流式细胞术实验技巧及数据分析精选PPT.ppt

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1、关于流式细胞术实验技巧及数据分析第1页，讲稿共52张，创作于星期二BDBD公司不同型号流式细胞仪公司不同型号流式细胞仪FACSCaliburLSRIIFACSAriaFACSCountFACSVantage&DiVaFACSCanto第2页，讲稿共52张，创作于星期二一一 流式细胞仪的基本原理流式细胞仪的基本原理 *稳定流动稳定流动 *激发光斑激发光斑 *荧光补偿荧光补偿 *荧光素选择荧光素选择二二 数据分析及开窗数据分析及开窗第3页，讲稿共52张，创作于星期二FCMFCM原理示意图原理示意图第4页，讲稿共52张，创作于星期二 层流是液体稳定流动的必要条件层流是液体稳定流动的必要条件,管道中层

2、流管道中层流 的的形成要满足雷诺数形成要满足雷诺数 dV Re=2300，式中式中、分别为液体的密度和粘滞系数，分别为液体的密度和粘滞系数，d d和和V V分别为管道的直径和液体的平均流速。分别为管道的直径和液体的平均流速。FCMFCM利用层利用层流技术流技术,使细胞流动稳定使细胞流动稳定,并具有自聚焦作用并具有自聚焦作用,为细胞为细胞分析分选提供技术保证分析分选提供技术保证.层流技术层流技术第5页，讲稿共52张，创作于星期二液流驱动系统液流驱动系统（示意图）（示意图）流速与压力的关系服从流速与压力的关系服从BernoulliBernoulli方程，即方程，即 P=(1/2)P=(1/2)V

3、V2 2 (忽略高度的变化忽略高度的变化)。改变气压。改变气压,就可获得不同的流速。就可获得不同的流速。第6页，讲稿共52张，创作于星期二第7页，讲稿共52张，创作于星期二 低速低速 高速高速不同样本速率形成的样本流不同样本速率形成的样本流第8页，讲稿共52张，创作于星期二激发光源与光束成形系统激发光源与光束成形系统第9页，讲稿共52张，创作于星期二.20um64um32um 0 32um聚焦距离聚焦距离激光束激光束聚焦透镜聚焦透镜强度强度光光束束成成形形与与细细胞胞受受照照方方式式这种椭圆形光这种椭圆形光斑的检测区保斑的检测区保证每个细胞分证每个细胞分别受到光照且别受到光照且受检时受到一受检

4、时受到一致的光照致的光照 FCMFCM的单细胞的单细胞照明技术照明技术第10页，讲稿共52张，创作于星期二第11页，讲稿共52张，创作于星期二荧荧光光光光谱谱重重叠叠 FITCFITC和和PEPE荧光光谱重叠荧光光谱重叠第12页，讲稿共52张，创作于星期二Uncompensated vs CompensatedFL1FL2 利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的信号加以扣除的方法称荧光通道的信号加以扣除的方法称“荧光补偿荧光补偿”荧荧光光补补偿偿第13页，讲稿共52张，创作于星期二荧光补偿荧光补偿第14页，讲稿共52张，创作于星期二MeanM

5、ean值判断补偿值判断补偿第15页，讲稿共52张，创作于星期二双或多参数荧光抗体的组合标记双或多参数荧光抗体的组合标记FITC+PE 488 525、575 绿色、橙色绿色、橙色FITC+T red 488 525 绿色绿色 568 615 红色红色FITC+PeCy5 488 525、675 绿色、绿色、红色红色FITC+ECD 488 525、625 绿色、橙红色绿色、橙红色F+P+PeCy5 488 525、575、675 绿、橙、绿、橙、红色红色F+ECD+PeCy5 488 525、575、675 绿、橙红色、绿、橙红色、红色红色F+P+PeCy5+APC 488 525、575 绿

6、色、橙色绿色、橙色 633 670 红色红色 荧光染料荧光染料 激发波长（激发波长（nm)nm)发射波长（发射波长（nm)nm)颜色颜色第16页，讲稿共52张，创作于星期二 用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在起，在488nm488nm波长激发光激发后产生的发射波长波长激发光激发后产生的发射波长激发另一荧光染料产生的荧光信号。激发另一荧光染料产生的荧光信号。LaserLaserCY7755PEECD620CY5670488nm488nm能量传递染料：能量传递染料：第17页，讲稿共52张，创作于星期二流式细胞术操作流程流式细胞术操作流程：培养细胞

