红细胞检验的基本方法精选PPT.ppt

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1、关于红细胞检验的基本方法第1页，讲稿共42张，创作于星期二 一、一、SI(serum iron)SI(serum iron)的测定的测定1.1.原理原理SF SF PHPH+还原剂还原剂 FeFe2+2+显色剂显色剂络合物络合物成年男性成年男性11.611.631.3mol31.3molL L 成年女性成年女性9.09.030.4mol30.4molL L降低：见于缺铁性贫血（降低：见于缺铁性贫血（IDAIDA）、慢性失血和）、慢性失血和 感染等。感染等。增高：见于肝疾病、铁粒幼细胞贫血、慢性增高：见于肝疾病、铁粒幼细胞贫血、慢性 溶血和反复输血等。溶血和反复输血等。第2页，讲稿共42张，创作

2、于星期二二、二、SF(serum ferritin)SF(serum ferritin)的测定的测定（125125I I标记标记SF+SF+待测血待测血SFSF）+定量抗定量抗体体 125125I I复合物复合物1+1+复合物复合物2 2125125I I标记标记SF+SF+定量抗体定量抗体 125125I I复合物复合物3 32 2、参考值：、参考值：成人男性成人男性1515200g200gL L，女性女性1212150g150gL,L,小儿低于成人；小儿低于成人；3 3、临床评价：、临床评价：降低：见于降低：见于IDAIDA早期、失血、慢性贫血等。早期、失血、慢性贫血等。增高：见于肝疾病、

3、血色病、急性感染和恶增高：见于肝疾病、血色病、急性感染和恶 性肿瘤等。性肿瘤等。第3页，讲稿共42张，创作于星期二 三、三、TIBCTIBC测定测定1.1.过量铁标准液过量铁标准液+血清血清SFSF2.SF 2.SF PHPH+还原剂还原剂FeFe2+2+显色剂显色剂有色络合物有色络合物TIBCTIBC：男性：男性505077mol77molL L 女性女性54 54 77mol77molL LUIBCUIBC：25.125.151.9mol51.9molL L 增高：见于增高：见于IDAIDA和红细胞增多症等。和红细胞增多症等。降低或正常：见于肝疾病、恶性肿瘤、溶降低或正常：见于肝疾病、恶性

4、肿瘤、溶 血性贫血、慢性感染和肾病综合征等。血性贫血、慢性感染和肾病综合征等。第4页，讲稿共42张，创作于星期二四、铁吸收率测定四、铁吸收率测定当体内缺铁时，铁蛋白的利用加快，肠道对铁吸收也增加。口服放当体内缺铁时，铁蛋白的利用加快，肠道对铁吸收也增加。口服放射性射性5959FeFe，测定体内，测定体内5959Fe Fe 放射性量比率的变化，可推算出铁放射性量比率的变化，可推算出铁吸收率。吸收率。正常值正常值:26.0:26.035.035.0增加：见于增加：见于IDAIDA，可高达，可高达50508080。降低：见于肠道吸收不良综合征。降低：见于肠道吸收不良综合征。正常：见于正常人、再障、巨

5、幼细胞贫血、正常：见于正常人、再障、巨幼细胞贫血、急性失血等。急性失血等。第5页，讲稿共42张，创作于星期二五、血清转铁蛋白测定五、血清转铁蛋白测定免疫散射比浊法：利用抗人转铁蛋白血清与免疫散射比浊法：利用抗人转铁蛋白血清与待检测的转铁蛋白结合形成抗原抗体复合物，待检测的转铁蛋白结合形成抗原抗体复合物，其光吸收和散射浊度增加，与标准曲线比较，其光吸收和散射浊度增加，与标准曲线比较，可计算出转铁蛋白含量。可计算出转铁蛋白含量。免疫散射比浊法为免疫散射比浊法为28.628.651.9mol51.9molL L。增高：见于增高：见于IDAIDA和妊娠。和妊娠。降低：常见于肾病综合征、肝硬化、恶性肿降

6、低：常见于肾病综合征、肝硬化、恶性肿 瘤、炎症等。瘤、炎症等。第6页，讲稿共42张，创作于星期二六、血清转铁蛋白受体测定六、血清转铁蛋白受体测定双抗体夹心法。双抗体夹心法。1.1.血清中转铁蛋白受体血清中转铁蛋白受体+抗体抗体2.2.抗原抗体复合物抗原抗体复合物+酶抗体；酶抗体；3.3.加入底物和显色剂，其颜色的深浅与转铁蛋白受体的量成正加入底物和显色剂，其颜色的深浅与转铁蛋白受体的量成正比。以不同浓度标准品的吸光度值绘制标准曲线，比。以不同浓度标准品的吸光度值绘制标准曲线，通过标准曲线查出未知标本的转铁蛋白受体通过标准曲线查出未知标本的转铁蛋白受体水平。水平。升高：常见于缺铁性贫血和溶血性贫

7、血。升高：常见于缺铁性贫血和溶血性贫血。降低：见于再障、慢性病贫血、肾功能衰竭等。降低：见于再障、慢性病贫血、肾功能衰竭等。用于临床观察骨髓增生状况和治疗反应。用于临床观察骨髓增生状况和治疗反应。第7页，讲稿共42张，创作于星期二小低贫的初步诊断1.HGB（g/L）男性120 女性1102.HCT 0.35 男性0.40 女性3.RBC（1012/L）男性4.0 女性3.5 4.MCV(fl)80 fl=10-15L5.MCH(pg)27 pg=10 12g6.MCHC 0.32第8页，讲稿共42张，创作于星期二血清铁指标检验的应用 小细胞低色素性贫血的鉴别小细胞低色素性贫血的鉴别 铁铁 总铁

