂之之间间的的比比例例(梯梯度度)使使流流动动相相的的强强度度、极极性性、pHpH值值或或离离子子强强度度相相应应地地变变化化，达达到到提提高高分分离离效效果，缩短分析时间的目的。果，缩短分析时间的目的。l内内梯梯度度(高高压压梯梯度度):):两两台台高高压压输输液液泵泵，将将两两种种不不同同极极性性的的溶溶剂剂按按一一定定的的比比例例送送入入梯梯度度混合室，混合后进入色谱柱。混合室，混

34、合后进入色谱柱。第47页，此课件共54页哦(3)(3)进样装置进样装置(器器)l流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置进样装置.有手动与自动进样两种有手动与自动进样两种。第48页，此课件共54页哦(4)(4)检测器检测器(装置装置)特点：特点：应用广，对大部分有机化合物有响应应用广，对大部分有机化合物有响应;灵敏度高灵敏度高(10-9g)；线形范围高；线形范围高；A.紫外检测器紫外检测器(Ultraviolet Detector,UVD)原原理理：用用特特定定波波长长的的紫紫外外光光照照射射样样品品池池，通通过过检检测测透透光光率率

35、的的变变化化来来测定样品浓度测定样品浓度.对流动相的流速和温度变对流动相的流速和温度变化不敏感；化不敏感；波长可选，易于操作；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。可用于梯度洗脱。第49页，此课件共54页哦常用紫外吸收检测器常用紫外吸收检测器 l固定波长紫外吸收检测器固定波长紫外吸收检测器 l可变波长紫外吸收检测器可变波长紫外吸收检测器 l光二极管阵列检测器光二极管阵列检测器第50页，此课件共54页哦B.示差折光指数检测器示差折光指数检测器原原理理:监监测测参参比比池池和和测测量量池池中中溶溶液液的的折折射射率率之之差差来来测测量量试试样样浓浓度度,差值与浓度呈正比差值与浓度呈正比.通通用用型型

36、检检测测器器（每每种种物物质质具具有有不不同同的的折折光光指指数数(率率)）；）；灵灵敏敏度度低低(10(10-6-6g)g)、对对温温度度敏敏感感、不不能能用用于于梯梯度度洗脱；洗脱；偏偏转转式式、反反射射式式和和干干涉涉型三种；型三种；第51页，此课件共54页哦示差折光指数检测器示差折光指数检测器第52页，此课件共54页哦C.荧光检测器荧光检测器(Fluorescence Detector,FLD)原原理理：利利用用某某些些溶溶质质在在紫紫外外光光激激发发后后能能发发射射可可见见光光（荧荧光光）的性质检测。的性质检测。激发光激发光(波长波长),),发射光发射光(波长波长););高灵敏度（高

37、灵敏度（1010-12-12g g）、高选择性；）、高选择性；对流量和温度敏感性低。对流量和温度敏感性低。第53页，此课件共54页哦原理：监测溶液的原理：监测溶液的电导率变化电导率变化的检测器。的检测器。特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相的组成变化有明显响应、灵敏度高的组成变化有明显响应、灵敏度高(10(10-12-12 g g）。适）。适用于离子型化合物用于离子型化合物,如单胺类神经递质如单胺类神经递质.D.电化学检测器电化学检测器(Electrical chemistry detector or Electron Capture Detector,ECD)电导仪电导仪电极电极电极电极第54页，此课件共54页哦