7、培养细胞新鲜组织新鲜组织石蜡包埋石蜡包埋单细胞悬液单细胞悬液制备制备荧光抗体标记荧光抗体标记上机检测上机检测表型测定表型测定细胞分选细胞分选继继续续培培养养FISHPCR统统计计学学分分析析第18页，讲稿共52张，创作于星期二单单分分散散细细胞胞第19页，讲稿共52张，创作于星期二FSCFSCFSC信号的强弱与细胞的大小和活力相关信号的强弱与细胞的大小和活力相关第20页，讲稿共52张，创作于星期二SSCSSCSSC信号的强弱与细胞内颗粒多少相关信号的强弱与细胞内颗粒多少相关第21页，讲稿共52张，创作于星期二细胞散色光信号细胞散色光信号第22页，讲稿共52张，创作于星期二细胞荧光测量细胞荧光测

8、量细胞的自发荧光细胞的自发荧光 未经染色的样品细胞未经染色的样品细胞 在激发光的照射下可测到有微弱的荧在激发光的照射下可测到有微弱的荧 光信号光信号.细胞的特异性荧光细胞的特异性荧光 经过各种特异染色的经过各种特异染色的 细胞在细胞在激发光的照射下可测到较强的荧光激发光的照射下可测到较强的荧光 信号信号.第23页，讲稿共52张，创作于星期二自发荧光信号与特异染色的荧光信号分析图自发荧光信号与特异染色的荧光信号分析图自自发发荧荧光光信信号号第24页，讲稿共52张，创作于星期二特特异异染染色色的的荧荧光光信信号号第25页，讲稿共52张，创作于星期二DNADNA分析比较分析比较第26页，讲稿共52张

9、，创作于星期二排除双联体细胞排除双联体细胞第27页，讲稿共52张，创作于星期二细胞阻滞在细胞阻滞在G G2 2M M期期第28页，讲稿共52张，创作于星期二双双克克隆隆细细胞胞周周期期分分析析第29页，讲稿共52张，创作于星期二 溴脱氧尿嘧啶核苷溴脱氧尿嘧啶核苷(Bromodeoxyuridine(Bromodeoxyuridine，BrdUrd)BrdUrd)是胸苷的一种类似物。是胸苷的一种类似物。它可以替代它可以替代胸腺嘧啶掺入到细胞新合成的胸腺嘧啶掺入到细胞新合成的DNADNA分子中，成为分子中，成为S S期细胞的一种标记物。流式细胞术采用抗期细胞的一种标记物。流式细胞术采用抗BrdUr

10、dBrdUrd单克隆抗体免疫荧光和单克隆抗体免疫荧光和PIPI双参数检测细胞，不仅双参数检测细胞，不仅可检测一个细胞群体的动力学参数和可检测一个细胞群体的动力学参数和DNADNA含量，同含量，同时可以了解不同细胞的时可以了解不同细胞的DNADNA合成能力高低合成能力高低。BrdUrdBrdUrd和和DNADNA双标记染色双标记染色第30页，讲稿共52张，创作于星期二第31页，讲稿共52张，创作于星期二BrdUrdBrdUrd与与PIPI检测检测第32页，讲稿共52张，创作于星期二BrdUrdBrdUrd与与PIPI检测检测第33页，讲稿共52张，创作于星期二BrdUrdBrdUrd与与PIPI

11、检测检测第34页，讲稿共52张，创作于星期二细细胞胞三三色色荧荧光光检检测测第35页，讲稿共52张，创作于星期二细胞因子测定细胞因子测定*检测检测T T细胞细胞(CD69)(CD69)活化活化第36页，讲稿共52张，创作于星期二G6=R1*R5第37页，讲稿共52张，创作于星期二*CD4CD4抗原分子结构引起抗原分子结构引起CD4CD4荧光强度下调荧光强度下调第38页，讲稿共52张，创作于星期二细胞因子分析图细胞因子分析图*过敏性鼻息肉与鼻息肉细胞因子比较过敏性鼻息肉与鼻息肉细胞因子比较第39页，讲稿共52张，创作于星期二纯化单核细胞纯化单核细胞第40页，讲稿共52张，创作于星期二调节性调节性

12、T T细胞检测细胞检测第41页，讲稿共52张，创作于星期二第42页，讲稿共52张，创作于星期二G3=R1*R3G3=R1*R3G4=R1*R4G4=R1*R4第43页，讲稿共52张，创作于星期二凋亡细胞测定凋亡细胞测定第44页，讲稿共52张，创作于星期二凋亡细胞测定凋亡细胞测定第45页，讲稿共52张，创作于星期二细胞凋亡检测细胞凋亡检测第46页，讲稿共52张，创作于星期二阴性的设置阴性的设置第47页，讲稿共52张，创作于星期二血血小小板板检检测测第48页，讲稿共52张，创作于星期二血血小小板板检检测测第49页，讲稿共52张，创作于星期二血血小小板板检检测测第50页，讲稿共52张，创作于星期二血小板检测血小板检测第51页，讲稿共52张，创作于星期二感感谢谢大大家家观观看看第52页，讲稿共52张，创作于星期二