8、结合力总铁结合力 铁饱和度铁饱和度 铁蛋白铁蛋白缺铁贫缺铁贫 减低减低 增高增高 减低减低 减低减低地贫地贫 正常正常 正常正常 正常正常 正正/高高慢感贫慢感贫 减低减低 正正/低低 减低减低 增高增高铁粒贫铁粒贫 增高增高 减低减低 增高增高 增高增高第9页，讲稿共42张，创作于星期二一、血清和红细胞叶酸测定一、血清和红细胞叶酸测定叶酸测定（叶酸测定（measurement of folacin）RIARIA，核素核素+叶酸叶酸放射碘叶酸化合物。放射碘叶酸化合物。血清叶酸：成年男性血清叶酸：成年男性8.618.6123.8nmol23.8nmolL L 叶酸减低：巨幼细胞贫血，红细胞过度增

9、生叶酸减低：巨幼细胞贫血，红细胞过度增生 （如溶贫、骨髓增生性疾病等）。（如溶贫、骨髓增生性疾病等）。女性女性7.937.9320.4nmol20.4nmolL L红细胞与血清中的叶酸浓度相红细胞与血清中的叶酸浓度相差几十倍，当差几十倍，当未发生巨幼细胞贫血时，红细胞叶酸测定对未发生巨幼细胞贫血时，红细胞叶酸测定对判断叶酸缺乏尤其有价值。判断叶酸缺乏尤其有价值。红细胞叶酸：成人红细胞叶酸：成人3403401020nmol1020nmolL L红细胞红细胞第二节第二节 叶酸和维生素叶酸和维生素B12 B12 的检验的检验第10页，讲稿共42张，创作于星期二二、血清维生素二、血清维生素B B121

10、2测定测定RIARIA法，用抗氧化剂和氰化钾在碱性环法，用抗氧化剂和氰化钾在碱性环境下（境下（pHpH1212）,将人血清中的维生素将人血清中的维生素B B1212从载体蛋白中释放出来。加入从载体蛋白中释放出来。加入5757Co Co 标记的维生素标记的维生素B B1212,与固定在微晶纤维颗粒上纯化的维生素与固定在微晶纤维颗粒上纯化的维生素B B1212结合物竞争结合，检测其放射活性，其量与受检血清的维生素结合物竞争结合，检测其放射活性，其量与受检血清的维生素B B1212含量成反比，与标准管作对照，换算出维生素含量成反比，与标准管作对照，换算出维生素B B1212含量。含量。成人成人148

11、148660pmol660pmolL L降低：巨幼细胞贫血。降低：巨幼细胞贫血。增高：白血病患者增高：白血病患者 真性红细胞增多症真性红细胞增多症 恶性肿瘤和肝细胞损伤恶性肿瘤和肝细胞损伤第11页，讲稿共42张，创作于星期二四、血清内因子阻断抗体测定四、血清内因子阻断抗体测定用用5757CoCo标记的维生素标记的维生素B12B12与血清中的内因子结与血清中的内因子结合，形成合，形成5757CoCo标记的维生素标记的维生素B12B12内因子复合内因子复合物；当存在内因子抗体时物；当存在内因子抗体时,形成的复合物的形成的复合物的量减少。检测其放射活性，与阳性对照管进量减少。检测其放射活性，与阳性对

12、照管进行比较，可得知内因子抗体的存在。阴性：正常人，行比较，可得知内因子抗体的存在。阴性：正常人，比值比值1.000.101.000.10阳性：比值阳性：比值阳性对照血清比值阳性对照血清比值0.100.10内因子内因子阻断抗体阳性：多见于由维生素阻断抗体阳性：多见于由维生素B12 B12 缺乏引缺乏引起的巨幼细胞贫血、恶性贫血等。起的巨幼细胞贫血、恶性贫血等。第12页，讲稿共42张，创作于星期二红细胞寿命测定（红细胞寿命测定（erythrocyte life span determination）是将放射性核素（）是将放射性核素（5151CrCr）标记）标记的红细胞注入血循环后，逐日观察其消失

13、率，的红细胞注入血循环后，逐日观察其消失率，记录成活曲线，计算出红细胞寿命。记录成活曲线，计算出红细胞寿命。半寿期为半寿期为25253232天天红细胞寿命缩短：红细胞寿命缩短：（1 1）溶血性贫血，约为）溶血性贫血，约为1414天。天。（2 2）再生障碍性贫血，约为）再生障碍性贫血，约为15152929天。天。第三节第三节 溶血的检验溶血的检验第13页，讲稿共42张，创作于星期二四、血浆高铁血红素白蛋白检测四、血浆高铁血红素白蛋白检测高铁血红素白蛋白高铁血红素白蛋白+硫化铵硫化铵 铵血色原铵血色原用光谱仪在绿光区用光谱仪在绿光区558nm 558nm 处有一最佳吸收区带。处有一最佳吸收区带。正

14、常人呈阴性正常人呈阴性血管内溶血时，血浆中游离血红蛋白大量增血管内溶血时，血浆中游离血红蛋白大量增加，血浆中可检测出高铁血红素白蛋白。加，血浆中可检测出高铁血红素白蛋白。第14页，讲稿共42张，创作于星期二1 1、原理、原理 五、五、血清结合珠蛋白(Hp)测定1.待侧血清待侧血清+Hb液液Hp-Hb复合物复合物+未结合未结合Hb。2.电泳分离出电泳分离出Hp-Hb复合物。复合物。电泳法电泳法 0.51.6g/L1.减低：常见于各种溶血，尤其是血管内溶血。排减低：常见于各种溶血，尤其是血管内溶血。排除严重肝病及传单。除严重肝病及传单。2.增高：感染、增高：感染、SLE、创伤、恶肿、妊娠等。、创伤

15、、恶肿、妊娠等。第15页，讲稿共42张，创作于星期二六、尿卟啉检测六、尿卟啉检测尿中卟啉类物质在酸性条件下，尿中卟啉类物质在酸性条件下，经乙醚提取，于经乙醚提取，于405nm405nm处显红色荧光，从而处显红色荧光，从而可对尿卟啉进行定性检测。正常人呈阴性可对尿卟啉进行定性检测。正常人呈阴性增加：先天性红细胞生成性卟啉病、迟发性皮肤增加：先天性红细胞生成性卟啉病、迟发性皮肤型卟啉病、肝红细胞生成型卟啉病等。型卟啉病、肝红细胞生成型卟啉病等。对缺铁性贫血、铅中毒、铁粒幼细胞贫血和对缺铁性贫血、铅中毒、铁粒幼细胞贫血和珠蛋白生成障碍性贫血等的诊断有一定价值。珠蛋白生成障碍性贫血等的诊断有一定价值。

16、第16页，讲稿共42张，创作于星期二 五、尿含铁血黄素试验五、尿含铁血黄素试验又称又称Rous试验。当血红蛋白通过肾滤过试验。当血红蛋白通过肾滤过时，时，部分铁离子以含铁血黄素的形式沉积于上皮部分铁离子以含铁血黄素的形式沉积于上皮细胞，并随尿液排出。尿中含铁血黄素是不细胞，并随尿液排出。尿中含铁血黄素是不稳定的铁蛋白聚合体，其中的高铁离子与亚稳定的铁蛋白聚合体，其中的高铁离子与亚铁氰化钾作用，在酸性环境下产生普鲁士蓝铁氰化钾作用，在酸性环境下产生普鲁士蓝色的亚铁氰化铁沉淀。尿沉渣肾小管细胞内色的亚铁氰化铁沉淀。尿沉渣肾小管细胞内外可见直径外可见直径1 13 3m的蓝色颗粒。的蓝色颗粒。正常人呈

17、阴性正常人呈阴性阳性提示慢性血管内溶血，尿中有铁排出。无论有无血红蛋白尿，只阳性提示慢性血管内溶血，尿中有铁排出。无论有无血红蛋白尿，只要存在慢性血管内溶血如要存在慢性血管内溶血如PNHPNH，本试验结果即呈阳性，并可持续数，本试验结果即呈阳性，并可持续数周。周。溶血初期，虽然有血红蛋白尿，此时本试验可呈阴性反应。溶血初期，虽然有血红蛋白尿，此时本试验可呈阴性反应。第17页，讲稿共42张，创作于星期二 一、红细胞渗透脆性试验一、红细胞渗透脆性试验渗透脆性试验（渗透脆性试验（osmotic fragility test）检测）检测红细胞对不同浓度低渗盐溶液的抵抗力。红细胞在低渗盐溶液中，当水红细

18、胞对不同浓度低渗盐溶液的抵抗力。红细胞在低渗盐溶液中，当水渗透其内部达一定程度时，红细胞发生膨胀破裂。渗透其内部达一定程度时，红细胞发生膨胀破裂。开始溶血：开始溶血：75.275.282.1mmol82.1mmolL L（4.44.44.8g4.8gL L）NaCl NaCl 完全溶血：完全溶血：47.947.954.7mmol54.7mmolL L（2.82.83.2g3.2gL L）NaClNaCl脆性增加：遗传性球形红细胞增多症、椭圆形红细胞增多症和部分自身免脆性增加：遗传性球形红细胞增多症、椭圆形红细胞增多症和部分自身免疫性溶血性贫血。疫性溶血性贫血。脆性降低：珠蛋白生成障碍性贫血、血

19、红蛋白脆性降低：珠蛋白生成障碍性贫血、血红蛋白C C、D D、E E病，低色素性病，低色素性贫血、肝疾病等。贫血、肝疾病等。第四节第四节 红细胞膜缺陷的检验红细胞膜缺陷的检验第18页，讲稿共42张，创作于星期二二、自身溶血试验及其纠正试验二、自身溶血试验及其纠正试验红细胞在红细胞在3737孵育孵育4848小时，其间由于膜异小时，其间由于膜异常引起钠内流倾向明显增加，常引起钠内流倾向明显增加，ATPATP消耗过多；或糖酵解途径酶缺乏所引消耗过多；或糖酵解途径酶缺乏所引起起ATPATP生成不足等原因可导致溶血，称为自身溶血试验。在孵育时，加生成不足等原因可导致溶血，称为自身溶血试验。在孵育时，加入

20、葡萄糖或入葡萄糖或ATPATP作为纠正物，观察溶血可否有一定的纠正，称为纠正试作为纠正物，观察溶血可否有一定的纠正，称为纠正试验。验。正常人红细胞孵育正常人红细胞孵育4848小时小时,不加纠正物的溶血率不加纠正物的溶血率3.53.5，加葡萄糖的溶，加葡萄糖的溶血率血率1.01.0，加，加ATPATP纠正物的溶血率纠正物的溶血率0.80.8。遗传性球形红细胞增多症自身溶血率增加，加入葡萄糖或遗传性球形红细胞增多症自身溶血率增加，加入葡萄糖或ATPATP后明显后明显纠正。纠正。G G6 6PDPD缺乏症等戊糖旁路代谢缺陷的病人自身溶血率增缺乏症等戊糖旁路代谢缺陷的病人自身溶血率增加，能被葡萄糖纠正

21、。加，能被葡萄糖纠正。丙酮酸激酶缺乏症时不能利用葡萄糖产生丙酮酸激酶缺乏症时不能利用葡萄糖产生ATP,ATP,其自身溶血率明显增加，加葡萄糖不能纠正，加其自身溶血率明显增加，加葡萄糖不能纠正，加ATPATP可纠正。可纠正。获得获得性溶血性贫血或自身免疫性溶血时试验结果常各有不同，对诊断意义性溶血性贫血或自身免疫性溶血时试验结果常各有不同，对诊断意义不大。不大。本试验不够敏感和特异，仅对遗传性球形红细胞增多症有较本试验不够敏感和特异，仅对遗传性球形红细胞增多症有较大诊断价值大诊断价值.第19页，讲稿共42张，创作于星期二 三、红细胞膜三磷酸腺苷活性测定三、红细胞膜三磷酸腺苷活性测定NaNaK K

22、ATPATP酶、酶、CaCa2 2MgMg2 2ATPATP酶和酶和MgMg2 2ATP ATP 酶都是红细胞膜上的酶都是红细胞膜上的ATPATP酶。为测定酶的活性可分别测定酶。为测定酶的活性可分别测定酶作用于酶作用于ATPATP的水解产物无机磷含量，若在基质中只加入的水解产物无机磷含量，若在基质中只加入CaCa2 2MgMg2 2ATPATP酶可测定酶可测定CaCa2 2MgMg2 2ATPATP酶的活性，若在基质中加入酶的活性，若在基质中加入NaNa、K K、MgMg2 2和和ATPATP，测定的为，测定的为NaNaK KATPATP酶和酶和MgMg2 2ATPATP酶的共同含量，再在酶的

23、共同含量，再在基质中加入基质中加入NaNaK KATPATP酶的抑制剂，测定结果仅为酶的抑制剂，测定结果仅为MgMg2 2ATPATP酶活性，酶活性，两者的差为两者的差为NaNaK KATPATP酶活性。酶活性。红细胞膜红细胞膜NaNaK KATPATP酶：（酶：（2.930.672.930.67）mUmU10109 9红细胞红细胞CaCa2 2MgMg2 2ATPATP酶：酶：0.40.42.5mol2.5molL L1 1.mg.mg 膜蛋白膜蛋白.h.h1 1遗传性球形红细胞增多症：遗传性球形红细胞增多症：NaNaK KATPATP酶活性增加，酶活性增加，CaCa2 2MgMg2 2AT

24、PATP酶酶活性减低。活性减低。蚕豆病：蚕豆病：CaCa2 2MgMg2 2ATPATP酶活性降低。酶活性降低。许多药物作用于红细胞时，许多药物作用于红细胞时，NaNaK KATPATP酶和酶和CaCa2 2MgMg2 2ATPATP酶活性改变。酶活性改变。第20页，讲稿共42张，创作于星期二四、酸化甘油溶血试验四、酸化甘油溶血试验当甘油存在于低渗溶液氯化钠磷酸缓冲液时，当甘油存在于低渗溶液氯化钠磷酸缓冲液时，可阻止其中的水快速进入红细胞内，使溶血过程缓慢。但甘油与可阻止其中的水快速进入红细胞内，使溶血过程缓慢。但甘油与膜脂质又有亲和性，可使膜脂质减少。当红细胞膜蛋白及膜脂质膜脂质又有亲和性，

25、可使膜脂质减少。当红细胞膜蛋白及膜脂质有缺时，它们在有缺时，它们在pH6.85pH6.85的甘油缓冲液中比正常红细胞溶解速度的甘油缓冲液中比正常红细胞溶解速度快，导致红细胞悬液的吸光度降至快，导致红细胞悬液的吸光度降至5050的时间（的时间（AGLT50AGLT50）明显）明显缩短。正常人缩短。正常人AGLT50AGLT50290s290s遗传性球形红细胞增多症遗传性球形红细胞增多症AGLT50AGLT50明显缩短（明显缩短（2525150s150s）。自身免疫性）。自身免疫性溶血性贫血、肾功能衰竭、妊娠等溶血性贫血、肾功能衰竭、妊娠等AGLT50AGLT50也可缩短。也可缩短。第21页，讲稿

26、共42张，创作于星期二五、高渗冷溶血试验五、高渗冷溶血试验在高渗状态下，温度骤然变化影响红细胞膜脂质的在高渗状态下，温度骤然变化影响红细胞膜脂质的流动性，并可能累及膜磷脂与膜骨架蛋白结合位点，红细胞容易破裂流动性，并可能累及膜磷脂与膜骨架蛋白结合位点，红细胞容易破裂而发生溶血。当膜蛋白缺陷致膜表面积与体积比值降低，溶血率明显而发生溶血。当膜蛋白缺陷致膜表面积与体积比值降低，溶血率明显增加。而膜表面积与体积比值增加，溶血率降低。高渗冷溶血试验增加。而膜表面积与体积比值增加，溶血率降低。高渗冷溶血试验（hyperosmotic cold hemolysis testhyperosmotic col

27、d hemolysis test）即测定红细胞在不同）即测定红细胞在不同浓度的高渗缓冲液中，从浓度的高渗缓冲液中，从3737水浴立即置于水浴立即置于00水浴一定时间的最水浴一定时间的最大溶血率。大溶血率。9mmol9mmolL L或或12mmol12mmolL L蔗糖蔗糖 最大溶血率最大溶血率66.566.574.174.17mmol7mmolL L蔗糖蔗糖 大溶血率大溶血率0.10.116.916.9遗传性球形红细胞增多症明显增加。遗传性球形红细胞增多症明显增加。珠蛋白生成障碍性贫血和异常血红蛋白病明显降低。珠蛋白生成障碍性贫血和异常血红蛋白病明显降低。自身免疫性溶血性贫血基本正常。自身免疫

28、性溶血性贫血基本正常。2 2、参考值：、参考值：第22页，讲稿共42张，创作于星期二 六、红细胞膜蛋白电泳分析六、红细胞膜蛋白电泳分析将制备的红细胞膜样品进行将制备的红细胞膜样品进行SDSSDSPAGE(SDS-PAGE(SDS-聚聚丙烯酰胺凝胶丙烯酰胺凝胶)电泳，根据样品中各蛋白相对分子质量的不同，分离得到红细电泳，根据样品中各蛋白相对分子质量的不同，分离得到红细胞膜蛋白的电泳图谱，从而可见各膜蛋白组分百分率。胞膜蛋白的电泳图谱，从而可见各膜蛋白组分百分率。各种膜蛋白组分百分率变化较大，多以正常红细胞膜蛋白电泳图谱作比各种膜蛋白组分百分率变化较大，多以正常红细胞膜蛋白电泳图谱作比较；或以带较

29、；或以带3 3蛋白为基准，各膜蛋白含量以与带蛋白为基准，各膜蛋白含量以与带3 3蛋白的比例表示。蛋白的比例表示。许多溶血性疾病常见红细胞膜蛋白异常。各种膜缺陷疾病如遗传性球形红许多溶血性疾病常见红细胞膜蛋白异常。各种膜缺陷疾病如遗传性球形红细胞增多症有收缩蛋白等含量减低或结构异常。某些血红蛋白病骨架蛋白细胞增多症有收缩蛋白等含量减低或结构异常。某些血红蛋白病骨架蛋白等可明显异常。等可明显异常。第23页，讲稿共42张，创作于星期二一、高铁血红蛋白还原试验一、高铁血红蛋白还原试验在血液中加入亚硝酸盐使红细胞中的亚铁在血液中加入亚硝酸盐使红细胞中的亚铁血红蛋白变成高铁血红蛋白，正常红细胞的血红蛋白变

30、成高铁血红蛋白，正常红细胞的G G6 6PDPD催化戊糖旁路催化戊糖旁路使使NADPNADP变成变成NADPHNADPH，其脱的氢通过亚甲蓝试剂的递氢作用而使高铁血，其脱的氢通过亚甲蓝试剂的递氢作用而使高铁血红蛋白（红蛋白（FeFe3 3）还原成亚铁血红蛋白（）还原成亚铁血红蛋白（FeFe2 2），通过比色可观察还原的），通过比色可观察还原的多少。当多少。当G G6 6PDPD缺乏时，高铁血红蛋白还原率下降。缺乏时，高铁血红蛋白还原率下降。正常人高铁血红蛋白还原率正常人高铁血红蛋白还原率7575（脐带血（脐带血77 77）G G6 6PDPD缺乏时，高铁血红蛋白还原率下降。缺乏时，高铁血红蛋白

31、还原率下降。中间缺乏（杂合子）为中间缺乏（杂合子）为31317474，严重缺，严重缺乏（半合子或纯合子）乏（半合子或纯合子）3030。第五节第五节 红细胞酶缺陷的检验红细胞酶缺陷的检验第24页，讲稿共42张，创作于星期二二、变性珠蛋白小体生成试验二、变性珠蛋白小体生成试验G G6 6PDPD缺乏的病人血样加入乙酰苯肼缺乏的病人血样加入乙酰苯肼于于37 37 孵孵2 24 4小时，用煌焦油蓝染色观察红细胞中珠蛋白小时，用煌焦油蓝染色观察红细胞中珠蛋白小体的生成情况，计算含小体的生成情况，计算含5 5个及以上珠蛋白小体的红细胞的百个及以上珠蛋白小体的红细胞的百分率。正常人含分率。正常人含5 5个及

32、以上珠蛋白小体的红细胞，一般个及以上珠蛋白小体的红细胞，一般3030。G G6 6PDPD缺乏症常高于缺乏症常高于4545，故可作为，故可作为G G6 6PDPD缺乏的筛检试验。缺乏的筛检试验。但还原型谷胱甘肽缺乏症也增高；不稳定血红蛋白病含小体的但还原型谷胱甘肽缺乏症也增高；不稳定血红蛋白病含小体的细胞百分率为细胞百分率为75758484，HbHHbH病和化学物质中毒时也增高。病和化学物质中毒时也增高。第25页，讲稿共42张，创作于星期二三、葡萄糖三、葡萄糖-6-6-磷酸脱氢酶荧光斑点试磷酸脱氢酶荧光斑点试 验和活性测定验和活性测定在在G-6-PDG-6-PD和和NADPNADP存在下，存在

33、下，G-6-PDG-6-PD能使能使NADPNADP还原成还原成NADPHNADPH，后者在，后者在紫外线照射下会发出荧光。紫外线照射下会发出荧光。NADPHNADPH的吸收峰在波长的吸收峰在波长340nm340nm处，可处，可通过单位时间生成的通过单位时间生成的NADPHNADPH的量来测定的量来测定G-6-PDG-6-PD活性。活性。正常人有很强的荧光正常人有很强的荧光。G-6-PDG-6-PD缺陷者荧光很弱或无荧光；杂合缺陷者荧光很弱或无荧光；杂合子或某些子或某些G-6-PDG-6-PD变异者则可能有轻到中度荧光。正常人酶活性变异者则可能有轻到中度荧光。正常人酶活性为（为（12.12.0

34、912.12.09）U/gHbU/gHb。第26页，讲稿共42张，创作于星期二四、丙酮酸激酶荧光斑点试验和活性测定四、丙酮酸激酶荧光斑点试验和活性测定在二磷酸腺苷（在二磷酸腺苷（ADPADP）存在）存在的条件下丙酮酸激酶（的条件下丙酮酸激酶（pyruvate kinase pyruvate kinase，PKPK）催化磷酸烯醇丙酮）催化磷酸烯醇丙酮酸（酸（PEPPEP）转化成丙酮酸，在辅酶）转化成丙酮酸，在辅酶还原型（还原型（NADHNADH）存在的情况）存在的情况下丙酮酸被下丙酮酸被LDH LDH 转化为乳酸，若标记荧光于转化为乳酸，若标记荧光于NADHNADH上，此时有荧光的上，此时有荧光

35、的NADHNADH变为无荧光的变为无荧光的NADNAD。正常人丙酮酸激酶活性斑点在正常人丙酮酸激酶活性斑点在2525分钟内消失。分钟内消失。酶活性（酶活性（15.01.9915.01.99）U UgHb gHb。荧光斑点不消失或时间延长。荧光斑点不消失或时间延长说明丙酮酸激酶活性缺乏，中间缺乏（杂合子）时，荧光说明丙酮酸激酶活性缺乏，中间缺乏（杂合子）时，荧光25256060分钟消失，严重缺乏（纯合子）时，荧光分钟消失，严重缺乏（纯合子）时，荧光6060分钟不消失。分钟不消失。第27页，讲稿共42张，创作于星期二 五、谷胱甘肽还原酶缺陷检测五、谷胱甘肽还原酶缺陷检测谷胱甘肽还原酶（谷胱甘肽还原

36、酶（GRGR）催化反应中）催化反应中NADPHNADPH转变为转变为NADPNADP，荧光消失，通过在，荧光消失，通过在365nm365nm处观察荧光斑点消处观察荧光斑点消失的时间（失的时间（GRGR荧光斑点试验）反映谷胱甘肽还原酶的活性，或直荧光斑点试验）反映谷胱甘肽还原酶的活性，或直接测定吸光度的变化（接测定吸光度的变化（GRGR活性定量试验）计算活性定量试验）计算GRGR的活性的活性。GRGR荧光斑荧光斑点试验：正常人荧光斑点点试验：正常人荧光斑点15min15min内消失内消失GRGR活性定量：（活性定量：（7.171.097.171.09）U UgHbgHb谷胱甘肽还原酶缺乏时，谷胱

37、甘肽还原酶缺乏时，GRGR荧光斑点试验荧光斑点试验15 15 分钟以后还有荧光存在，分钟以后还有荧光存在，GRGR活性定量试验活活性定量试验活性低于性低于7.17U7.17UgHb gHb。第28页，讲稿共42张，创作于星期二一、红细胞包涵体试验一、红细胞包涵体试验红细胞包涵体试验（红细胞包涵体试验（Heinzbody forming test）是将煌焦油蓝液与新鲜血液一起孵育，不稳定是将煌焦油蓝液与新鲜血液一起孵育，不稳定血红蛋白易变性沉淀形成包涵体。血红蛋白易变性沉淀形成包涵体。正常人（正常人（1 1）不稳定血红蛋白病：孵育不稳定血红蛋白病：孵育1 13 3小时多数红细胞内可出现变性珠蛋白

38、肽小时多数红细胞内可出现变性珠蛋白肽链沉淀形成的包涵体。链沉淀形成的包涵体。G G6 6PDPD缺乏或红细胞还原酶缺乏及化学物缺乏或红细胞还原酶缺乏及化学物质中毒等，红细胞中也可出现包涵体。质中毒等，红细胞中也可出现包涵体。HbHHbH病：孵育病：孵育1 1小时就可出现包涵体，也叫小时就可出现包涵体，也叫HbHHbH包涵体。包涵体。第六节第六节 血红蛋白异常的检验血红蛋白异常的检验第29页，讲稿共42张，创作于星期二1 1、原理：、原理：二、血红蛋白电泳检测二、血红蛋白电泳检测血红蛋白电泳（血红蛋白电泳（hemoglobin electrophoresis）是根据不同的血红蛋白所带是根据不同的

39、血红蛋白所带电荷不同、相对分子质量不同，其泳动方向和速度不同，经一定电压电荷不同、相对分子质量不同，其泳动方向和速度不同，经一定电压和时间的电泳，可分离出各自的区带，同时对电泳出的各区带进行电和时间的电泳，可分离出各自的区带，同时对电泳出的各区带进行电泳扫描，可进行各种血红蛋白的定量分析。泳扫描，可进行各种血红蛋白的定量分析。第30页，讲稿共42张，创作于星期二2 2、参考值：、参考值：（1 1）pH8.6TEBpH8.6TEB缓冲液醋酸纤维膜电泳。正常血红蛋白电泳区带：缓冲液醋酸纤维膜电泳。正常血红蛋白电泳区带：HbAHbA9595、HbFHbF2 2、HbAHbA2 2为为1.01.03.

40、13.1。通过与正常人的血红蛋白电泳图谱进行比较，可发现异常血红蛋通过与正常人的血红蛋白电泳图谱进行比较，可发现异常血红蛋白区带。如白区带。如HbHHbH、HbEHbE、HbBatrsHbBatrs、HbSHbS、HbDHbD和和HbCHbC等异常血红蛋白异等异常血红蛋白异常。常。HbAHbA2 2增多，见于增多，见于珠蛋白生成障碍性贫血，为杂合子的重要实验室诊断指珠蛋白生成障碍性贫血，为杂合子的重要实验室诊断指标。标。HbEHbE病时也在病时也在HbAHbA2 2区带位置处增加，但含量很大（在区带位置处增加，但含量很大（在1010以上）。以上）。HbAHbA2 2轻度增加亦可见于肝病、肿瘤和

41、某些血液病。轻度增加亦可见于肝病、肿瘤和某些血液病。第31页，讲稿共42张，创作于星期二三、抗碱血红蛋白检测三、抗碱血红蛋白检测将待检的溶血液与一定量的将待检的溶血液与一定量的NaOHNaOH溶液混合，作用溶液混合，作用1 1分分钟后加入半饱和硫酸铵中止碱变性反应。胎儿血红蛋白（钟后加入半饱和硫酸铵中止碱变性反应。胎儿血红蛋白（HbFHbF）抗碱）抗碱变性作用强，没有变性存在于上清液中，变性作用强，没有变性存在于上清液中，HbAHbA变性沉淀，取上清液变性沉淀，取上清液于于540nm540nm处测定吸光度，检测出处测定吸光度，检测出HbFHbF的浓度。此试验也称为碱变性试验，的浓度。此试验也称

42、为碱变性试验，成人成人2 2；新生儿；新生儿4040HbFHbF绝对增多：珠蛋白生成障碍性贫血，重型者达绝对增多：珠蛋白生成障碍性贫血，重型者达30309090，中，中间型常为间型常为5 53030，轻型小于，轻型小于5 5。遗传性胎儿血红蛋白持续综合。遗传性胎儿血红蛋白持续综合征患者，可高达征患者，可高达100100。HbFHbF相对增多可见于骨髓纤维化、白血病、浆细胞瘤等恶性疾病及再相对增多可见于骨髓纤维化、白血病、浆细胞瘤等恶性疾病及再生障碍性贫血、生障碍性贫血、PNHPNH、卟啉病等。、卟啉病等。HbFHbF生理性增多见于孕妇和新生儿。生理性增多见于孕妇和新生儿。第32页，讲稿共42张

43、，创作于星期二 四、四、HbFHbF酸洗脱法检测酸洗脱法检测HbFHbF具有抗碱和抗酸作用，其抗酸能力比具有抗碱和抗酸作用，其抗酸能力比HbAHbA强。将强。将血涂片于酸性缓冲液中孵育，含血涂片于酸性缓冲液中孵育，含HbFHbF的红细胞不被酸洗脱，可被伊红染的红细胞不被酸洗脱，可被伊红染成红色，而含成红色，而含HbAHbA的红细胞均被酸洗脱，不能被伊红着色。正常血的红细胞均被酸洗脱，不能被伊红着色。正常血片中含片中含HbFHbF的着色红细胞：成人的着色红细胞：成人0.010.01（1 1）新生儿）新生儿0.550.550.850.85（55558585）以后渐渐下降，）以后渐渐下降，2 2岁后

44、幼儿岁后幼儿0.020.02（2 2）孕妇可有）孕妇可有轻度增加。着色细胞增加：珠蛋白合成障碍性贫血重型患者大多数红轻度增加。着色细胞增加：珠蛋白合成障碍性贫血重型患者大多数红细胞染成红色；轻型患者可见少数染成红色的细胞；遗传性胎儿血红细胞染成红色；轻型患者可见少数染成红色的细胞；遗传性胎儿血红蛋白持续综合征红细胞均为红色蛋白持续综合征红细胞均为红色。第33页，讲稿共42张，创作于星期二五、异丙醇沉淀试验五、异丙醇沉淀试验不稳定血红蛋白较正常血红蛋白更容易裂解，在不稳定血红蛋白较正常血红蛋白更容易裂解，在异丙醇这种能降低血红蛋白分子内部氢键的非极性溶剂中，不稳定异丙醇这种能降低血红蛋白分子内部

45、氢键的非极性溶剂中，不稳定血红蛋白更快地沉淀。通过观察血红蛋白液在异丙醇中的沉淀现象血红蛋白更快地沉淀。通过观察血红蛋白液在异丙醇中的沉淀现象对不稳定血红蛋白进行筛检。正常人血红蛋白液为阴性（对不稳定血红蛋白进行筛检。正常人血红蛋白液为阴性（3030分钟内分钟内不沉淀）不沉淀）不稳定血红蛋白存在时，常于不稳定血红蛋白存在时，常于5 5分钟时出现沉淀，分钟时出现沉淀，2020分钟开始出现绒毛状分钟开始出现绒毛状沉淀。血液中含有较多沉淀。血液中含有较多HbFHbF、HbHHbH、HbEHbE时也可出现阳性结果。时也可出现阳性结果。第34页，讲稿共42张，创作于星期二六、热变性试验六、热变性试验热变

46、性试验（热变性试验（heat instability test）是根据不稳定血）是根据不稳定血红蛋白比正常血红蛋白更容易遇热变性，观察血红蛋白液在红蛋白比正常血红蛋白更容易遇热变性，观察血红蛋白液在5050时是否出现沉淀，对不稳定血红蛋白进行筛检。时是否出现沉淀，对不稳定血红蛋白进行筛检。正常人热沉淀的血红蛋白正常人热沉淀的血红蛋白1 1血红蛋白沉淀率增加，说明不稳定血红蛋白存在。血红蛋白沉淀率增加，说明不稳定血红蛋白存在。第35页，讲稿共42张，创作于星期二七、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测七、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测尿素或对氯汞苯甲酸能破坏血红蛋白尿素或对氯汞苯甲酸能破坏血红蛋白的空间的空间结构，血

47、红蛋白的珠蛋白可被裂解成肽链亚结构，血红蛋白的珠蛋白可被裂解成肽链亚单位，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离出各单位，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离出各肽链区带。正常血红蛋白肽链区带。正常血红蛋白HbAHbA裂解后出现裂解后出现、HbAHbA、HbA2HbA2和和四条带。四条带。本试验若有异常血红蛋白肽链的区带出现，本试验若有异常血红蛋白肽链的区带出现，表示有异常血红蛋白存在。对珠蛋白生成障表示有异常血红蛋白存在。对珠蛋白生成障碍性贫血的诊断和鉴别有参考价值。碍性贫血的诊断和鉴别有参考价值。第36页，讲稿共42张，创作于星期二2 2、参考值：、参考值：正常人：阴性正常人：阴性一、酸化血清溶血试验一、酸

48、化血清溶血试验酸化血清溶血试验，也称酸化血清溶血试验，也称Hams test ，即红细，即红细胞在酸性（胞在酸性（pH6.4pH6.46.56.5）的正常血清中孵育，）的正常血清中孵育，补体被激活，补体被激活，PNHPNH红细胞破坏而产生溶血。而红细胞破坏而产生溶血。而正常红细胞不被溶解，无溶血现象。本试验阳性主要见于正常红细胞不被溶解，无溶血现象。本试验阳性主要见于PNHPNH，某些，某些自身免疫性血性贫血发作严重时可呈阳性。自身免疫性血性贫血发作严重时可呈阳性。第七节第七节 PNHPNH的检验的检验第37页，讲稿共42张，创作于星期二1 1、原理：、原理：二、蔗糖溶血试验二、蔗糖溶血试验蔗

49、糖溶血试验（蔗糖溶血试验（sucrose hemolysis test）是根据）是根据PNHPNH患者的红细胞患者的红细胞,在低在低离子强度的蔗糖溶液中对补体敏感性增强，经孵育，补体与红细胞离子强度的蔗糖溶液中对补体敏感性增强，经孵育，补体与红细胞膜结合加强，蔗糖溶液进入红细胞内，导致渗透性溶血而设计的。膜结合加强，蔗糖溶液进入红细胞内，导致渗透性溶血而设计的。定性试验：正常为阴性定性试验：正常为阴性定量试验：正常溶血率定量试验：正常溶血率5 5阳性或溶血率增加：阳性或溶血率增加：PNHPNH患者（可作为患者（可作为PNHPNH的筛选试验）；自身免的筛选试验）；自身免疫性溶血性贫血。疫性溶血性

50、贫血。假阳性：白血病、骨髓硬化。假阳性：白血病、骨髓硬化。第38页，讲稿共42张，创作于星期二三、蛇素毒因子溶血试验三、蛇素毒因子溶血试验蛇毒因子溶血试验（蛇毒因子溶血试验（venom hemolysis test）采）采用从眼镜蛇毒中提取的一种蛇毒因子（用从眼镜蛇毒中提取的一种蛇毒因子（C3bC3b），），通过旁路途径激活补体，通过旁路途径激活补体，PNHPNH患者的红细胞补体患者的红细胞补体系统激活后，促使系统激活后，促使PNHPNH补体敏感细胞破坏、溶血。正常人溶血率补体敏感细胞破坏、溶血。正常人溶血率5 5溶血率增加，溶血率增加，PNHPNH的可能性大，可反映的可能性大，可反映PNH